Summary
Vi beskriver en billedbehandlings metode til bestemmelse af den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af mEGFP-mærkede receptor-oligomerer induceret af ligand binding i plasma membranen af levende celler. Protokollen er baseret på total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke (N & B) analyse.
Abstract
På trods af betydningen og allesteds nærhed af receptor oligomerisering, få metoder er gældende for påvisning klyngedannelse begivenheder og måling af graden af klyngedannelse. Her beskriver vi en Imaging tilgang til at bestemme den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af mEGFP-mærkede-receptor homokomplekser i membranen af levende celler. Protokollen er baseret på total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke (N & B) analyse. N & B er en metode, der svarer til fluorescens-korrelations spektroskopi (FCS) og foton-optællings histogram (PCH), som er baseret på den statistiske analyse af svingningerne i fluorescens intensitet af fluorophorer, der spredes ind og ud af en belysning volumen i løbet af observationstiden. Navnlig er N & B en forenkling af PCH for at indhente oplysninger om det gennemsnitlige antal proteiner i oligomeriske blandinger. Amplituder for intensitets udsving er beskrevet af fluoroforet molekyle lysstyrke og det gennemsnitlige antal fluorophorer inden for belysnings volumenet. N & B betragter således kun første og andet øjeblik af amplitude fordelingen, nemlig den gennemsnitlige intensitet og variansen. Dette er på samme tid, styrken og svagheden af metoden. Da der kun tages hensyn til to øjeblikke, kan N & B ikke bestemme den molære fraktion af ukendte oligomerer i en blanding, men den anslår kun den gennemsnitlige oligomeriserings tilstand for blandingen. Ikke desto mindre kan det anvendes til relativt små tidsserier (sammenlignet med andre moment metoder) af billeder af levende celler på en pixel-for-pixel basis, blot ved at overvåge tids udsving i fluorescens intensitet. Det reducerer den effektive time-per-pixel til et par mikrosekund, tillader erhvervelse i tidsinterval af sekunder til millisekunder, hvilket er nødvendigt for hurtig oligomerisering kinetik. Endelig kan store celleområder såvel som sub-cellulære rum udforskes.
Introduction
Vi beskriver en samlet intern refleksion fluorescens-antal og lysstyrke (TIRF-N & B) Imaging tilgang til bestemmelse af den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af receptor molekyler i plasma membranen af levende celler, sigter mod at forbinde receptoren forsamling dynamik til proteinerne biologiske funktion (figur 1).
Ved ekstracellulær ligand binding initierer receptorer det intracellulære signal transduktion afhængigt af deres kropsbygning, oligomerisering, potentielle Co-receptorer og membran sammensætning. På trods af betydningen og allesteds nærende receptor oligomerisering, anerkendt som en vigtig begivenhed i cellulære signalering1,2,3,4,5,6, 7, få metoder kan detektere klyngedannelse begivenheder og måle graden af klyngedannelse eksperimentelt8,9. Den confokale volumen (x, y ≈ 300 Nm, z ≈ 900 nm) er utilstrækkeligt løst til at bevise molekylære interaktion og støkiometri, selv efter optimering af billedet restaurering algoritmer10. Under enheds sammensætningen af protein oligomerer kan ikke løses på et rent geografisk grundlag, selv ved super opløsnings metoder ved x, y-opløsning på 20-70 nm såsom PALM11, storm12og sted13. Desuden kan deres tidsmæssige opløsning (i rækkefølgen af minutter pr. billede) ikke følge kinetikken i intervallet fra sekunder. Enkelt molekyle Step-blegning løser kun støkiometri af protein oligomerer, hvis de er immobile14.
En af de mest alsidige metoder til at måle tæthed og oligomerisering af fluorescently mærkede proteiner inden for enkeltbilleder er den rumlige intensitets fordelings analyse (SpIDA), som er afhængig af rumlig prøvetagning. Det gælder både kemisk faste og levende celler, og gør det muligt at analysere flere områder af interesse for cellen samtidig ved hjælp af standard Fluorescens mikroskopi15. Alternativt, moment metoder, såsom fluorescens-korrelations spektroskopi (FCS)16, photon Counting histogram (PCH)17, og tal og lysstyrke (N & B)18,19, er egnet til kvantitativ oligomer Målinger. Disse metoder analyserer fluorescens intensitets udsving, der kan observeres i tide, når fluorophorerne diffus ind og ud af en belysnings volumen. Amplituder af intensitets svingningerne kan entydigt beskrives ved den molekylære lysstyrke af fluoroforet (ε) og det gennemsnitlige antal fluorophorer (n) i belysnings volumenet17 (figur 2). Typisk kan diffusions koefficienten for fluorophorerne og det gennemsnitlige antal molekyler (omvendt relateret til G (0)-værdien) inden for belysnings volumenet opnås af FCS20. Men da diffusions tiden kun skalerer med den kubiske rod af massen, er FCS ikke tilstrækkelig følsom til at påvise ændringer i molekylmasse21. I praksis kan en enkelt farve FCS ikke detektere dimerisering af membranreceptorer. PCH løser blandinger af forskellige oligomerer nøjagtigt. Ved hjælp af mere end to øjeblikke af amplitude fordelingen, det registrerer molekyler af forskellig lysstyrke, der indtager den samme belysning volumen. Scanning FCS22 og udviklinger, såsom den interessante par-korrelation af Molekylær lysstyrke (pcomb) tilgang23, indført for at udvide anvendelsesområdet for fluorescens korrelations metoder i biologiske systemer24 , forblive enkelt punkt metoder, der mangler evnen til hurtige målinger i et stort område af en celle, kræver mange på hinanden følgende observationer på hver pixel og data erhvervelse i rækkefølgen af sekunder.
N & B er en forenklet version af PCH, der kun betragter det første og andet øjeblik af amplituden i fluorescens fordelingen, nemlig den gennemsnitlige intensitet, < I >, og variansen, σ2 (figur 2)18,19 og på grund af dette, kan den ikke bestemme den molære fraktion af ukendte oligomerer i en blanding, men anslår kun den gennemsnitlige oligomeriserings tilstand af blandingen. Ikke desto mindre har N & B den fordel at arbejde med relativt mindre tidsserier af billeder af levende celler end PCH på en pixel-for-pixel basis, blot ved at overvåge udsving på tidspunktet for fluorescens intensitet. Da N & B reducerer tiden pr. pixel til nogle få mikrosekunder, kan den følge en hurtig oligomeriserings kinetik over store celleområder, hvilket giver mulighed for at erhverve billeder på en tidsskala i sekunder i mikroskopi af raster scanning (f. eks. confocal, 2-photon) og millisekunder i Kamerabaseret mikroskopi (f. eks. TIRFM).
Flere rapporter har vist, at N & B er i stand til at kvantificere antallet af under enheder i protein klynger ved at afbilde udvidede celleområder. Der blev fundet paxillin-EGFP-klynger på vedhæftnings stederne i CHO-K1-cellerne25, og den intracellulære sammenlægning af det patogene Httex1p peptid blev beskrevet i cos-7-cellerne26. N & B blev ansøgt om at følge den ligand-drevne oligomerisering af ErbB-receptoren27og virkningen af ligand-FGF21 på Klothob (klb) og FGFR1c i Hela-cellerne28. Kombinationen af TIRF Imaging og N & B analyse blev brugt til at vise, at dynamin-2 primært er tetrameric i hele cellemembranen29. Vi anvendte N & B til både raster scanning og tirf billeder til at bevise ligand-drevet denne af uPAR og FGFR1 celle membranreceptorer30,31.
Fluorescens korrelations metoder, såsom N & B, FCS og PCH, er baseret på forestillingen om, at antallet af partikler i et åbent volumen følger en Poisson-fordeling. Da kun de fotoner, som fluorophorerne udsender, kan påvises, er middelværdien for en målt fluorescens intensitet versus tid i en pixel i billedet 
, produktet af det gennemsnitlige antal fluorophorer i belysnings volumen n og deres Molekylær lysstyrke, ε17:
hvor ε udtrykkes som antallet af fotoner, der udsendes pr. tidsenhed (konventionelt pr. sekund) pr. molekyle, når molekylet er i midten af belysnings volumenet.
Lysstyrke er en egenskab for hver fluoroforet i en given erhvervelse oprettet, mens intensitet er summen af alle bidrag fra alle fluorophorer. I biologiske konkurrencer, vil lysstyrken stige med stigningen i antallet af fluorophorer, der svinger sammen, giver oplysninger om oligomerisering tilstand af fluorescently-mærkede protein. Udsvingene amplituder ved en given pixel måles fra variansen af fluorescens signalet, σ2:
Hvor middelværdien af kvadratet af intensitet 
,, og kvadratet af middelværdien af 
intensitet, er beregnet ud fra de individuelle intensitetsværdier i hver pixel i hver ramme:
hvor K er antallet af samlede rammer i tidsserierne. Eksperimentelt er det nødvendigt at beregne variansen for hele billedserien, der beskriver spredningen af de individuelle intensitetsværdier ved hver pixel i et enkelt billede omkring middelintensitets værdien. Variansen omfatter alle udsving af forskellig oprindelse. Ved første tilnærmelse kan variansen på grund af sprede-partiklerne i belysnings volumenet, σ20, adskilles fra variansen på grund af detektor støjen, σ2d. De to afvigelser er uafhængige; således, den samlede varians er givet ved deres sum:
Variansen på grund af molekylære udsving i og ud af detekterings volumenet er lineært afhængigt af den molekylære lysstyrke og intensitet:
Omarrangering af EQ. 6 ifølge EQ. 1:
Ifølge den typiske koncept i fluorescens korrelations spektroskopi, ligning 7 hedder det, at variansen på grund af antallet af udsving afhænger af kvadratet af partikel lysstyrken.
Variansen på grund af detektor udsving er derefter en lineær funktion af den detekterede intensitet under den antagelse, at detektoren drives under dens mætningsgrænse19:
I tilfælde af foton tælle detektorer a= 1 og c= 0, således detektor variansen er lig med den gennemsnitlige intensitet:
For at anvende disse begreber til reelle målinger i levende celler, Gratton og kolleger18 definere den tilsyneladende lysstyrke, B, for hver pixel som forholdet mellem variansen over den gennemsnitlige intensitet:
B er den parameter, der måles eksperimentelt. I dette arbejde, tidsserie billeder af FGFR1 receptorer på plasma membranen af HeLa celler er fanget af TIRF mikroskopi og den gennemsnitlige tilsyneladende lysstyrke, B, bestemmes af N & B analyse. Derefter, efter tilsætning af FGF2, sammenhængende tidsserier er fanget for at følge ændringerne i den selv-samling af receptor molekyler i membranen overflade efter stimulation af receptoren med den kanoniske ligand.
Men da detektoren af TIRF mikroskop er et EMCCD-kamera, skal udtrykket for den tilsyneladende lysstyrke ændres som19:
hvor offset er den intensitets forskydning af detekterings elektronikken, der er karakteristisk for detektor indstillingerne. Variansen og den gennemsnitlige intensitet for en analog detektor angives henholdsvis ved:
hvor G er analog gevinst i digitale niveauer (DL/photons), S, de digitale niveauer per photon19, er givet ved hældningen af en intensitet versus varians plot for en lyskilde med konstant intensitet (ingen tidsmæssige udsving). Γ-faktoren er relateret til form af pixel detekterings volumen. Ifølge Hassler et al.32er γ faktoren lig med 0,3 for tirf-billeddannelse, der arbejder ved den maksimale gevinst ved detekterings kameraet19. Parametrene offset, S og G er egenskaber for kameraet og mikroskopet. Den tilsyneladende lysstyrke, B, opnås ved at omarrangere EQ. 11 i henhold til EQ. 12 og 13:
Eksperimentelt er ε en kompleks funktion af laser intensitet og systemets detekterings effektivitet. Da B/S ikke desto mindre er lineært afhængig af ε, er det kun vigtigt at bestemme den relative værdi af ε for en given detekterings tilstand:
hvor ε ' er proportional med ε. Alligevel udføres en kalibrering ved hjælp af en intern reference.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af prøver
- Dag 1. Frø HeLa celler i komplet medium i en koncentration på 100000-200000 celle/mL i glas-bund retter. Seed 6-8 replikater retter.
Bemærk: I dette eksempel suppleres mediet med 10% varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 100 U/100 μg penicillin/streptomycin. Flere replikater retter er tilberedt. - Dag 2-3. Når cellerne er ved sub-confluency, transficere halvdelen af retterne med protein plasmid og anden halvdel med reference plasmider (monomer og dimer), i serum-fri medium.
Bemærk: Transfection er lavet i serum frie medium suppleret med antibiotika, 0,1% kvægserum albumin og 25 mM HEPES buffer, uden phenol rød. - Dag 3-4. Kontroller, at de transficeret celler er klædet til bunden af retterne og cellemembranen er fluorescerende. Kassér tallerkner med overgroede celler eller med meget lav fluorescens.
Bemærk: Lad ikke cellerne over vokse. Cellerne skal fordeles godt og overholdes på parabol glas området (figur 1A). Præbelagte glasbund retter kan bruges til at favorisere celle vedhæftning. Cellekulturen testes for Mycoplasma kontaminering før et eksperiment. I dette eksempel transfteres cellerne med et (A207K) megfp-FGFR1 plasmid, og referencecellerne overføres med en GPI-(A207K) megfp og en GPI-(A207K) megfp-(A207K) megfp-plasmider ved hjælp af standardprotokoller. For levende celle mikroskopi anbefales et indikator frit medium; der tilsættes 25 mM HEPES-buffer for at forhindre pH-ændringer under billeddannelse.
2. TIRF Imaging — justering af laser linje og optimering af TIRF belysning
- Fire timer før eksperimentet aktiveres temperatur inkubator af mikroskopet ved 37 °C.
- Tænd mikroskop, computere og kameraer og vente på kameraerne til at nå den korrekte arbejdstemperatur.
Bemærk: Den arbejdstemperatur af kameraet, der anvendes i dette studie er-75 °C. - Placer en lille dråbe olie på målet. Sæt en prøve skål på plads. Luk dørene til inkubator og lad temperaturen af skålen ækvibrere (~ 10 min).
- Tænd for epifluorescens lampen og 488 nm-laseren.
- Vælg den epifluorescens kontrasttilstand for at udforske eksemplet og søge efter en celle for at fokusere fra det okulære.
Bemærk: Brugen af en fluorescerende lampe til at søge celler gennem okulær er ikke obligatorisk. En egnet laser linje kan bruges i stedet. - Vælg det rigtige filter til opsamling af den grønne emission gennem mikroskop kameraet (band pass ex 490/20 (500) band pass EM 525/50 eller lignende.
- Skift fra okulær til kamera porten (kamera #1 i figur 1) i epifluorescens tilstand, Afgræns fokus og Skift til tirf-tilstand. Epifluorescens-og TIRF-tilstande kan være navngives med en anden nomenklatur afhængigt af mikroskop mærket.
Bemærk: Der kan være problemer med at fokusere eller justere laseren, hvis der ikke er nogen fluorescerende markører på dækglas-grænsefladen. At justere laseren korrekt (afgørende for god TIRF), fokusere på coverslip. Det er ofte meget vanskeligt at afgøre, om dæksedlen er i fokus. Som et forslag, fokusere på kanterne af cellerne. - Aktivér automatisk justering efter anvisningerne fra TIRF mikroskopet.
Bemærk: Kort, for skridt fra 2,4 til 2,8, først finde cellerne gennem okulær og fokusere på dem, derefter sende emissionen til kameraets port af TIRF mikroskopet, re-fokus cellerne på mikroskopet computerskærmen og aktivere proceduren for laser justering. Tilpasningen består i at finde den kritiske vinkel, hvor belysningen bliver passive (figur 3). Kommercielle mikroskoper kan have lidt forskellige justerings protokoller og også være fuldt automatiseret; andre kan have et lille kamera til at lette visualisering af de kritiske vinkel betingelser. - Vælg en passende belysnings dybde, og Optimer retningen af det evanescerende felt (figur 3).
Bemærk: Indtrængnings dybden holdes konstant for alle betjeningselementer og prøver.
3. TIRF Imaging: Capture af tidsserien
- Definer en interesseregion (ROI) på mindst 256 x 256 pixels.
Bemærk: I denne opsætning, er Capture gjort med kamera #2 under software, der direkte styrer kun kameraet (Se figur 1 legende). - Indstil eksponeringen til 1 MS og EM Gain til 1.000 (dette er G-faktoren i EQ. 12 og 13). Ved en sådan hastighed kan det være nødvendigt at justere eller øge laser strømmen. Her laser effekt er 0,5 mW.
Bemærk: Afhængigt af kameraets type og de grænser, der er fastsat af diffusions koefficienten af proteinet, fluorescens intensitet og baggrund, er de generelle kriterier for indstilling af laser kraften ikke at mægle detektoren, minimere foto blegning og fange som hurtigt som muligt på et rimeligt S/N. EM Gain er altid indstillet til maksimum af kameraet (Se indledning). - Kør en første prøve sekvens under de oprindelige betingelser, og Vurder nogenlunde S/N-værdien. Betingelserne er acceptable ved S/N = 2-3 eller højere, målt i første ramme af første gangs serie.
- Brug skyderen for emissions splittende system, der forbinder kamera #2 til mikroskopet til at maskere en side af billedet (figur 1B, figur 4a-b)
Bemærk: I denne opsætning er en multikanals Imaging Connector installeret på kamera #2 for at muliggøre erhvervelse af to rumligt identiske billeder samtidigt. Systemet er udstyret med slides til montering af forskellige emissions filtre. En af skyderne monterer en sort maske til at dække en side af billedet. Det afmaskede område anvendes til intern kalibrering af hver tidsserie for at bestemme kameraets parametre (EQ. 12 og EQ. 13). På denne måde er der ikke behov for en uafhængig kalibrering trin og, vigtigere, kalibrering udføres parallelt med opsamling af hver tidsserie. I mangel af dette system, kan kameraet kalibreres anvende offentliggjorte protokoller33. - Vælg indstillingen automatisk lagring af kamera filer.
- Start købet af billedserien. Få mindst 700 rammer ved et minimum S/N-forhold på 2.
Bemærk: Antallet af rammer, der er nødvendige for analysen, afhænger af prøve stabiliteten til foto blegning og af spredningen af dataene. Derfor vurderes kvaliteten af hver tidsserie under N & B-analysen. - Uden at tage skålen ud af mikroskopet, tilsæt ligand.
- Vælg en celle med en lys fluorescens membran og hurtigt starte første gang serie af kinetiske Run.
Bemærk: Hvis tilføjelsen af ligand sker hurtigt, indstiller denne første optagelse punktet = 0 tid af ligand Kinetics. Softwaren registrerer det nøjagtige tidspunkt for optagelsen. - Søg en anden celle og erhverve den anden gang punkt af kinetikken.
Bemærk: Point-Visiting rutiner er tilgængelige i nogle mikroskoper udstyret med x, y, z motoriserede etaper. Disse tillader memorisering af flere positioner på cellen skålen, og kan hjælpe med at holde en mere konstant tidsinterval mellem billedserie på forskellige celler. - Fang en ny celle for hvert tidspunkt i den kinetiske løbetur.
Bemærk: Efter indfangning er en celle delvist fotobleget, og den kan ikke re-imaged. På grund af det, er kinetikken opnået ved at kombinere tidsserier af mange celler, hver fanget på et andet tidspunkt. - For hver ny skål skal du gentage protokollen fra trin 2,3 til 3,9.
Bemærk: For reference fade tilsættes en volumen af køretøjet (PBS suppleret med 0,01% bovint serumalbumin) svarende til det, der anvendes til ligand.
4. antal & lysstyrke (N & B): kvalitetskontrol af tidsserierne
- Konverter og Gem som. TIFF de filer, som er anskaffet med kamerasoftwaren (. sif-filer i dette eksempel).
- Importere. TIFF-filer i analysen software rutine ved at aktivere N & B grafisk brugergrænseflade (GUI) MATLAB.
Bemærk: Der anvendes en tilpasset MATLAB eksekverbar N & B-rutine her (N & B-analyse på https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Ved at åbne en importeret. TIFF-fil, genererer rutinen det gennemsnitlige intensitets billede, den gennemsnitlige intensitets profil, og det gør det muligt at inspicere serien ramme for ramme (supplerende figur 1). Der findes anden software til N & B-analyse (f. eks. SimFCS-software). - Kassér serier, hvor den gennemsnitlige intensitets profil viser mere end 10% foto blegning, og serie, hvor der har været en tydelig celle membran forvrængning eller oversættelse under erhvervelsen.
- Beskære rammer, der tydeligvis er ude af fokus.
Bemærk: Et beskæringsværktøj implementeres i rutinen for at udsmid enkelte eller flere billeder i billedserien. Denne handling er tilladt, fordi frame-til-frame-tid ikke er kritisk, hvorimod pixel-opholdstid (eksponeringstid) er (Se diskussion). - Behold kun for den analyseserie med mindst 500 tidsrammer.
5. antal & lysstyrke (N & B): bestemmelse af kameraets parametre (forskydning, σ og S)
- Aktivér det rutinemæssige kalibrerings kamera.
- Vælg et område på mindst 20 x 50 pixels i området detektor støj (figur 4).
Bemærk: Rutinen stammer fra et histogram af værdierne (også defineret digitalt niveau, DL), og det returnerer en logaritme plot af frekvensen versus digitale niveauer. - I loggen frekvens versus digital niveau plot, flytte den lineære røde markør for at afgrænse Gaussian og den lineære del af kurven.
Bemærk: Den røde markør opdeler de to sektioner af kurven, og aktiverer rutine returnere offset, som er centrum for Gaussian funktion af kameraets respons, σ af Gaussian pasform, og S faktor, som er hældningen af den lineære del af kameraet respons e (figur 4C-D).
6. antal & lysstyrke (N & B): beregning af B-værdierne i udvalgte interesseområder (ROI)
- Aktiver B -tasten.
Bemærk: Denne handling genererer det gennemsnitlige intensitets billede (figur 5, første kolonne) og b-billedet, hvor hver enkelt b-værdi er knyttet til den relaterede pixel i billedet (supplerende figur 1). - Anvend en minimum-Binning (2 2) for at reducere spredningen af dataene og for at generere B-I-histogrammet (figur 5, anden kolonne).
Bemærk: B-I-histogrammet repræsenterer fordelingen af B-værdierne for alle pixel i billedet versus pixel intensiteten. Y = B/S; X = (
-offset)/S (supplerende figur 1 og EQ. 11 og 15). - Undersøg B-I-histogrammet ved hjælp af den interaktive firkant markør.
- Vælg et kvadrat ROI for analysen (figur 5, tredje kolonne).
Bemærk: Markøren synkroniserer en mobil maske på det gennemsnitlige intensitets billede og fremhæver de pixel, der er valgt inde i det firkantede markør område (supplerende figur 1). Ved denne inspektion er det muligt at udelukke baggrund og områder med meget lav intensitet fra analysen. - Generer B-Map for den valgte ROI (figur 5, fjerde kolonne).
- Gem ASCII-filen for de B-værdier, der er knyttet til markeringen.
- Importer ASCII-filen i en grafisk software for at beregne frekvensfordelingen af dataene og få den gennemsnitlige B-værdi ± S. E (figur 5, femte kolonne).
Bemærk: Hvis data er homogene, tilnærme frekvensfordelingen af B-værdierne en Gaussian fordeling. - Anvend EQ. 15 for at udlede den gennem
snit 
lige lysstyrke =-1 [(tæller/molekyle) pr. opholdstid] for hver celle på hvert tidspunkt af den kinetiske løbetur. Normaliser dataene i henhold til:
hvor
er den gennemsnitlige b-værdi målt til tiden "t" efter ligand addition 
, og er den gennemsnitlige b-værdi målt på tidspunktet t = 0 (10-20 s efter ligand addition).
Bemærk: Normaliseringen af resultaterne giver mulighed for direkte sammenligning af eksperimenter, der udføres på forskellige dage. Det kompenserer for forskelle i den målte lysstyrke på grund af laser effekt og tekniske udsving. - Afbild den normaliserede gennemsnitlige lysstyrke i forhold til anskaffelsestid for at opbygge den kinetiske kørsel (figur 6).
snit 
lige lysstyrke =-1 [(tæller/molekyle) pr. opholdstid] for hver celle på hvert tidspunkt af den kinetiske løbetur. Normaliser dataene i henhold til:
er den gennemsnitlige b-værdi målt til tiden "t" efter ligand addition 
, og er den gennemsnitlige b-værdi målt på tidspunktet t = 0 (10-20 s efter ligand addition).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne for to repræsentative HeLa-mEGFP-FGFR1-celler, der er seedet i samme dyrknings skål, er vist i figur 5 og supplerende tabel 1. De to celler blev fanget på tidspunktet 0 min (figur 5a, top) og 7 min (figur 5a, bund) efter tilsætning af FGF2 ligand.
Figur 5 viser også resultaterne af to repræsentative Hela-celler, som udtrykker enten den rene monomer, GPI-megfp (figur 5b, top) eller den kovalent forbundne DIKEMEJE fluorophore, GPI-Megfp-megfp (figur 5b, bund ), eksponeret ved cellemembranen og taget under de samme forsøgsbetingelser.
Den gennemsnitlige, tilsyneladende lysstyrke, B, i Hela-megfp-FGFR1-cellerne stiger fra 1,070 ± 0,001 S.E. til 1,141 ± 0,001 S.E., hvorimod reference mono (figur 5b, top) og dikemeje (figur 5b, bund) prøver returnerer B værdier på henholdsvis 1,070 ± 0,001 S.E. og 1,141 ± 0,001 S. E. Således, til sammenligning, den FGFR1 receptor er til stede hovedsagelig i den monomeriske form på cellemembranen overflade ved start, men det skrider frem mod en fremherskende dimeriske tilstand ved stimulation med sin kanoniske ligand FGF2. I gennemsnit er den fremherskende tilstand af de FGFR1 molekyler i de to repræsentative celler tydeligvis anderledes.
Ved at anvende analysen på flere celler i samme skål, som hver er fanget på et andet tidspunkt, opnås den gennemsnitlige lysstyrke som en funktion af tiden (figur 6a). Den kinetiske kørsel i figur 6a beskriver en langsom proces med dimerisering, der fortsætter i flere minutter ved cellens overflade. FGF2-induceret FGFR1 denne og efterfølgende internalisering af receptoren er en velkendt mekanisme34; Derfor er resultaterne i fuld enighed med det nuværende begreb om FGFR1 signaltransduktion, og bekræfte potentialiteten af TIRF-N & B tilgang til at studere oligomerisering af celle membran proteiner op til bestemmelse af subtile monomer-dimer dynamik.
Den normaliserede gennemsnitlige lysstyrke analyse af resultaterne er et egnet værktøj til at sammenligne effekten af forskellige ligander på den samme receptor. Et eksempel er givet i figur 6B. Protokollen blev gentaget ved hjælp af de samme standarder og stimulere cellerne med en ikke-Canonical FGFR1 ligand, NCAM-FC (50 μg/mL). I dette tilfælde afslører den kinetiske profil hurtige og cykliske overgange af receptoren i oligomeriske blandinger, som også når lysstyrkeværdier over dimerens. En normaliseret gennemsnitlig værdi på 3 observeres gentagne gange. Men begrænsningen af N & B analyse (kun to øjeblikke af intensiteten udsving versus tid er overvejet) ikke gør det muligt at påvise uden tvivl dannelsen af en trimert form. Den samme normaliserede gennemsnitlige lysstyrke kunne være resultatet af forskellige kombinationer af større oligomerer og monomerer af receptoren. Alligevel viser resultaterne tydeligt de rumlige forskelle i effekten af de to ligander på den samme receptor.
Figur 1: oversigt over forsøgsprotokollen. (A) cellerne er belagt på glasbund retter og transficeret med fluorescently Tagged receptor. (B) tidsserie billeder optages på et kommercielt tirf-mikroskop udstyret med et tirf 100x 1,46 olie objektiv og inkubator kammer. I denne kommercielle opsætning tillader softwaren ikke det indbyggede EMCCD-kamera #1 til at arbejde ved meget korte eksponeringstider, som er nødvendige for at erhverve N & B-tidsserier. Dette er et vigtigt punkt, da eksponeringstiden begrænser rækken af molekylære diffusioner, der kan fanges. Jo kortere eksponeringstiden er, jo hurtigere er den molekylære diffusion, der kan analyseres. Eksponeringer, der spænder fra 0,5 til 1 MS, er tilstrækkeligt hurtige til membran protein diffusion. Derfor føjes et andet EMCCD-kamera (#2) til en ekstra port i mikroskopet for at arbejde direkte under kameraets software, uden at mikroskop softwaren omgås. I denne tilpassede konfiguration bruges mikroskop softwaren og kamera #1 kun til TIRF-justering. TIRF Time Series er derefter erhvervet ved hjælp af kamera #2, der kører ved meget korte eksponeringstider såsom 1 MS og ved den maksimale EM gevinst. Kamera #2 har også en pixelstørrelse på 124 nm, der giver mulighed for oversampling og Binning af billederne (Se protokol afsnit 6,2). Andre konfigurationer for at få billeddannelse hastighed er muligt, afhængigt af egenskaberne ved forskellige TIRF mikroskoper, hvorimod brugen af sCMOS kameraer er ikke tilrådeligt, fordi støj ikke er tilfældig i billedet35. C) efter indfangning inspiceres tidsserierne som kvalitetskontrol. Serien kasseres, hvis foto blegning er højere end 10%, da det kan bestemmes ved at afbilde den gennemsnitlige ramme intensitet versus rammenummer. Serien kasseres også, hvis der har været en tydelig forvrængning af cellemembranen eller oversættelsen af cellen under erhvervelsen. D) den gennemsnitlige intensitet i hver pixel gemmes. (E) et b-i-histogram, der repræsenterer den tilsyneladende lysstyrke, b, i hver pixel i billedet genereres. (F) B-i-histogrammet bruges til at vælge et ROI, der er over baggrunden. G) frekvensfordelingen af b-værdierne analyseres for at bestemme den gennemsnitlige b-værdi ± S.E. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: N &Amp; B-princippet. N & B kvantificerer den gennemsnitlige oligomeriserings tilstand for fluorophorer ved at måle de fluorescens udsving, der opstår, når de bevæger sig ind og ud belysnings volumenet under erhvervelsen af en tids stak serie af "K"-billeder. Amplituden af svingningerne er karakteriseret statistisk ved at beregne forholdet mellem variansen af det svingende signal, σ2, og den gennem snitlige intensitetsværdi. I det enkleste scenarie (A), når belysnings volumenet er tomt (dvs. ingen fluorophorer), beskriver forholdet instrument støj. Hvis fluorescens signalet svinger på grund af mobile fluorophorer (B, C), er den "ekstra" varians direkte proportional med den molekylære lysstyrke, ε (detekteret foton tæller pr. molekyle og pr. sekund) af de diffus molekyler. I (B) er der 8 monomere sprede fluorophorer og i (C), de samme fluorophorer diffus som 2 tetrameric oligomerer. I disse to tilfælde er den gennemsnitlige intensitet den samme, men standardafvigelsen og lysstyrken er forskellige (1ε, 4ε), fordi amplituder af svingningerne er forskellige. ε = 0, når fluorophorer er immobile eller fraværende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: TIRF-mikroskopi. Selv om N & B kører lige godt med raster scanning mikroskoper udstyret med multiphoton, kontinuerlig bølge eller pulserende enkelt foton lasere og analoge eller foton tælle detektorer, TIRF mikroskopi er ideel til hurtig tidsmæssig billeddannelse af molekylære dynamiske hændelser, der indtræffer på eller i nærheden af celleoverfladen med hastigheder, opløsning og signal/støjforhold (S/N), som ikke er mulige at opnå med andre billeddannelsesteknikker. (A) tirf mikroskopi anvender princippet om total intern refleksion, hvorved en vinklet excitation laserlys begejstrer kun fluorophorer, der ligger lige under en glas vands grænseflade på dæksedlen. Laseren bestråler præparatet i en vinkel på forekomsten større end eller lig med den kritiske vinkel af refraktion mens excitation laser lys er helt afspejlet. Refleksionen genererer et meget tyndt elektromagnetisk felt i den prøve, der kaldes den passive bølge. Den resulterende fluorescerende lys, der udsendes af den lille belyste del af prøven er indsamlet gennem et mikroskop mål placeret vinkelret nedenfor til diaset. B) panelet viser et repræsentativt eksempel på en given bølgelængde af den relative intensitet af et passive felt versus dybde, som aftager eksponentielt med stigende afstand fra overfladen, hvilket giver en fluorescens med høj aksial opløsning Billeder. Den laterale opløsning indstilles af den numeriske blænde og forstørrelse af målet og af pixelstørrelsen på detekterings kameraet. Cellens interiør er ikke belyst, og det bidrager ikke til signalet med intracellulær autofluorescens. Multi-vinkel TIRF mikroskoper giver mulighed for at vælge forskellige penetration dyber. De giver en skala, der afhænger af excitation bølgelængde og normalt går fra 70 nm op til 250 nm dybde for enkelt farve TIRF billede. Den passive belysnings dybde valgt til denne protokol er 110 nm, og det er resultatet af et kompromis mellem nødvendigheden af at bruge lav laser effekt og intensiteten af fluorescens signalet, der falder skarpt med faldet i indtrængnings dybden. Det er vigtigt at undgå alt for store passive felter, der kan belyse mange intracellulære vesikler og intracellulære population af fluorophorer. Derfor, afhængigt af typen af prøve, flere penetration dybder bør udforskes, søger efter den bedste kombination: høj signal-til-støj-forhold, lav excitation magt, kort eksponeringstid, kort penetration dybde. Når denne optimering er gjort, indtrængnings dybden holdes konstant for alle kontroller og prøver. C) repræsentative epifluorescens-og tirf-billeder af en HELA-GPI-megfp-celle efter softwarestyret optimering af dybden og retningen af det evanescerende felt. Multi vinkel tirf mikroskoper giver også mulighed for at optimere retningen af det passive felt. Dette trin anbefales for at minimere spredning (dvs. skarp forøgelse af intensiteten og mindre skarpt billede), og det kan udføres i henhold til instruktionerne for det specifikke mikroskop, der anvendes. I denne protokol indeholder mikroskop softwaren en automatisk optimering af retningen af det evanescerende felt. For manuel optimering henvises til udgivne protokoller36,37. D) repræsentativ celle, som udtrykker megfp-FGFR1-konstruktionen i epifluorescens og efter optimering af tirf-belysningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: opsamling af tidsserier og kalibrering af kameraets respons på enkelt fotoner. (A) eksempel på den første ramme ud af 700-frame Time Series fanget på en Hela-MEGFP-FGFR1 celle i den beskårne sensor tilstand. Kamera chippen er delvist maskeret (Røde rektangler) ved hjælp af Dual View Connector installeret på TIRF mikroskopet (figur 1B). De interne kalibrerings områder genkendes i det gennemsnitlige intensitets billede (B) og behandles (C) til vurdering af kameraets parametre ved at afbilde Logfrekvensen versus digitale niveauer (D). Et analogt detekteringssystem, såsom et EMCCD-kamera, detekterer impulser af foto strøm i stedet for foton-tællinger, og foton Pulse højde fordelingen er kvasieksponentiel. Den første del af distributionen skyldes forstærkeren og analog-til-digital konverter og det bidrager med en Gaussian udlæsnings støj (variansen introduceret af signalet optagelse). Den mest befolkede kanal (dvs. den hyppigste værdi) af distributionen er forskydningen (EQ. 13). Ved hjælp af en lodret markør i et logplot adskilles den første del af fordelingen fra den eksponentielle anden del, over 250 DL, som repræsenterer det gennemsnitlige kamera respons på en enkelt foton (hældningen er S-faktoren i EQ. 12). Målingen af disse parametre gør det muligt at anslå tætheden af fotoner, der registreres under erhvervelsen. Tæller (DL) er i pseudo-farveskala. Pixel størrelse = 124 nm; Billedformat = 256x256 pixels, penetrations dybden af det passive felt ~ 110 nm; Kalibrering ROI #1 = 19x256 pixels; Kalibrering ROI #2 = 5x256 pixels. DL = digitale niveauer. Eksponering = 1 MS og EMGain (G-faktoren i EQ. 12, 13 og 14) = 1000. Bemærk, at kameraer, der arbejder i foton-optællingstilstand med baggrund, svarer til analoge detektorer med S = 1 (EQ. 12) og med σ2d og offset (EQ. 13) målt på samme måde som for et analogt system18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: N &Amp; B-analyse af FGFR1 oligomerisering. A) repræsentative resultater fra to Hela-celler i samme parabol, der udtrykker megfp-FGFR1 og optages til tiden 0 min (øverst) og 7 min (nederst) efter tilsætning af 20 ng/ml FGF2, og (B) to Hela-celler, der udtrykker reference konstrukterne GPI-megfp (øverst) og GPI-mEGFP-mEGFP (nederst). Hele analyse sekvensen viser (fra venstre mod højre): den gennemsnitlige intensitet af tidsserierne; Plot af alle B-værdier som en funktion af fluorescens intensitet, hvor farvekoden repræsenterer antallet af pixels med samme B-værdi i billedet og de rektangulære markører afgrænse området af interesse (ROI), baggrunden (BG) og regioner med meget lav intensitet (LI). Bemærk, at immobile fluorophores vil give B-værdi = 1, da der i fravær af udsving ε = 0; B-kort over det valgte ROI og det tilhørende B-fordelings histogram. B-Value-fordelingen er udstyret med en Gaussian-funktion (stiplet rød linje) til beregning af den gennemsnitlige, synlige lysstyrke, B (fuld rød linje) og fordelings statistikken (supplerende tabel 1) b-værdi = b ' = b/S (EQ. 15); Intensitet = ( - offset)/s; M = monomer; D = dimer; skala stænger = 10 mikron. RAW data Time Series i supplerende film 1, supplerende film 2, supplerende film 3og supplerende film 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: kinetik af FGFR1-oligomerisering induceret af ligand-aktivering. Repræsentative kinetiske kørsler beskrevet ved den normaliserede gennemsnitlige lysstyrke (EQ. 16) af HeLa-mEGFP-FGFR1 celler efter stimulation med 20 ng/mL FGF2 (A) eller 50 μg/ml Ncam-FC (B). Celler i samme skål blev fanget ved stigende tidspunkter, og den synlige gennemsnitlige lysstyrke, B ± S.E., blev beregnet ud fra B-fordelings histogrammer. Figuren er tilpasset med tilladelse fra Zamai et al. Journal of Cell Science (2019)31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: hurtig kinetik og data tolkning. Punktplot af alle normaliserede gennemsnitlige lysstyrkeværdier opnået fra replikate kinetiske kørsler, hvor HeLa-mEGFP-FGFR1-celler blev stimuleret enten med NCAM-FC (50 μg/mL) eller FGF2 (20 ng/mL). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: skærmbillede af analyse rutinen i MatLab. Skærmbillede af den grafiske brugergrænseflade N & B (GUI) MATLAB-rutine, der viser de indledende analyse trin: upload Time Series; beregne gennemsnitlig intensitets billede, beregnings intensitets profil, Compute B-map og B-I-histogram. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Parameter | GPI-mEGFP | GPI-mEGFP-mEGFP | mEGFP-FGFR1 (tid = 0 ') | mEGFP-FGFR1 (tid = 10 ') |
| Gaussian gennemsnitlig B-værdi | 1,070 | 1,141 | 1,070 | 1,141 |
| S.E. på den gennemsnitlige B-værdi | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,001 |
| S.D. af B-vaue-distributionen | 0,059 | 0,067 | 0,077 | 0,075 |
| 95% konfidensinterval for den gennemsnitlige B-værdi | 1,069 til 1,071 | 1,139 til 1,143 | 1,069 til 1,072 | 1,139 til 1,143 |
| S.D. af 95% konfidensintervallet for B-værdien | 0,058 til 0,060 | 0,065 til 0,069 | 0,075 til 0,079 | 0,073 til 0,078 |
| Tilpasning af Bevar | S.D. > 0 | S.D. > 0 | S.D. > 0 | S.D. > 0 |
| S.E. standardfejl; S.D. standardafvigelse | ||||
Supplerende tabel 1: tilsyneladende lysstyrke analyse. Der blev gennemført statistikker og gaussiske tilpasnings parametre for B-distributionerne i figur 5 . Den mindste firkantede Gaussian passer blev opnået under begrænsning af standardafvigelsen > 0 med X-Range automatisk valgt og maksimale iterationer = 1000. R-kvadrat: mEGFP-FGFR1 monomer = 0,9957, mEGFP-FGFR1 dimer 0,9940; GPI-mEGFP = 0,9985; GPI-mEGFP-mEGFP = 0,9970.
Supplerende film 1: Tidsserier af en HeLa-mEGFP-FGFR1-celle på tidspunktet = 0 minutter efter FGF2 stimulation (20 ng/mL i PBS suppleret med 0,01% BSA) vist i figur 5. Serien af 800 frames gengives ukomprimeret ved 7 fps. Billedformat = 256 x 256 pixels; pixelstørrelse = 124 nm; Det interne kalibreringsområde identificeres som mørke laterale bånd. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Supplerende film 2: Tidsserier vist i figur 5 i en Hela-MEGFP-FGFR1 celle på tid = 7 minutter efter FGF2 stimulation (20 ng/ml i PBS suppleret med 0,01% BSA) serien af 800 frames gengives ukomprimeret ved 7 fps. Billedformat = 256 x 256 pixels; pixelstørrelse = 124 nm; Det interne kalibreringsområde identificeres som mørke laterale bånd. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Supplerende film 3: Tidsserier vist i figur 5 i en HELA-GPI-megfp-celle efter tilsætning af køretøjet (PBS suppleret med 0,01% BSA). Serien af 1.000 frames gengives ukomprimeret ved 7 fps. Billedformat = 256 x 256 pixels; pixelstørrelse = 124 nm; Det interne kalibreringsområde identificeres som mørke laterale bånd. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Supplerende film 4: Tidsserier vist i figur 5 i en HELA-GPI-megfp-megfp-celle efter tilsætning af køretøjet (PBS suppleret med 0,01% BSA). Serien af 1.000 frames gengives ukomprimeret ved 7 fps. Billedformat = 256 x 256 pixels; pixelstørrelse = 124 nm; Det interne kalibreringsområde identificeres som mørke laterale bånd. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
N & B kræver flere forsigtighedsregler i valget af celle model og mærknings strategi. Den kan kun anvendes på levende celler, der forbliver stabilt overholdt under billed optagelsestiden. Ekstra udsving på grund af hele cellens stive forskydning kan håndteres med passende billede restaurering tilgange38. Men generelt, når en celle bevæger sig, cellemembranen også deforme, og struktur deformation, producerer store ekstra varians, introducerer alvorlig begrænsning til analyse af membran proteiner. I dette arbejde udtrykkes den fluorescerende konstruktion i HeLa-celle linjen, fordi konstitutiv FGFR1 er ubetydelig. Tilstedeværelsen af den konstitutive protein er en betingelse for at undgå, ellers blandede populationer af fluorescerende og ikke-fluorescerende receptor oligomerer ville sandsynligvis form. Derfor vil N & B-analysen, som kun er baseret på lysstyrken af den fluorescently-mærkede protein population, returnere et upålideligt skøn over den gennemsnitlige oligomeriske tilstand. Dette aspekt er især vigtigt, når du anvender N & B til at opdage receptor denne begivenheder, hvor lysstyrken kun stiger med en faktor 2, såsom FGFR1 denne i nærværelse af FGF2 ligand. I et sådant tilfælde kan tilstedeværelsen af blandede dimere helt skjule de denne hændelser detekterbare ved N & B. Kontaminering af fluorescerende oligomerer med ikke-fluorescerende konstitutive former er en af de potentielle faldgruber i enhver tilgang baseret på påvisning af fluorescens, medmindre det mærkede protein i vid udstrækning er overudtrykt. Oligomeriserings undersøgelser i forhold til protein overekspression giver dog anledning til bekymring for deres funktionelle betydning. Transitivt transficeret celler vil sandsynligvis have varierende niveauer af fluorescens (dvs. proteinkoncentration) og er nyttige til at teste uafhængigheden af den gennemsnitlige lysstyrke på proteinkoncentrationen, da N & B kan anvendes på en lang række koncentrationer, under forudsætning af lineær respons af detektoren (se definitionen af lysstyrken, EQ. 1).
En anden begrænsning er den støkiometriske mærkning af receptoren ved hjælp af en stabil fluoroforet i levende celler. Halo-Tags, fluorescerende proteiner (FP) eller andre kovalente fluorescerende Tags er passende etiketter for at opnå et nøjagtigt antal bundne fluorophorer pr. protein molekyle i cellen. For at reducere kompleksiteten af N & B-analysen bruger vi enten fluorescerende proteiner eller Halo-Tags, der giver en 1-til-1 fluorophore-til-protein-mærkning. FP valg skal være mono i moden form, der har en ubetydelig selv-Association tendens til, ellers kan fremkalde kunstig oligomerisering af FP-mærkede receptorer. I denne protokol bruger vi (A207K) megfp, fordi denne enkeltpunkts mutation afskaffer megfp-selv aggregerende tendens som tidligere vist31,39,40. Uanset mærknings strategien bør det fluorescently-mærkede protein kontrolleres for tilbageholdelse af den biologiske aktivitet i den valgte celle model, da funktionaliteten af de mærkede molekyler er afgørende for at forbinde oligomeriserings hændelser med receptor signalering. I vores model beviste vi autophosphorylering af fluorescerende (A207K) megfp-FGFR1 efter at have stimuleret de transficeret celler med receptoren ligand FGF231.
N & B er baseret på diffusion af molekyler i belysnings volumenet. Ved detektering af digitale kameraer skal eksponeringstid (dvs. pixel opholdstid i analog detektion, tDwell) være kort nok til, at én og kun én konfiguration af partikler i brændvidden er fanget. Dette er for at sige, at sandsynligheden for en fluoroforet ind eller ud af den oplyste volumen i løbet af eksponeringstid er meget lille. Eksponeringstid skal være kortere end fluoroforet Residence time (τD), som er den gennemsnitlige tid, en fluoroforet tilbringer i den oplyste volumen. Derfor, før du starter et N & B eksperiment, er det nødvendigt at have en vis forestilling om opholdstiden (eller diffusions koefficienten) af målproteinet, som i en første tilnærmelse, afhænger af subcellulære lokalisering og molekylmasse. Frame rate er den inverse af den tid, der er nødvendig for kameraet til at erhverve et billede og derefter helt læse, at billedet ud, og det er ofte, beregnes omtrent fra det samlede antal pixels og udlæsning sats, kombineret med eksponeringstid. Selvom frame rate ikke behøver at være hurtig, cyklus tid (tCycle), som er summen af frame rate og tid til at forberede erobringen af den næste ramme, kan påvirke analysen. Disse begrænsninger kan generaliseret som: t-cyklus > > t > > dbo. Hvis cyklustid er for hurtig, vil molekylerne ikke have bevæget sig mærkbart fra den ene ramme til den næste i den tid, og vil fremstå som immobile (B = 1). Men da der er brug for hundredvis af billeder til analysen, indstilles cykling så hurtigt som muligt (forøgelse eller formindskelse af billedformatet i antal pixels) for at undgå celle forskydninger og forvrængning af cellemembranen, der ville tilføje stor ekstra afvigelse i løbet af serien erhvervelse. I eksemplet med denne protokol er den langsomste cyklustid 22 MS, så 500 frames kan erhverves i 11 s.
Molekylær lysstyrke er ikke en absolut mængde; Det afhænger af de molekylære egenskaber af fluoroforet (tværsnit og Quantum udbytte), på den eksperimentelle opsætning (detektor og optik) samt på excitation betingelser såsom laser magt. Således giver tirf-N & B-tilgangen en tilsyneladende lysstyrke, og derfor er det afgørende at oprette en "reference celle model", der udtrykker en reference konstruktion med utvetydigt oligomerisk tilstand. Reference konstruktionen bærer det samme fluoroforet tag af proteinet under studiet [her, (A207K) megfp], og det lokaliserer i det samme subcellulære rum (her, plasma membranen). I dette arbejde bruger vi en glykosylphosphatidylinositol (GPI) forankret-(A207K) megfp konstruktion, som vi gentagne gange har vist at være en pålidelig monomerisk lysstyrke standard for celleoverflade receptorer mærket med samme fluoroforet30, 31.
En stor ulempe er forekomsten af fluoroforet foto blegning, der meget sandsynligt sker, når den samme celle gentagne gange udsættes for lys under en kinetisk kørsel, og fører til en undervurdering af oligomeriserings tilstand. For at forhindre, at lysstyrken kinetik opnås ved at kombinere den gennemsnitlige lysstyrke af forskellige celler hver fanget på et andet tidspunkt (figur 6). Dette er at sige, at i en petriskål hver celle er et andet tidspunkt for kinetikken og en Petri skål repræsenterer en hel kinetiske Run.
Når oligomeriserings dynamikken er hurtig og kompleks, såsom FGFR1 oligomerisering induceret af en ikke-Canonical ligand, NCAM31, profilen af den normaliserede gennemsnitlige lysstyrke versus tid kan være variabel og ustabil (figur 6B ). I et sådant tilfælde kan reproducerbarhed ikke bestemmes ved at læse replikat retter af celler på præcise tidspunkter, på grund af nødvendigheden af at flytte og fokusere på en ny celle hver gang, skal du vælge en ROI, Capture og inspicere/kassere tidsserier. Således kan reproducerbarhed evalueres med hensyn til kinetisk profil lighed og amplitude af lysstyrken ændringer.
En oversigt over resultaterne er præsenteret i figur 7. Scatter plottet illustrerer kun den gennemsnitlige lysstyrke målt i celler i samme skål og forsømmer tidspunktet for hver opsamling. I dette plot den store forskel induceret af de to ligander på oligomerisering tilstand af receptoren forbliver indlysende, selv om alle kinetiske oplysninger er fjernet. For begge eksperimenter (FGF2-versus NCAM-induceret oligomerisering) vil den konventionelle metode til bestemmelse af middelværdien ± S.D. for hver løbetur i figur 7 imidlertid føre til misvisende konklusioner, da de FGFR1 molekyler, der STIMULERES af FGF2 klart transit i to veldefinerede stater, mens NCAM inducerer ustabile og cykliske oligomeriske FGFR1 blandinger, der ikke ville være godt repræsenteret ved en gennemsnitlig ± S.D. værdi.
Sammenfattende, fra et eksperimentelt synspunkt, N & B kræver kun adgang til et mikroskop udstyret med en hurtig erhvervelse modul og en dedikeret software. Det protein af interesse kan mærkes med en række monomeriske fluorescerende proteiner eller organiske fluorophorer, men kvantitative målinger kræver flere betingelser, der skal opfyldes: støkiometrisk mærkning, reference lysstyrke standard, detektor kalibrering og ingen foto blegning. I denne sammenhæng er N & B-tilgangen et effektivt værktøj til at dechifrere den spatiotemporale oligomerisering af proteiner i levende celler. Endvidere raffinerer de seneste fremskridt i forbindelse med gensampling af rådata til løsning af den statistiske vægtning41 og kombinationen af fluorescens kryds korrelations spektroskopi med krydskorrelation n & B42 og forbedrer anvendeligheden af n & B-tilgang til proteinoligomeriserings-og interaktionsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
CNIC støttes af Ministeriet for Ciencia, Innovacion y Universidades og Pro CNIC Foundation, og er et Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Vi støttes også af den europæiske fond for regional udvikling (FEDER) "UNA Manera de hacer Europa". UC anerkender støtten fra Associazione Italiana Ricerca Sul Cancro, foreningen for international Cancer Research (nu kendt som Worldwide Cancer Research) og det italienske sundhedsministerium. A.T. anerkender "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" for delvist at støtte hans arbejde med PV Fellowship "Progetto Professionkend Ivano Becchi" 2011-2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Albumin from Bovine Serum 98% minimun | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A7906-100G | |
| DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 21063029 | Used serum free for microscopy |
| DMEM high-glucose GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10566-016 | Used for complete medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| Emission splitting system Photometrics DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10270106 | 10% inactivated supplement for complete medium |
| Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | uncoated, glass thickness 0.17 microns |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
| Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series | |
| Matlab Executable N&B routine | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg. |
| pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector | Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy | Zamai et al., 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA. | |
| Sodium pyruvate GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 1 mM supplement for medium |
| TransIt-LT1 Transfection Reagent | MirusBio LLC, Madison, WI, USA | MIR 2300 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 25200056 | |
| Type F Immersion liquid 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections |
References
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
- Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
- Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
- Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
- Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
- Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
- Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
- Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
- Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
- Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
- Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
- Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
- Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
- Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
- Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
- Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
- Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
- Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
- Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
- Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
- Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
- Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
- Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
- Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
- Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
- Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
- Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
- Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
- Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
- Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
- Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
- Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
