Summary
We hebben getracht een varkensmodel van hartfalen op te stellen dat werd veroorzaakt door linker slagaderblokkades en snelle pacing om het effect en de veiligheid van intramyocardiale toediening van stamcellen voor celgebaseerde therapieën te testen.
Abstract
Hoewel vooruitgang is geboekt bij de behandeling van hartfalen (HF) na een hartinfarct (MI), blijft HF na MI een van de belangrijkste oorzaken van mortaliteit en morbiditeit over de hele wereld. Celgebaseerde therapieën voor hartherstel en verbetering van de linker ventriculaire functie nadat MI veel aandacht heeft getrokken. Daarom moeten de veiligheid en werkzaamheid van deze celtransplantaties worden getest in een preklinisch groot diermodel van HF voorafgaand aan klinisch gebruik. Varkens worden veel gebruikt voor onderzoek naar hart-en vaatziekten vanwege hun gelijkenis met de mens in termen van hartgrootte en coronaire anatomie. Daarom hebben we geprobeerd om een effectief protocol voor de oprichting van een varkens chronische HF-model met behulp van gesloten borst kransballon occlusie van de linker circumflex slagader (LCX), gevolgd door snelle ventriculaire pacing geïnduceerd met pacemaker implantatie presenteren. Acht weken later werden de stamcellen toegediend door intramyocardiale injectie in het peri-infarctgebied. Vervolgens werden de infarctgrootte, celoverleving en linker ventriculaire functie (inclusief echocardiografie, hemodynamische parameters en elektrofysiologie) geëvalueerd. Deze studie helpt bij het vaststellen van een stabiel preklinisch groot dier HF-model voor stamcelbehandeling.
Introduction
Hart- en vaatziekten, coronaire hartziekten (CAD) in het bijzonder, blijven de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in Hong Kong en wereldwijd1. In Hongkong werd een stijging van 26% van 26% van het aantal CAD-patiënten dat onder de Hospital Authority werd behandeld2. Onder alle CADs is een acuut hartinfarct (MI) een belangrijke doodsoorzaak en daaropvolgende complicaties, zoals hartfalen (HF). Deze dragen bij aan aanzienlijke medische, sociale en financiële lasten. Bij patiënten met MI is trombolytische therapie of primaire percutane coronaire interventie (PCI) een effectieve therapie om het leven te behouden, maar deze therapieën kunnen alleen cardiomyocyte (CM) verlies tijdens MI verminderen. De beschikbare behandelingen zijn niet in staat om het permanente verlies van CMs aan te vullen, wat leidt tot hartfibrose, myocardiale remodellering, hartritmestoornissen en uiteindelijk hartfalen. Het sterftecijfer bij 1-jaars post-MI is ongeveer 7% bij meer dan 20% patiënten die HF3ontwikkelen. Bij hf-patiënten met een eindstadium is harttransplantatie de enige beschikbare effectieve therapie, maar wordt het beperkt door een tekort aan beschikbare organen. Nieuwe therapieën zijn nodig om de ontwikkeling van post-MI HF te keren. Als gevolg hiervan wordt celgebaseerde therapie beschouwd als een aantrekkelijke benadering om de aangetaste CMs en de functie van de verminderde linkerventriënt (LV) in HF na MI te herstellen. Onze vorige studies vonden stamceltransplantatie gunstig zijn voor verbetering van de hartfunctie na directe intramyocardiale transplantatie in kleine diermodellen van MI4,5. Gestandaardiseerde preklinische hf-protocollen van grote dieren zijn dus nodig om de werkzaamheid en veiligheid van stamceltransplantatie voor klinisch gebruik verder te testen.
De afgelopen decennia zijn getuige geweest van het wijdverbreide gebruik van varkens in cardiovasculair onderzoek voor stamceltherapie. HF varkens zijn een veelbelovend model van translationeel onderzoek vanwege hun gelijkenis met de mens in termen van hartgrootte, gewicht, ritme, functie, en kransslagader anatomie. Bovendien kunnen porcine HF-modellen post-MI HF-patiënten nabootsen in termen van CM-metabolisme, elektrofysiologische eigenschappen en neuro-endocriene veranderingen onder ischemische omstandigheden6. Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van een dergelijk gestandaardiseerd varken HF-model, met behulp van een gesloten borst kransballon occlusie van de linker circumflex slagader (LCX) gevolgd door snelle pacing veroorzaakt door pacemaker implantatie. De studie optimaliseert ook de route van intramyocardiale toediening van stamcellen voor de behandeling van post-MI HF. Het doel is om een varkensdiermodel van chronisch hartinfarct te produceren dat kan worden gebruikt om behandelingen te ontwikkelen die klinisch relevant zijn voor patiënten met ernstige CAD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de Amerikaanse National Institutes of Health and Regulations van de Universiteit van Hong Kong, en het protocol werd goedgekeurd door het Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research (CULTAR) aan de Universiteit van Hong Kong.
OPMERKING: Vrouwelijke landbouwvarkens met een gewicht van 35-40 kg (9-12 maanden oud) werden gebruikt voor deze studie. Het stroomdiagram van dit experiment wordt weergegeven in figuur 1.
1. Chirurgische ingrepen
- Anesthesie en bereiding van het dier
- Snel de dieren voor 12 uur en onderworpen aan waterontbering voor 4 uur voor het experiment.
- Verdoof de varkens door middel van een intramusculaire injectie van tiletamine+zolezepam (2-7 mg/kg) en xylazine (0,5-1 mg/kg) bereid in 20 mL normale zoutoplossing. Controleer de palpebral reflexen van het dier totdat ze afwezig zijn.
- Verwijder het haar van het varken en steriliseer de huid in de nek en de lies voor secties 1.3-1.5. Desinfecteer het operatiegebied 3x met 70% ethanol en betadine.
- Plaats een 7 mm endotracheale buis in de varkenstrachea en plaats een 22 G veneuze inwonende naald in de oorveder.
- Verplaats het varken op de operatietafel en plaats in een supine positie. Sluit de endotracheale buis aan op het ademhalingskanaal en ventileer het dier mechanisch (inspiratoire/expiratoire tijdverhouding 1:2) met isoflurane (1,5%-2,0% inademing) en zuurstof (0,5-1,5 L/min inademing).
- Monitor het oppervlak elektrocardiogram en bloeddruk, en continu controleren van de hartslag, hartritme, en arteriële bloeddruk via elektrofysiologie opnamesystemen.
- Echocardiografie
- Verplaats het varken naar de linker laterale decubitus positie en vast te stellen op de tafel.
- Zet de sonde op het hartzakelijke gebied en voer seriële echocardiografie uit, inclusief 2D- en M-modus beeldvorming, met behulp van een echocardiografisch systeem met hoge resolutie en een 3-9 MHz-transducer bij de uitgangslijn, vóór celtransplantatie en 8 weken na celtransplantatie (Supplemental Figuur 1).
- Analyseer alle verkregen beelden met behulp van commerciële software. Bereken de LV-einddiastolische dimensie (LVEDD), LV-eind-systolische dimensie (LVESD), LV-einddiastolvolume (LVEDV), LV-eindsystolisch volume (LVESV), LV-uitwerpingsfractie (LVEF) en wanddikte nadat standaard echocardiografische afbeeldingen zijn verkregen uit het parasternale lange-asweergave.
OPMERKING: Alle off-line analyses werden uitgevoerd door een andere onafhankelijke operator met behulp van een computerwerkstation. De variabiliteit van de metingen tussen de verschillende waarnemers was 4% gebaseerd op 20 herhaalde willekeurige beelden. Alle echocardiografische metingen werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de American Society of Echocardiography.
- Pacemaker implantatie
- Verplaats het varken naar de supine positie en bevestig de ledematen van het varken op de tafel met riemen.
- Zoek de rechter halsslagader en halsader in de halsslagader (achter de sternocleidomastoïde en omgeven door de stylohyoïde, de digastric spier, en de omohyoid) en isoleer de rechter halsslagader en halsader met hemostatische tangen onder steriele omstandigheden (Supplemental Figuur 2). Ligate het distale uiteinde van de rechter halsslagader en halsader. Naai de twee spieren met 2-0 Vicryl.
- Cannulate de rechter halsader met een angiocath en steek een pacemaker leiden tot de rechter ventrikel onder x-ray begeleiding (Figuur 2).
- Isoleer de sternocleidomastoïde en de voorste scalene spier met behulp van tangen. Implanteer een pacemaker tussen de twee spieren en naai de twee spieren met 2-0 zijde. Verbind de pacemaker met de leiding.
- Herprogrammeer de pacemaker om een back-up VVI-modus (35 bpm) door een pacemaker generator na de transplantatie.
- Breng snelle ventriculaire pacing (150 slagen/min) aan om HF te induceren door een pacemakergenerator 4 weken na MI-inductie. Stel vervolgens de pacemaker terug naar de VVI-modus op 8 weken.
- Analyse van invasieve drukvolumelus
OPMERKING: Voer invasieve hemodynamische beoordeling uit bij aanvang, vóór celtransplantatie en 8 weken na celtransplantatie om veranderingen in de LV-functie te beoordelen.- Isoleer de rechter dijbeenslagader en dijbeenader in de dijbeendriehoek (omgeven door de inguinale ligament, sartoriusspier en adductor longusspier) (Supplemental Figuur 2).
- Cannulate de rechter dijbeenslagader met een angiocath en plaats een geleidedraad in de slagader via de angiokath. Verwijder de angiokath en kannulatele een 9F schede in de slagader onder begeleiding van de geleiderdraad. Verwijder de geleidedradend.
- Cannulate de rechter dijbeenader met een 12F schede zoals beschreven in stap 1.4.2. Steek een ballonkatheter van de geplaatste 12F schede in de inferieure vena cava (IVC) onder röntgenbegeleiding.
- Kalibreer een 7 Fr drukvolume (PV) katheter in isotone zoutoplossing met een PV-signaalprocessor.
- Plaats de PV katheter in de LV top van de geplaatste 9F schede onder röntgenbegeleiding. Hang de ventilatie op en meet het linker ventriculaire maximale positieve drukderivaat (+dP/dt), eindsystolische druk (ESP) en einddiastolse druk (EDP) met de PV-signaalprocessor.
- Meet de eindsystolische drukvolumerelatie (ESPVR) door de PV-signaalprocessor tijdens de occlusie van het IVC.
- Start de ventilatie opnieuw op wanneer de procedure is voltooid.
- Inductie van MI
- Herken het dier amiodaron (5 mg/kg intraveneus meer dan 1 uur) en lidocaïne (1,5 mg/kg intraveneuze bolus) aan het dier vóór inductie van MI om ventriculaire aritmestoornissen te voorkomen.
- Cannulate de juiste halsslagader met een 8F schede zoals vermeld in stap 1.4.3.
- Voer de coronaire angiografie uit via een 6F JR4 over-the-wire geleidekatheter via de geplaatste schede geleid door standaard C arm fluoroscopie apparatuur.
- Occlude de linker circumflex kransslagader (LCX) distaal aan de eerste stompe marginale tak met percutane transluminale coronaire angioplastie (PTCA) dilatatie ballon katheter inflatie onder X-ray begeleiding (Figuur 2).
- Injecteer 1 mL van 700 μm spons microsferen gemengd met 3 mL zout bereid in een 10 mL spuit door de ballon katheter om de LCX te blokkeren, dan leeglopen van de ballon en het uitvoeren van een angiogram om de occlusie te bevestigen.
- Herhaal de injectieprocedure om een succesvolle volledige blokkade te bereiken.
- Controleer de hartslag en het ritme van het dier om hartritmestoornissen te detecteren. Als ventriculaire fibrillatie is gebeurd, gebruik dan een externe, bifasische defibrillator om een sinusritme te herstellen met behulp van 150-300 J-schokken.
- Stamcelinjectie
- Willekeurig toewijzen van alle dieren met een opmerkelijke aantasting van de hartfunctie (LVEF < 40% op 8 weken na inductie van MI) aan twee verschillende groepen: een die intramyocardiale toediening van 2 x 108 door de mens veroorzaakte pluripotente stamcel-afgeleide mesenchymale stamcellen (hiPSC-MSCs) zal ontvangen, en de andere die geen hiPSC-MSCs zal ontvangen.
- Bereid de hiPSC-MSCs in 2 mL van normale zoutoplossing voor intramyocardiale transplantatie. Herhaal vóór intramyocardiale hiPSC-MSCs-transplantatie de anesthesie- en dierbereidingsstappen die in punt 1.1 worden genoemd, dit keer 10 cm rond het apex beat-gebied. Voer linker thoracotomie uit op de 4-5 intercostal ruimte met een oprolmechanisme. Voer pericardiotomie uit om de infarctige zijwand bloot te leggen.
LET OP: De lengte van de incisie was 10-12 cm. - Gebruik 5-8 intramyocardiale injecties (~0,3 mL per injectie) rond het infarctgebied om kweekmedium(Tabel van Materialen) toe te dienen aan een groep dieren of 2 x 108 hiPSC-MMC's aan de andere groep(figuur 3). Vermijd zorgvuldig any schade aan kransslagaders om het risico op bloeding te verminderen.
- Sluit de intercostale ruimte met ijzerdraad en sluit de spierlaag met 2-0 zijde. Naai het onderhuidse weefsel en de huid met 2-0 vicryl.
- Intracardiac geprogrammeerde elektrische stimulatie
- Voer geprogrammeerde elektrische stimulatie uit met behulp van een programmeerbare stimulator om de inducibility van ventriculaire tachyaritmie (VT) na de celtransplantatietherapie te beoordelen.
- Steek een 6F elektrofysiologische katheter in de rechter ventriculaire top via de dijbeenader voordat u alle dieren opoffert.
- Geef de intracardie-opnamen weer met het oppervlak elektrocardiogram leidt I, II en III op het elektrofysiologische opnamesysteem met een snelheid van 200 mm/s. Lever een 2 ms pulsbreedte op 2x de diastolische drempel met behulp van een stimulator.
- Lever een pacing trein van acht stimuli (S1) op twee drive cycle lengtes (200 ms en 300 ms), gevolgd door een (S2) of twee (S2 en S3) voortijdige extra stimuli.
- Verkort de koppelingsintervallen achtereenvolgens tot een ventriculaire effectieve vuurvaste periode of aritmie wordt geïnduceerd. Let op de aanwezigheid van inducible sustained VT (>10 s).
2. Postoperatieve protocol
- Postoperatieve geneeskunde
- Conventionele farmacologische therapieën uitvoeren voor HF. In het kort, oraal toedienen metoprolol beknopte (25 mg) en ramipril (2,5 mg) aan alle dieren dagelijks.
- Intramusculair toedienen enrofloxain (5 mg/kg) en buprenorfine (0,01 mg/kg) gedurende 1 week na de operatie dagelijks aan alle dieren om infectie te voorkomen en pijn te verlichten.
- Om immunologische afstoting te minimaliseren, mondeling een steroïde (40 mg/dag mondeling) en cyclosporine (200 mg/dag mondeling) aan alle dieren van 3 dagen voorafgaand aan celtransplantatie aan 8 weken na.
- Beoordeling van de infarctgrootte
- Euthanaserië de dieren door een overdosis slaapzaal (pentobarbital natrium, 100 mg/kg, IV) aan het einde van het experiment.
- Open de kist en verzamel het hart. Spoel het hart in 0,9% zout.
- Seriële sectie LV weefsel monsters met een scalpel op 1 cm diktes in de LV dwarse richting.
- Selecteer gedeelten van de plakjes die het infarct-myocardium bevatten om de wanddikte en het infarctgebied te meten.
- Leg het beeld van deze segmenten vast en analyseer kwantitatief de wanddikte en het infarctgebied met behulp van commerciële beeldanalysesoftware.
- Bevestig het weefsel in 10% formaline op 4 °C gedurende een maand. Sluit het weefsel binnen, aangrenzend en ver aan de infarctplaatsen (~1 cm2 stuks) in paraffine in. Sectie in 5 μm plakjes met behulp van een microtome voor histologisch onderzoek.
- Celoverleving
- Detecteer de engraftment van de getransplanteerde cellen door immunohistochemische kleuring met anti-menselijk nucleair antigeen (HNA) volgens het protocol van de fabrikant.
- Leg het beeld vast in drie verschillende secties op vijf willekeurige velden in elk dier en analyseer kwantitatief de positieve cellen in de peri-infarctzone.
OPMERKING: Het beeldvastleggende systeem en beeldanalysesoftware werden gebruikt om de beelden van de hartsecties vast te leggen en te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sterfte
In totaal werden 24 varkens gebruikt in deze studie. Drie van hen stierven tijdens MI inductie als gevolg van aanhoudende VT. Een dier stierf in de open-hart operatie voor cel-injectie als gevolg van wond bloeden. Twee dieren stierven als gevolg van een ernstige infectie. Twee dieren werden uitgesloten vanwege een lichte EF-reductie (LVEF-reductie > 40% van de basislijn). Als gevolg hiervan hebben 16 dieren het hele studieprotocol voltooid.
Hartfunctie en verbouwing
Seriële echocardiografisch onderzoek toonde aan dat LVEF aanzienlijk daalde van 68,23 ± 3,52% bij aanvang tot 39,37 ± 3,22%. LVEDD steeg aanzienlijk van 3,6 ± 0,5 tot 4,8 ± 0,4 en LVESD steeg aanzienlijk van 2,5 ± 0,3 tot 3,9 ± 0,4 (Figuur 4A) op 8 weken na inductie van MI. LVEF en LVESD verbeterden aanzienlijk tot respectievelijk 52,9 ± 4,27% en 3,3 ± 0,3 respectievelijk in de hiPSC-MSCs groep 8 weken na de transplantatie, vergeleken met de MI-status (figuur 4A).
De +dP/dt en ESPVR daalden aanzienlijk van 1.325 ± 63 mmHg/s en 3,9 ± 0,4 bij aanvang tot 978 ± 45 mmHg/s en 1,8 ± 0,2 bij 8 weken na inductie van MI. De intramyocardiale toediening van hiPSC-MSCs verhoogde de +dP/dt en ESPVR tot 1.127,4 ± 50 mmHg/s en 2,6 ± 0,3 op 8 weken na de transplantatie van IPSC-MSC's, vergeleken met de MI-status (figuur 4B).
Infarct wanddikte
De gemiddelde LV infarct wanddikte werd gemeten van 5-7 seriële 1 cm dikte sectie monsters in elk dier (Figuur 5). Het percentage LV-infarcten was 16 ± 2%.
Celoverleving na de transplantatie
Er was geen celoverleving rond de injectieplaats in het infarctgebied 8 weken na de transplantatie, maar een klein aantal van de overlevingshipsc-MMC's waren zichtbaar in het peri-infarctgebied(figuur 6).
Inducible ventriculaire aritmie
De incidentie van induceerbare aanhoudende tachyaritmestoornissen kan gemakkelijk worden verhoogd bij dieren met HF (10% bij aanvang vs. 75% 8 weken na inductie van MI). De hiPSC-MSCs transplantatie wijzigt het onderliggende myocardsubstraat niet significant om de gevoeligheid voor VT te verminderen (62,5% in hiPSC-MSCs groep 8 weken na intramyocardiale toediening van hiPSC-MSCs, figuur 7).
Figuur 1: Stroomschema van het experiment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Varkensmodel van een hartinfarct. Het varkensmodel van het hartinfarct (MI) werd veroorzaakt door embolisatie van de linker circumflex kransslagader (LCX, rode pijl) distaal tot de eerste stompe marginale tak. Deze kransslagader werd afgesloten met balloninflatie en een injectie van 700 μm microsferen. Coronaire angiografie bij pre-MI, balloninflatie, en post-MI werd uitgevoerd door een 6F JR4 begeleidende katheter via de juiste halsslagader. De pacemaker lood werd ingevoegd in de rechter ventrikel muur (blauwe pijl). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Celtransplantatie in een varkensmodel van MI. Celinjectieplaatsen bij de zijwand rond het infarctgebied van de linkerventrikel tijdens de linker thoracotomie. De blauwe pijl toont het peri-infarct gebied en de rode pijl toont het infarct gebied. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Hartfunctie verandert na MI. (A) Een LV M-modus echocardiogram beeld bij baseline, MI, en celtransplantatie. LVEF, LVEDD, LVESD daalde aanzienlijk 8 weken na MI inductie en aanzienlijk toegenomen in de hiPSC-MSCs groep 8 weken na celtransplantatie. (B) Om de hartfunctie van de varkens met hartfalen te beoordelen, werden de +dP/dt-waarde en de ESPVR gemeten met een PV-signaalprocessor. De inferieure vena cava (IVC) werd afgesloten door balloninflatie (blauwe pijl) tijdens de ESPVR-beoordeling. Zowel de +dP/dt als de ESPVR daalden aanzienlijk na mi-inductie en namen vervolgens aanzienlijk toe in de hiPSC-MSC-groepen 8 weken na de transplantatie. ANOVA gevolgd door Student-Newman-Keuls post hoc testen (SPSS, versie 14) werd gebruikt met α = 0,05 voor betekenis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Infarct verandert na MI. LV dwarse richting monsters verdeeld op 1 cm diktes in elk hart met infarct myocardium. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Celoverleving na de transplantatie. De engraftment van de getransplanteerde hiPSC-MSCs werd gedetecteerd door immunohistochemische kleuring vooranti-menselijk nucleair antigeen (rode kleur). Schaalbalk = 100 μm. Pijlen vertegenwoordigen positieve cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: De incidenties van aanhoudende ventriculaire tachyaritmmies. (A) Ventriculaire tachyaritmmie (VT, rode pijl) veroorzaakt door in vivo intracardiac geprogrammeerde elektrische stimulatie. (B) De incidentie van VT is aanzienlijk toegenomen na mi-inductie. Celtransplantatie verhoogde de incidentie van VT niet. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Overname van Echocardiogram. Het linkerpaneel toont de positie van het dier. Het rechterpaneel toont de sondepositie. Het middelste paneel toont de echocardiografische afbeelding onder deze positie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 2: Locatie van schepen. Varkens werden geplaatst in de supine positie. Insnijdingen voor de halsslagader en dijbeenslagader worden gepresenteerd als een rode lijn. De halsader en dijbeenader lagen onder respectievelijk de halsslagader en dijbeenslagader. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standaard diermodellen zijn van het grootste belang om de pathofysiologie en mechanismen van ziekten te begrijpen en nieuwe therapieën te testen. Ons protocol stelt een varkensmodel van HF in, veroorzaakt door linker circumflex slagader blokkade en snelle pacing. Acht weken na de inductie van MI ontwikkelden de dieren een aanzienlijke aantasting van LVEF, LVEDD, LVESD, +dP/dt en ESPVR. Dit protocol test ook de toedieningsmethode van stamceltherapie voor hartregeneratie door intramyocardiale injectie. De infarctgrootte en hartsystolische en diastolische functie worden geëvalueerd. Deze studie helpt bij het vaststellen van een stabiel en reproduceerbaar preklinisch groot dier HF-model voor stamcelbehandeling, dat vergelijkbaar is met klinische gevallen.
LCX blokkade en snelle pacing is op grote schaal gebruikt om dierlijke modellen van HF te creëren in onze vorige studies7,8. De LCX distal aan de eerste stompe marginale tak werd afgesloten, gevolgd door 4 weken van snelle rechter ventriculaire pacing. Myocardium ischemie resulteert in verlies van cardiomyocyten tijdens MI, wat hartfibrose, myocardiale remodellering en hartritmestoornissen veroorzaakt. Ventriculaire pacing resulteert in significante LV dilatatie, niet-inheemse stoornissen van linker ventriculaire contractiliteit, en ernstige LV-disfunctie9,10. Langere duur van ischemie en snelle pacing produceren een progressief experimenteel low-output HF-model voor translationeel onderzoek. Eerdere studies vastgesteld hartfalen modellen door het induceren van MI10. De mortaliteit van ernstige MI was echter hoger en de LVEF-reductie van MI was instabiel. Daarom passen we snelle rechter ventriculaire pacing toe na LCX-blokkade om een aanzienlijke aantasting van de hartfunctie te veroorzaken. Zoals blijkt uit onze eerdere studies, het model hier gepresenteerd levert stabiele infarct grootte, en de LVEF van dit model is teruggebracht tot ten minste minder dan 40% normale6,7,8. Waren er minder infecties en bloedingen geweest, dan had ons model slagingspercentage rond de 80% kunnen liggen.
Een van de belangrijkste obstakels voor de klinische toepassing van stamcellen is hun slechte overleving en engraftment na transplantatie. Recente klinische studies en meta-analyse11,12,13,14,15 hebben nagelaten een consistente verbetering van de LV-functie of infarctgrootte na een dergelijke therapie aan te tonen. Een van de mogelijke redenen is de lage overlevingskans van getransplanteerde cellen. Het ontdekken van een optimale toedieningsmethode speelt een cruciale rol in stamceltherapieën. Door de drie methoden van celtransplantatie te vergelijken, is intramyocardiale toediening efficiënter dan intraveneuze en intraronaire toediening als gevolg van een hogere celretentie16,17. Daarom hebben we in dit onderzoek een intramyocardiale beheerroute geselecteerd voor de levering van iPSC-MDC's. Echocardiografische resultaten en invasieve hemodynamische resultaten toonden aan dat intramyocardiale toediening van iPSC-MSCs de LV-functie van post-MI HF-varkens 8 weken na celtransplantatie verbeterde. Ondanks de toediening van immunosuppressieve geneesmiddelen (een steroïde en cyclosporine), slechts een paar getransplanteerde cellen werden gedetecteerd in het peri-infarct gebied. Geen overlevende cel werd ontdekt in het infarct gebied rond de geïnjecteerde site. Eerdere studies hebben ook een uiterst klein deel van de stamcellen gevonden in het infarct myocardium na de transplantatie18,19,20,21. Celverlies tijdens de intramyocardiale toediening kan de experimentele uitkomsten beïnvloeden. Hoe de beheersmethoden kunnen worden verbeterd en het verblijfspercentage kan worden verhoogd, moet in toekomstige studies worden verduidelijkt.
Veiligheid, vooral aritmogenese, is een andere essentiële zorg met betrekking tot de klinische praktijk met celgebaseerde therapieën. Onze recente studie toonde aan dat intramyocardiale toediening van menselijke embryostamcel (hESC) afgeleide CMs de incidentie van spontane niet-aanhoudende ventriculaire tachyaritmmiesverhoogde 4. In ons post-MI HF varkensmodel was de incidentie van spontane niet-aanhoudende ventriculaire tachyaritmie (rate >180 bpm en >12 beats) geregistreerd door telemetriemonitoring van de pacemaker 25% na MI-inductie, maar aanhoudende VT kon gemakkelijk worden geïnduceerd (80%). In deze studie blijft de incidentie van plotselinge dood onveranderd met of zonder hiPSC-MSCs toediening. Bovendien heeft de transplantatie van hiPSC-MSC's het onderliggende myocardsubstraat niet gewijzigd om de gevoeligheid voor ventriculaire hartritmestoornissen te verminderen of te vergroten. Dit resultaat suggereert dat het grote chronische HF-model van het grote dier kan worden gebruikt voor de beoordeling van de celveiligheid.
Het vermijden van infectie en bloeding zijn van het grootste belang voor een succesvolle inrichting van het diermodel. Om het risico op bloeding te verminderen, moet aandacht worden besteed aan eventuele schade aan kransslagaders en hartaderen te voorkomen. Aangezien twee dieren stierven aan een ernstige infectie, zal een passende postoperatieve medische strategie ten goede komen. Hier bieden we een postoperatieve medische strategie zoals hieronder: Intramusculair toedienen enrofloxaline (7,5 mg/kg, SID) en buprenorfine (0,02 mg/kg, BID) in combinatie met het mondeling toedienen van Amoxycilline/Clavulanic Acid (12,5 mg/kg, SID) en Carprofen (2 mg/kg, SID) aan alle dieren gedurende 1 week na de operatie om infectie te voorkomen en pijn te verlichten.
Samengevat biedt de huidige methode een stabiel en reproduceerbaar klinisch relevant groot dierlijk diermodel van hartfalen voor celtherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Alfreda en Kung Tak Chung voor hun uitstekende technische ondersteuning tijdens de dierproeven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiodarone | Mylan | - | - |
| Anaesthetic machines and respirator | Drager | Fabius plus XL | - |
| Angiocath | Becton Dickinson | 381147 | - |
| Anti-human nuclear antigen | abcam | ab19118 | - |
| Axio Plus image capturing system | Zeiss | Axioskop 2 PLUS | Axioskop 2 plus |
| AxioVision Rel. 4.5 software | Zeiss | - | - |
| Baytril | Bayer | - | enrofloxacin |
| Betadine | Mundipharma | - | - |
| CardioLab Electrophysiology Recording Systems | GE Healthcare | G220f | - |
| Culture media | MesenCult | 05420 | - |
| Cyclosporine | Novartis | - | - |
| Defibrillator | GE Healthcare | CardioServ | - |
| Dorminal | TEVA | - | - |
| Echocardiographic system | GE Vingmed | Vivid i | - |
| EchoPac software | GE Vingmed | - | - |
| Electrophysiological catheter | Cordis Corp | - | - |
| Embozene Microsphere | Boston Scientific | 17020-S1 | 700 μm |
| Endotracheal tube | Vet Care | VCPET70PCW | Size 7 |
| Ethanol | VWR chemicals | 20821.33 | - |
| Formalin | Sigma | HT501320 | 10% |
| IVC balloon Dilatation Catheter | Boston Scientific | 3917112041 | Mustang |
| JR4 guiding catheter | Cordis Corp | 67208200 | 6F |
| Lidocaine | Quala | - | - |
| Mersilk | Ethicon | W584 | 2-0 |
| Metoprolol succinate | Wockhardt | - | - |
| Microtome | Leica | RM2125RT | - |
| Mobile C arm fluoroscopy equipment | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | - |
| Pacemaker | St Jude Medical | PM1272 | Assurity MRI pacemaker |
| Pacemaker generator | St Jude Medical | Merlln model 3330 | - |
| Pressure-volume catheter | CD Leycom | CA-71103-PL | 7F |
| Pressure–volume signal processor | CD Leycom | SIGMA-M | - |
| Programmable Stimulator | Medtronic Inc | 5328 | - |
| PTCA Dilatation balloon Catheter | Boston Scientific | H7493919120250 | MAVERICK over the wire |
| Ramipril | TEVA | - | - |
| Sheath introducer | Cordis Corp | 504608X | 8F, 9F, 12F |
| Steroid | Versus Arthritis | - | - |
| Temgesic | Nindivior | - | buprenorphine |
| Venous indwelling needle | TERUMO | SR+OX2225C | 22G |
| Vicryl | Ethicon | VCP320H | 2-0 |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | - | - |
| Zoletil | Virbac New Zealand Limited | - | tiletamine+zolezepam |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131, e29 (2015).
- Hospital Authority. Hospital Authority Statistical Report 2013. , Hong Kong. (2013).
- Cung, T. T., et al. Cyclosporine before PCI in Patients with Acute Myocardial Infarction. The New England Journal of Medicine. 373 (11), 1021-1031 (2015).
- Liao, S. Y., et al. Proarrhythmic risk of embryonic stem cell-derived cardiomyocyte transplantation in infarcted myocardium. Heart Rhythm. 7, 1852-1859 (2010).
- Liao, S. Y., et al. Overexpression of Kir2.1 channel in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes attenuates posttransplantation proarrhythmic risk in myocardial infarction. Heart Rhythm. 10, 273-282 (2013).
- Liu, Y., et al. Thoracic spinal cord stimulation improves cardiac contractile function and myocardial oxygen consumption in a porcine model of ischemic heart failure. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 23, 534-540 (2012).
- Liao, S. Y., et al. Improvement of Myocardial Function Following Catheter-Based Renal Denervation in Heart Failure. JACC: Basic to Translational Science. 2 (3), 270-281 (2017).
- Liao, S. Y., et al. Remodelling of cardiac sympathetic re-innervation with thoracic spinal cord stimulation improves left ventricular function in a porcine model of heart failure. Europace. 17 (12), 1875-1883 (2015).
- Daehnert, I., Rotzsch, C., Wiener, M., Schneider, P. Rapid right ventricular pacing is an alternative to adenosine in catheter interventional procedures for congenital heart disease. Heart. 90 (9), 1047-1050 (2004).
- Hála, P., et al. Tachycardia-Induced Cardiomyopathy as a Chronic Heart Failure Model in Swine. Journal of Visualized Experiments. (132), e57030 (2018).
- Santoso, T., et al. Endomyocardial implantation of autologous bone marrow mononuclear cells in advanced ischemic heart failure: a randomized placebo-controlled trial (END-HF). Journal of Cardiovascular Translational Research. 7, 545-552 (2014).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network. Effect of intracoronary delivery of autologous bone marrow mononuclear cells 2 to 3 weeks following acute myocardial infarction on left ventricular function: the LateTIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 306, 2110-2119 (2011).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network (CCTRN). Effect of the use and timing of bone marrow mononuclear cell delivery on left ventricular function after acute myocardial infarction: the TIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 308, 2380-2389 (2012).
- de Jong, R., Houtgraaf, J. H., Samiei, S., Boersma, E., Duckers, H. J. Intracoronary stem cell infusion after myocardial infarction. A meta-analysis and update on clinical trials. Circulation: Cardiovascular Interventions. 7, 156-167 (2014).
- Nowbar, A. N., et al. DAMASCENE writing group. Discrepancies in autologous bone marrow stem cell trials and enhancement of ejection fraction (DAMASCENE): weighted regression and meta-analysis. British Medical Journal. 348, g2688 (2014).
- Kanelidis, A. J., Premer, C., Lopez, J., Balkan, W., Hare, J. M. Route of Delivery Modulates the Efficacy of Mesenchymal Stem Cell Therapy for Myocardial Infarction: A Meta-Analysis of Preclinical Studies and Clinical Trials. Circulation Research. 120 (7), 1139-1150 (2017).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112 (9 Suppl), I150-I156 (2005).
- Hu, X., et al. A Large-Scale Investigation of Hypoxia-Preconditioned Allogeneic Mesenchymal Stem Cells for Myocardial Repair in Nonhuman Primates: Paracrine Activity Without Remuscularization. Circulation Research. 118, 970-983 (2016).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Martens, A., et al. Substantial early loss of induced pluripotent stem cells following transplantation in myocardial infarction. Artificial Organs. 38, 978-984 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
