Summary
ביקשנו לבסס מודל חזירים של אי ספיקת לב המושרה על ידי חסימת עורק היקפית שמאל וצעידה מהירה כדי לבדוק את ההשפעה והבטיחות של ניהול פנים-לב של תאי גזע עבור טיפולים מבוססי תאים.
Abstract
למרות ההתקדמות הושגו בטיפול אי ספיקת לב (HF) בעקבות אוטם שריר הלב (MI), HF בעקבות MI נשאר אחד הגורמים העיקריים של תמותה ותאו נפש ברחבי העולם. טיפולים מבוססי תאים לתיקון לב ושיפור של תפקוד החדר השמאלי לאחר MI משכו תשומת לב ניכרת. בהתאם לכך, הבטיחות והיעילות של השתלות תאים אלה יש לבדוק במודל בעל חיים פרה-קליני גדול של HF לפני השימוש הקליני. חזירים נמצאים בשימוש נרחב למחקר מחלות לב וכלי דם בשל הדמיון שלהם לבני אדם במונחים של גודל הלב ואנטומיה כלילית. לכן, ביקשנו להציג פרוטוקול יעיל להקמת מודל HF כרוני porcine באמצעות חסימת בלון כלילי חזה סגור של עורק ההיקף השמאלי (LCX), ואחריו צעידה חדרית מהירה המושרה עם השתלת קוצב לב. שמונה שבועות לאחר מכן, תאי הגזע ניתנו על ידי הזרקת פנים-שריר הלב באזור האוטם פרי. לאחר מכן גודל האוטם, הישרדות התא, ותפקוד החדר השמאלי (כולל אקוקרדיוגרפיה, פרמטרים המודינמיים, אלקטרופיזיולוגיה) הוערכו. מחקר זה מסייע לבסס מודל HF בעל חיים גדול פרה-לקלינלי יציב לטיפול בתאי גזע.
Introduction
מחלות לב וכלי דם, מחלת עורקים כליליים (CAD) בפרט, להישאר הגורם העיקרי של חולות ותמותה בהונג קונג וברחבי העולם1. בהונג קונג, עלייה של 26% בין 2012 ל-2017 של מספר חולי CAD שטופלו תחת רשות בתיהחולים היה צפוי 2. בין כל CADs, אוטם שריר הלב חריפה (MI) הוא גורם מוביל למוות וסיבוכים הבאים, כגון אי ספיקת לב (HF). אלה תורמים לנטל רפואי, חברתי וכלכלי משמעותי. בחולים עם MI, טיפול טרוממבוליטי או התערבות כלילית רדיפתית ראשונית (PCI) הוא טיפול יעיל בשימור החיים, אבל טיפולים אלה יכולים רק להפחית קרדיומיוציט (CM) אובדן במהלך MI. הטיפולים הזמינים אינם מסוגלים לחדש את האובדן הקבוע של CMs, מה שמוביל פיברוזיס לב, איחוי שריר הלב, הפרעה בקצב הלב, ובסופו של דבר אי ספיקת לב. שיעור התמותה בשנה שלאחר MI הוא סביב 7% עם יותר מ 20% חולים לפתח HF3. בחולים HF בשלב הסופי, השתלת לב הוא הטיפול היעיל הזמין היחיד, אבל זה מוגבל על ידי מחסור באיברים זמינים. טיפולים חדשניים נחוצים כדי להפוך את הפיתוח של HF שלאחר MI. כתוצאה מכך, טיפול מבוסס תאים נחשב גישה אטרקטיבית כדי לתקן את CMs לקוי ותפקוד החדר השמאלי (LV) ב HF בעקבות MI. המחקרים הקודמים שלנו מצאו השתלת תאי גזע להיות מועיל לשיפור תפקוד הלב לאחר השתלת פנים פנים ישירה במודלים בעלי חיים קטנים של MI4,,5. פרוטוקולי HF בעלי חיים גדולים פרה-קליניים מתוקנים נדרשים כדי לבחון עוד יותר את היעילות והבטיחות של השתלת תאי גזע לפני השימוש הקליני.
העשורים האחרונים היו עדים לשימוש הנרחב של חזירים במחקר לב וכלי דם לטיפול בתאי גזע. חזירי HF הם מודל מבטיח של מחקר תרגום בשל הדמיון שלהם לבני אדם במונחים של גודל הלב, משקל, קצב, תפקוד, ואנטומיה עורקים כליליים. יתר על כן, מודלים HF porcine יכול לחקות לאחר MI HF חולים במונחים של חילוף חומרים CM, תכונות אלקטרופיזיולוגיות, ושינויים נוירואנדוקריניים בתנאים איסכמיים6. הפרוטוקול המוצג כאן משתמש כזה מתוקנן חזיר HF מודל, העסקת חסימת בלון כלילי חזה סגור של עורק הימול השמאלי (LCX) ואחריו צעידה מהירה המושרה על ידי השתלת קוצב לב. המחקר גם מייעל את המסלול של ניהול פנים-לב של תאי גזע לטיפול ב-HF שלאחר MI. המטרה היא לייצר מודל של בעלי חיים של אוטם שריר הלב כרוני שיכול לשמש לפיתוח טיפולים הרלוונטיים קלינית עבור חולים עם CAD חמור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים במעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות ותקנות של אוניברסיטת הונג קונג, והפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לשימוש בבעלי חיים בהוראה ומחקר (CULTAR) באוניברסיטת הונג קונג.
הערה: חזירי חווה נקבה במשקל 35-40 ק"ג (9-12 חודשים) שימשו למחקר זה. תרשים הזרימה של ניסוי זה מוצג באות 1.
1. הליכים כירורגיים
- הרדמה והכנת החיה
- צם את בעלי החיים במשך 12 שעות וכפוף למחסור במים במשך 4 שעות לפני הניסוי.
- להנפין את החזירים באמצעות הזרקה תוך שרירית של tiletamine + zolezepam (2-7 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (0.5-1 מ"ג/ק"ג) מוכן 20 מ"ל של תמיסת מלח רגילה. נטר את רפלקסי פלורל של החיה עד שהם נעדרים.
- מסירים את שיער החזיר ומחטאים את העור בצוואר ובמפשעה למקטעים 1.3-1.5. חיטוי אזור הפעולה פי 3 עם 70% אתנול ובטאדין.
- מניחים צינור אנדוטרצ'יל 7 מ"מ לתוך קנה הנשימה של הקיצין ומניחים מחט וירידית 22 גרם לתוך וון האוזן.
- מעבירים את החזיר לשולחן הניתוחים וממקם בתנוחה סופית. חבר את צינור ה אנדוטרצ'ל למכונת ההנשמה ואוורור מכני (יחס זמן אינספירי/תפוגה 1:2) את בעל החיים עם שאיפה isoflurane (1.5%-2.0% שאיפה) וחמצן (0.5-1.5 L/min אינהלציה).
- נטרו את האלקטרוקרדיוגרם ולחץ הדם של פני השטח, עקבו באופן רציף אחר קצב הלב, קצב הלב ולחץ הדם העורקי באמצעות מערכות הקלטה אלקטרופיזיולוגיות.
- אקוקרדיוגרפיה (אקוקרדיוגרפיה)
- מעבירים את החזיר למיקום ההתפלה הירבי בצד שמאל ומסדרים על השולחן.
- לשים את הגשוש על אזור הלב ולבצע אקוקרדיוגרפיה טורית, כולל הדמיה דו-ממדית ו-M-מצב, באמצעות מערכת אקו-קרדיוגרפית ברזולוציה גבוהה ומתמר 3-9 MHz בקו הבסיס, לפני השתלת תאים 8 שבועות לאחר השתלת תאים(איור משלים 1).
- נתח את כל התמונות שהושגו באמצעות תוכנה מסחרית. חשב את ממד הקצה-דיאסטולי LV (LVEDD), ממד קצה-סיסטולי LV (LVESD), אמצעי אחסון סוף-דיאסטולי LV (LVEDV), אמצעי אחסון סוף-סיסטולי LV (LVESV), שבר פליטה LV (LVEF) ועובי הקיר לאחר מתקבלות תמונות אקו-קרדיוגרפיות סטנדרטיות מהתצוגה של ציר ארוך פארסטראלי.
הערה: כל הניתוחים ההתנתקים בוצעו על-ידי מפעיל עצמאי אחר באמצעות תחנת עבודה במחשב. השונות של המדידות בין משקיפים שונים הייתה 4% בהתבסס על 20 תמונות אקראיות חוזרות ונשנות. כל המדידות הדקרדיוגרפיות בוצעו בהתאם להמלצות האגודה האמריקאית לאקוקרדיוגרפיה.
- השתלת קוצב לב
- מעבירים את החזיר לתמונת העל-תתנוחה ומסדרים את איברי החזיר על השולחן ברצועות.
- אתר את העורק הראשי הימני ואת וריד הצוואר במשולש הראשי (מאחורי sternocleidomastoid ומוקף stylohyoid, שריר digastric, omohyoid) ולבודד את העורק הראשי הימני וריד הצוואר עם מכריחים hemostatic בתנאים סטריליים(איור משלים 2). לחתוך את הקצה הדיסטלי של העורק הראשי הימני וריד הצוואר. לתפור את שני השרירים עם 2-0 Vicryl.
- לתבל את וריד הצוואר הימני עם אנגיוקט ולהכניס קוצב לב להוביל לחדר הימני תחת הדרכת רנטגן(איור 2).
- לבודד את הסטרנוקלידום ואת שריר קנה המידה הקדמי באמצעות מרטטים. להשתיל קוצב לב בין שני השרירים ולתפור את שני השרירים עם 2-0 משי. חבר את קוצב הלב להובלה.
- לתכנת מחדש את קוצב הלב למצב VVI גיבוי (35 bpm) על ידי גנרטור קוצב לב לאחר ההשתלה.
- להחיל ריווח מהיר בחדר (150 פעימות / דקה) כדי לגרום HF על ידי גנרטור קוצב לב 4 שבועות לאחר אינדוקציה MI. לאחר מכן להגדיר את קוצב הלב בחזרה למצב VVI גיבוי ב 8 שבועות.
- ניתוח לולאת נפח לחץ פולשנית
הערה: לבצע הערכה המודינמית פולשנית בבסיס, לפני השתלת תאים 8 שבועות לאחר השתלת תאים כדי להעריך שינויים בתפקוד LV.- לבודד את עורק הירך הימני ואת וורין הירך במשולש הירך (מוקף ברצועה העין, שריר sartorius, ושריר adductor longus)(דמות משלימה 2).
- תנקה את עורק הירך הימני עם אנגיוקה והנח חוט מנחה לתוך העורק דרך האנגיוקה. הסר את האנגיוקת וחוטף נדן 9F לתוך העורק תחת הדרכתו של חוט ההדרכה. הסר את חוט היישור.
- תוסכל את ויר הירך הימני עם נדן 12F כמתואר בשלב 1.4.2. הכנס צנתר בלון מן נדן 12F ממוקם לתוך קאווה וונה נחות (IVC) תחת הדרכת רנטגן.
- כייל צנתר 7 Fr בלחץ נפח (PV) בתמיסת מלח isotonic עם מעבד אותות PV.
- הכנס את צנתר PV לתוך שיא LV מתוך נדן 9F ממוקם תחת הדרכת רנטגן. השהה את האוורור ומדד את נגזרת הלחץ החיובית המקסימלית (+dP/dt), לחץ סוף-סיסטולי (ESP) ולחצים סופיים דיסטוליים (EDP) עם מעבד אותות PV.
- למדוד את קשרי הלחץ-נפח סיסטולי סוף (ESPVR) על-ידי מעבד אותות PV במהלך ההסתה של IVC.
- הפעל מחדש את האוורור לאחר סיום ההליך.
- אינדוקציה של MI
- תוך וריד לנהל amiodarone (5 מ"ג/ ק"ג דרך הווריד מעל 1 שעות) ולידוקאין (1.5 מ"ג / ק"ג בולוס תוך וריד) לחיה לפני אינדוקציה של MI כדי למנוע הפרעות בקצב הלב בחדר.
- תחכל את העורק הראשי הימני עם נדן 8F כפי שהוזכר בשלב 1.4.3.
- בצע את אנגיוגרפיה כלילית באמצעות 6F JR4 מעל התיל מנחה צנתר באמצעות נדן ממוקם מונחה על ידי ציוד פלואורוסקופיה זרוע C סטנדרטי.
- תחסום את העורק הכלילי (LCX) היקטין לענף השולי האטומלי הראשון עם אנגיופלסטיקה כלילית רדקנית (PTCA) אינפלציה של צנתר בלון בלון תחת הדרכת רנטגן(איור 2).
- להזריק 1 מ"ל של 700 מיקרוספירות ספוג μm מעורבב עם 3 מ"ל של תמיסת מלח מוכן מזרק 10 מ"ל דרך צנתר הבלון כדי לחסום את LCX, לאחר מכן לנפח את הבלון ולבצע אנגיוגרמה כדי לאשר את החסימה.
- חזור על הליך ההזרקה כדי להשיג חסימה מלאה מוצלחת.
- לפקח על קצב הלב והקצב של בעלי החיים כדי לזהות הפרעות בקצב הלב. אם קרה פתפור בחדר, השתמש בדפיברילטור חיצוני דו-פי-זמני כדי לכונן מחדש קצב סינוסים באמצעות 150-300 J זעזועים.
- הזרקת תאי גזע
- באופן אקראי להקצות את כל בעלי החיים עם פגיעה בולטת בתפקוד הלב (LVEF < 40% ב 8 שבועות לאחר אינדוקציה של MI) לשתי קבוצות שונות: אחד שיקבל ניהול פנים-לב של 2 x 10 8 תאי גזעפלורופוטנטיים המושרה תאי גזע פלורופוטנטיים נגזר mesenchymal (hiPSC-MSCs), והשני שלא יקבל hiPSC-MSCs.
- הכן את hiPSC-MSCs ב 2 מ"ל של תמיסת מלח רגילה להשתלת תוך-שריר הלב. לפני השתלת hiPSC-MSCs תוך-לב, חזור על ההרדמה ועל שלבי הכנת בעלי חיים המוזכרים בסעיף 1.1, הפעם חיטוי 10 ס"מ סביב אזור פעימה apex. בצע את ניקור החזה השמאלי בחלל הבין-קוסטלי 4-5 עם מפשק. לבצע כריתת הלב כדי לחשוף את הקיר האוטם לחוץ.
הערה: אורך החתך היה 10-12 ס"מ. - השתמש 5-8 זריקות פנים-לב (~ 0.3 מ"ל לכל הזרקה) סביב האזור האוטם כדי לנהל מדיום תרבות (טבלת חומרים) לקבוצה אחת של בעלי חיים או 2 x 108 hiPSC-MSCs לקבוצההשנייה (איור 3). הימנע בזהירות כל נזק לעורקים הכליליים כדי להפחית את הסיכון לדימום.
- סגור את החלל הבין-קוסטלי עם חוט ברזל וסגור את שכבת השריר עם משי 2-0. לתפור את הרקמה התת עורית ועור עם 2-0 vicryl.
- גירוי חשמלי מתוכנת תוך-לבבי
- לבצע גירוי חשמלי מתוכנת באמצעות ממריץ לתכנות כדי להעריך את הגירוי של tachyarrhythmia בחדר (VT) לאחר הטיפול השתלת התא.
- הכנס צנתר אלקטרופיזיולוגי 6F לתוך החלק הימני של החדר דרך וריד הירך לפני הקרבת כל בעלי החיים.
- הצג את הקלטות התוך לב עם פני השטח אלקטרוקרדיוגרם מוביל I, II, ו- III על מערכת ההקלטה אלקטרופיזיולוגית במהירות של 200 מ"מ / s. לספק רוחב פולס 2 ms ב 2x הסף הdiastolic באמצעות ממריץ.
- לספק רכבת צעידה של שמונה גירויים (S1) בשני אורכי מחזור נסיעה (200 ms ו 300 אלפיות השנייה), ואחריו אחד (S2) או שניים (S2 ו- S3) גירויים נוספים בטרם עת.
- קיצור רצף של מרווחי הזיווג עד לתקופת עשע יעילה בחדר או להפרעה בקצב הלב. שים לב לנוכחות של VT ממושך בלתי ניתן להוות (>10 s).
2. פרוטוקול לאחר הניתוח
- רפואה לאחר הניתוח
- בצע טיפולים תרופתיים קונבנציונליים עבור HF. בקצרה, דרך אגב לנהל metoprolol succinate (25 מ"ג) ו ramipril (2.5 מ"ג) לכל בעלי החיים מדי יום.
- תוך שרירי לנהל enrofloxacin (5 מ"ג / ק"ג) ו buprenorphine (0.01 מ"ג/ ק"ג) לכל בעלי החיים מדי יום במשך 1 שבוע לאחר הניתוח כדי למנוע זיהום ולהקל על כאב.
- כדי למזער את הדחייה החיסונית, דרך הפה לנהל סטרואידים (40 מ"ג ליום דרך הפה) ו ציקלוספורין (200 מ"ג ליום דרך הפה) לכל בעלי החיים מ 3 ימים לפני השתלת תאים 8 שבועות לאחר.
- הערכת גודל אוטם
- המתת סד לבעלי החיים על ידי מנת יתר של dorminal (נתרן פנטוברביטל, 100 מ"ג/ ק"ג, IV) בסוף הניסוי.
- פתח את התיבה ואסוף את הלב. לשטוף את הלב ב 0.9% תמיסת מלח.
- באופן סדרתי סעיף LV רקמת דגימות עם אזמל ב1 ס"מ עובי בכיוון רוחבי LV.
- בחר חלקים מהפרוסות המכילות את שריר הלב האוטם כדי למדוד את עובי הקיר ואת אזור האוטם.
- ללכוד את התמונה של פרוסות אלה ולנתח כמותית את עובי הקיר ואת האזור האוטם באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מסחרית.
- לתקן את הרקמה ב 10% פורמלין ב 4 מעלות צלזיוס לחודש. הטבע את הרקמה בתוך, סמוך ומרוחק לאתרי אוטם (~ 1ס"מ 2 חתיכות) בפרפין. מקטע לפרוסות 5 μm באמצעות microtome לבדיקה היסטולוגית.
- הישרדות תאים
- לזהות את ההטבעה של התאים המושתלים על ידי כתם חיסוני עם אנטיגן גרעיני אנטי אנושי (HNA) על פי הפרוטוקול שסופק על ידי היצרן.
- ללכוד את התמונה בשלושה מקטעים שונים בחמישה שדות אקראיים בכל בעל חיים ולנתח כמותית את התאים החיוביים באזור peri-infarct.
הערה: תוכנת לכידת המערכת וניתוח התמונות של התמונה שימשה ללכידת וניתוח התמונות של מקטעי הלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התמותה
בסך הכל 24 חזירים שימשו במחקר זה. שלושה מהם מתו במהלך אינדוקציה MI בגלל VT מתמשך. חיה אחת מתה בניתוח לב פתוח להזרקת תאים בגלל דימום בפצע. שתי חיות מתו בגלל זיהום חמור. שני בעלי חיים לא נכללו בשל הפחתה קלה של EF (הפחתה של LVEF > 40% מקו הבסיס). כתוצאה מכך, 16 בעלי חיים השלימו את כל פרוטוקול המחקר.
תפקוד הלב ושיפוץ
בדיקה אקו-קרדיוגרפית טורית הראתה כי LVEF ירד באופן משמעותי מ- 68.23 ± 3.52% בקו הבסיס ל- 39.37 ± 3.22%. LVEDD גדל באופן משמעותי מ 3.6 ± 0.5 כדי 4.8 ± 0.4 ו LVESD גדל באופן משמעותי מ 2.5 ± 0.3 כדי 3.9 ± 0.4 (איור 4A) ב 8 שבועות לאחר אינדוקציה של MI. LVEF ו- LVESD השתפרו באופן משמעותי ל- 52.9 ± 4.27% ו- 3.3 ± 0.3 בהתאמה בקבוצת hiPSC-MSCs 8 שבועות לאחר ההשתלה, בהשוואה למצב MI ( איור4א').
+dP/dt ו- ESPVR ירד באופן משמעותי מ 1,325 ± 63 mmHg / s ו 3.9 ± 0.4 בבסיס ל 978 ± 45 mmHg / s ו 1.8 ± 0.2 ב 8 שבועות לאחר אינדוקציה של MI. ניהול פנים-לב של hiPSC-MSCs הגדיל את ה-+dP/dt וה- ESPVR ל- 1,127.4 ± 50 mmHg/s ו- 2.6 ± 0.3 ב- 8 שבועות לאחר השתלת iPSC-MSCs, בהשוואה למצב MI (איור 4B).
עובי קיר אוטם
עובי קיר אוטם LV הממוצע נמדד מ 5-7 סדרתי 1 ס"מ עובי מקטע דגימות בכל בעל חיים (איור 5). אחוז אוטם LV היה 16 ± 2%.
הישרדות תאים לאחר ההשתלה
לא היה הישרדות תא סביב אתר ההזרקה באזור האוטם 8 שבועות לאחר ההשתלה, אבל מספר קטן של hiPSC-MSCs הישרדות היו גלויים באזור peri-infarct(איור 6).
הפרעה בקצב הלב בחדר הבלתי ניתן להוכיה
השכיחות של tachyarrhythmias חדריים בלתי ניתן לכך ניתן להגדיל בקלות בבעלי חיים עם HF (10% בבסיס לעומת 75% 8 שבועות לאחר אינדוקציה של MI). השתלת hiPSC-MSCs אינה משנה באופן משמעותי את המצע שריר הלב הבסיסי כדי להפחית את הרגישות VT (62.5% בקבוצת hiPSC-MSCs 8 שבועות לאחר ניהול תוך-לב של hiPSC-MSCs, איור 7).
איור 1: תרשים זרימה של הניסוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דגם פורצין של אוטם שריר הלב. דגם porcine של אוטם שריר הלב (MI) היה מושרה על ידי תסחיף של העורק הכלילי הימול השמאלי (LCX, חץ אדום) דיסטאל לענף השולי האטום הראשון. עורק כלילי זה היה חסום עם אינפלציה בלון וזריקה של 700 מיקרוספירות μm. אנגיוגרפיה כלילית בטרום MI, אינפלציית בלון, ופוסט MI בוצע באמצעות 6F JR4 מנחה צנתר דרך העורק הראשי הימני. עופרת קוצב הלב הוכנסה לתוך קיר החדר הימני (חץ כחול). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: השתלת תאים במודל של MI. אתרי הזרקת תאים בקיר הניעי סביב האזור האוטם של החדר השמאלי במהלך ניקור חזה שמאלי. החץ הכחול מציג את האזור האוטם והחץ האדום מציג את האזור האוטם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תפקוד הלב משתנה לאחר MI. (A)תמונת אקו-קרדיוגרמה במצב M LV בבסיס, MI והשתלת תאים. LVEF, LVEDD, LVESD ירד באופן משמעותי 8 שבועות לאחר אינדוקציה MI וגדל באופן משמעותי בקבוצת hiPSC-MSCs 8 שבועות לאחר השתלת תאים. (ב)כדי להעריך את תפקוד הלב של החזירים עם אי ספיקת לב, ערך +dP/dt ו- ESPVR נמדדו עם מעבד אותות PV. קאווה וונה נחותה (IVC) היה occlued על ידי אינפלציה בלון (חץ כחול) במהלך הערכת ESPVR. הן +dP/dt והן ESPVR ירד באופן משמעותי לאחר אינדוקציה MI, ולאחר מכן גדל באופן משמעותי בקבוצות hiPSC-MSC 8 שבועות לאחר ההשתלה. ANOVA ואחריו סטודנט-ניומן-Keuls פוסט הוק בדיקות (SPSS, גירסה 14) שימש עם α = 0.05 עבור משמעות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: שטח אוטם משתנה לאחר MI. דגימות כיוון רוחבי LV הוחתו בעובי של 1 ס"מ בכל לב המכיל שריר הלב האוטם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: הישרדות תאים לאחר ההשתלה. ההתבוללות של hiPSC-MSCs המושתלים זוהתה על ידי כתם חיסוני אנטיגן גרעיני אנטי-אנושי (צבע אדום). סרגל קנה מידה = 100 μm. חצים מייצגים תאים חיוביים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: השכיחות של תכלת חדרי מתמשך. (A)tachyarrhythmias חדרי (VT, חץ אדום) המושרה על ידי גירוי חשמלי מתוכנת תוך לבבי vivo. (ב)השכיחות של VT גדל באופן משמעותי לאחר אינדוקציה MI. השתלת תאים לא הגבירה את השכיחות של VT. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: רכישת אקו קרדיוגרם. הלוח השמאלי מראה את מיקום החיה. הלוח הימני מראה את מיקום הגשוש. הלוח האמצעי מציג את התמונה ההד-קרדיוגרפית במיקום זה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 2: מיקום כלי שיט. חזירים הוצבו בתנוחה סופית. החתך של העורק הראשי ועורק הירך מוצגים כקו אדום. וריד הצוואר וריד הירך היו מתחת לעורק הראשי ולעורק הירך בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים סטנדרטיים של בעלי חיים הם בעלי חשיבות עליונה כדי להבין את הפתופיזיולוגיה ומנגנונים של מחלות וטיפולים רומן בדיקה. הפרוטוקול שלנו קובע מודל של HF המושרה על ידי חסימת עורק הירק השמאלי וצעידה מהירה. שמונה שבועות לאחר האינדוקציה של MI, בעלי החיים פיתחו פגיעה משמעותית של LVEF, LVEDD, LVESD, +dP/ dt, ו ESPVR. פרוטוקול זה גם בודק את שיטת הניהול של טיפול בתאי גזע להתחדשות הלב על ידי הזרקת פנים-שריר הלב. גודל האוטם, ותפקוד סיסטולי לב דיסטולי מוערכים. מחקר זה מסייע לבסס מודל HF בעל חיים גדול פרה-קליני יציב הניתן לשחזור לטיפול בתאי גזע, הדומה למקרים קליניים.
חסימת LCX וצעידה מהירה שימשה בהרחבה ליצירת מודלים של בעלי חיים של HF במחקרים הקודמיםשלנו 7,8. הדיסטלי LCX לענף השולי האטובה הראשון היה occlued, ואחריו 4 שבועות של ריווח מהיר בחדר הימני. איסכמיה שריר הלב גורמת לאובדן קרדיומיוציטים במהלך MI, אשר גורם פיברוזיס לב, איחוי שריר הלב, והפרעה בקצב הלב. ריווח חדרי גורם התכווצות משמעותית LV, ליקוי nonischemic של כיווץ החדר השמאלי, ותפקוד לקוי LVחמור 9,,10. משכים ארוכים יותר של איסכמיה וצעידה מהירה מייצרים מודל HF ניסיוני מתקדם בתפוקה נמוכה למחקר תרגום. מחקרים קודמים ביססו מודלים של אי ספיקת לב על ידי גורם MI10. עם זאת, התמותה של MI חמור היה גבוה יותר והפחתת LVEF של MI היה לא יציב. לכן, אנו מיישמים ריווח מהיר בחדר הימני לאחר חסימת LCX כדי לגרום לפגיעה משמעותית בתפקוד הלב. כפי שניתן לראות במחקרים הקודמים שלנו, המודל המוצג כאן מניב גודל אוטם יציב, ואת LVEF של מודל זה מצטמצם לפחות מתחת 40%נורמלי 6,7,8. אם היו פחות זיהומים ודימום, שיעור ההצלחה של המודל שלנו היה יכול להיות בסביבות 80%.
אחת המשוכות העיקריות ליישום הקליני של תאי גזע היא הישרדותם הירואה וההשתלה הירוכות שלהם. מחקרים קלינייםאחרונים ומטה-אנליזה 11,12,13,14,15 לא הצליחו להדגים כל שיפור עקבי בתפקוד LV או גודל אוטם לאחר טיפול כזה. אחת הסיבות האפשריות היא שיעור ההישרדות הנמוך של תאים מושתלים. גילוי שיטת ניהול אופטימלית ממלא תפקיד קריטי טיפולים בתאי גזע. השוואת שלוש השיטות של השתלת תאים, ניהול פנים-שריר הלב יעיל יותר מאשר ניהול תוך וריד ותוך-תאי עקב שמירה גבוהה יותר של תאים16,17. לכן, בחרנו נתיב ניהול פנים-מיו-פנים למסירה של iPSC-MSCs במחקר זה. תוצאות אקוקרדיוגרפיות ותוצאות המודינמיות פולשניות הראו כי ניהול פנים-מיו-קרדיאלי של iPSC-MSCs ameliorated LV פונקציה של חזירים HF לאחר MI 8 שבועות לאחר השתלת תאים. למרות הניהול של תרופות מדכאות חיסוניות (סטרואידים וציקלופין), רק כמה תאים מושתלים זוהו באזור peri-אוטם. לא זוהה תא ששרד באזור האוטם סביב האתר המוזרק. מחקרים קודמים מצאו גם חלק קטן מאוד של תאי גזע בקרדיום האוטם לאחר ההשתלה18,19,20,21. אובדן תאים במהלך הממשל התוך-לבתי עשוי להשפיע על התוצאות הניסיוניות. כיצד לשפר את שיטות הניהול ולהגדיל את שיעור המגורים יש להבהיר במחקרים עתידיים.
Safety, especially arrhythmogenesis, is another vital concern regarding clinical practice with cell-based therapies. המחקר האחרון שלנו הראה כי ניהול פנים-מיו-פנים של תאי גזע עובר אנושי (hESC) נגזר CMs הגדיל את השכיחות של tachyarrhythmias חדרי ספונטנישאינו ממושך 4. במודל הפורסין שלאחר MI HF, השכיחות של tachyarrhythmia חדרי ספונטני לא ממושך (קצב >180 bpm ו >12 פעימות) נרשם על ידי ניטור טלמטריה מ קוצב הלב היה 25% לאחר אינדוקציה MI, אבל VT ממושך יכול להיות מושרה בקלות (80%). במחקר זה, השכיחות של מוות פתאומי נשאר ללא שינוי עם או בלי ניהול hiPSC-MSCs. יתר על כן, השתלת hiPSC-MSCs לא לשנות את המצע שריר הלב הבסיסי כדי להפחית או להגדיל את הרגישות להפרעות בקצב הלב בחדר. תוצאה זו מצביעה על כך כי מודל HF כרוני בעלי חיים גדול יכול לשמש להערכת בטיחות התא.
הימנעות מזיהום ודהומים היא בעלת חשיבות עליונה להקמת מודלים מוצלחים של בעלי חיים. כדי להפחית את הסיכון לדימום, יש לשלם תשומת לב כדי למנוע נזק לעורקים כליליים ולורידים של הלב. כאשר שתי חיות מתו מזיהום חמור, אסטרטגיה רפואית מתאימה לאחר הניתוח תועיל. כאן, אנו מספקים אסטרטגיה רפואית לאחר הניתוח להלן: תוך שרירי לנהל enrofloxacin (7.5 מ"ג/ ק"ג, SID) ו buprenorphine (0.02 מ"ג/ק"ג, BID) בשילוב עם דרך ה-AMoxycillin/Clavulanic חומצה (12.5 מ"ג/ק"ג, SID) ו Carprofen (2 מ"ג/ק"ג, SID) לכל בעלי החיים במשך שבוע לאחר הניתוח כדי למנוע זיהום ולהקל על כאב.
לסיכום, השיטה הנוכחית מספקת מודל בעל חיים גדול ויציב ורלוונטי קלינית של אי ספיקת לב לטיפולים מבוססי תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מכירים אלפרדה קונג טאק צ'ונג על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם במהלך הניסויים בבעלי חיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiodarone | Mylan | - | - |
| Anaesthetic machines and respirator | Drager | Fabius plus XL | - |
| Angiocath | Becton Dickinson | 381147 | - |
| Anti-human nuclear antigen | abcam | ab19118 | - |
| Axio Plus image capturing system | Zeiss | Axioskop 2 PLUS | Axioskop 2 plus |
| AxioVision Rel. 4.5 software | Zeiss | - | - |
| Baytril | Bayer | - | enrofloxacin |
| Betadine | Mundipharma | - | - |
| CardioLab Electrophysiology Recording Systems | GE Healthcare | G220f | - |
| Culture media | MesenCult | 05420 | - |
| Cyclosporine | Novartis | - | - |
| Defibrillator | GE Healthcare | CardioServ | - |
| Dorminal | TEVA | - | - |
| Echocardiographic system | GE Vingmed | Vivid i | - |
| EchoPac software | GE Vingmed | - | - |
| Electrophysiological catheter | Cordis Corp | - | - |
| Embozene Microsphere | Boston Scientific | 17020-S1 | 700 μm |
| Endotracheal tube | Vet Care | VCPET70PCW | Size 7 |
| Ethanol | VWR chemicals | 20821.33 | - |
| Formalin | Sigma | HT501320 | 10% |
| IVC balloon Dilatation Catheter | Boston Scientific | 3917112041 | Mustang |
| JR4 guiding catheter | Cordis Corp | 67208200 | 6F |
| Lidocaine | Quala | - | - |
| Mersilk | Ethicon | W584 | 2-0 |
| Metoprolol succinate | Wockhardt | - | - |
| Microtome | Leica | RM2125RT | - |
| Mobile C arm fluoroscopy equipment | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | - |
| Pacemaker | St Jude Medical | PM1272 | Assurity MRI pacemaker |
| Pacemaker generator | St Jude Medical | Merlln model 3330 | - |
| Pressure-volume catheter | CD Leycom | CA-71103-PL | 7F |
| Pressure–volume signal processor | CD Leycom | SIGMA-M | - |
| Programmable Stimulator | Medtronic Inc | 5328 | - |
| PTCA Dilatation balloon Catheter | Boston Scientific | H7493919120250 | MAVERICK over the wire |
| Ramipril | TEVA | - | - |
| Sheath introducer | Cordis Corp | 504608X | 8F, 9F, 12F |
| Steroid | Versus Arthritis | - | - |
| Temgesic | Nindivior | - | buprenorphine |
| Venous indwelling needle | TERUMO | SR+OX2225C | 22G |
| Vicryl | Ethicon | VCP320H | 2-0 |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | - | - |
| Zoletil | Virbac New Zealand Limited | - | tiletamine+zolezepam |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131, e29 (2015).
- Hospital Authority. Hospital Authority Statistical Report 2013. , Hong Kong. (2013).
- Cung, T. T., et al. Cyclosporine before PCI in Patients with Acute Myocardial Infarction. The New England Journal of Medicine. 373 (11), 1021-1031 (2015).
- Liao, S. Y., et al. Proarrhythmic risk of embryonic stem cell-derived cardiomyocyte transplantation in infarcted myocardium. Heart Rhythm. 7, 1852-1859 (2010).
- Liao, S. Y., et al. Overexpression of Kir2.1 channel in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes attenuates posttransplantation proarrhythmic risk in myocardial infarction. Heart Rhythm. 10, 273-282 (2013).
- Liu, Y., et al. Thoracic spinal cord stimulation improves cardiac contractile function and myocardial oxygen consumption in a porcine model of ischemic heart failure. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 23, 534-540 (2012).
- Liao, S. Y., et al. Improvement of Myocardial Function Following Catheter-Based Renal Denervation in Heart Failure. JACC: Basic to Translational Science. 2 (3), 270-281 (2017).
- Liao, S. Y., et al. Remodelling of cardiac sympathetic re-innervation with thoracic spinal cord stimulation improves left ventricular function in a porcine model of heart failure. Europace. 17 (12), 1875-1883 (2015).
- Daehnert, I., Rotzsch, C., Wiener, M., Schneider, P. Rapid right ventricular pacing is an alternative to adenosine in catheter interventional procedures for congenital heart disease. Heart. 90 (9), 1047-1050 (2004).
- Hála, P., et al. Tachycardia-Induced Cardiomyopathy as a Chronic Heart Failure Model in Swine. Journal of Visualized Experiments. (132), e57030 (2018).
- Santoso, T., et al. Endomyocardial implantation of autologous bone marrow mononuclear cells in advanced ischemic heart failure: a randomized placebo-controlled trial (END-HF). Journal of Cardiovascular Translational Research. 7, 545-552 (2014).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network. Effect of intracoronary delivery of autologous bone marrow mononuclear cells 2 to 3 weeks following acute myocardial infarction on left ventricular function: the LateTIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 306, 2110-2119 (2011).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network (CCTRN). Effect of the use and timing of bone marrow mononuclear cell delivery on left ventricular function after acute myocardial infarction: the TIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 308, 2380-2389 (2012).
- de Jong, R., Houtgraaf, J. H., Samiei, S., Boersma, E., Duckers, H. J. Intracoronary stem cell infusion after myocardial infarction. A meta-analysis and update on clinical trials. Circulation: Cardiovascular Interventions. 7, 156-167 (2014).
- Nowbar, A. N., et al. DAMASCENE writing group. Discrepancies in autologous bone marrow stem cell trials and enhancement of ejection fraction (DAMASCENE): weighted regression and meta-analysis. British Medical Journal. 348, g2688 (2014).
- Kanelidis, A. J., Premer, C., Lopez, J., Balkan, W., Hare, J. M. Route of Delivery Modulates the Efficacy of Mesenchymal Stem Cell Therapy for Myocardial Infarction: A Meta-Analysis of Preclinical Studies and Clinical Trials. Circulation Research. 120 (7), 1139-1150 (2017).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112 (9 Suppl), I150-I156 (2005).
- Hu, X., et al. A Large-Scale Investigation of Hypoxia-Preconditioned Allogeneic Mesenchymal Stem Cells for Myocardial Repair in Nonhuman Primates: Paracrine Activity Without Remuscularization. Circulation Research. 118, 970-983 (2016).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Martens, A., et al. Substantial early loss of induced pluripotent stem cells following transplantation in myocardial infarction. Artificial Organs. 38, 978-984 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
