生細胞の形質膜におけるリガンド結合によって誘導されるmEGFPタグ付き受容体オリゴマーの平均オリゴマー状態の測定のためのイメージングアプローチについて説明する。このプロトコルは、数と明るさ(N&B)分析と組み合わせた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡に基づいています。
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この記事について
サマリー
要約
受容体オリゴマー化の重要性とユビキタスにもかかわらず、クラスタリングイベントを検出し、クラスタリングの程度を測定するための方法はほとんどありません。ここでは、生細胞の膜におけるMEGFPタグ付き受容体ホモ複合体の平均オリゴマー状態を決定するイメージングアプローチについて説明する。このプロトコルは、数と明るさ(N&B)分析と組み合わせた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡に基づいています。N&Bは、蛍光相関分光法(FCS)および光子計数ヒストグラム(PCH)に似た方法で、照明の中で拡散する蛍光強度の変動の統計的分析に基づいています。観測時間中の体積。特に、N&BはPCHの簡素化であり、オリゴマー混合物中のタンパク質の平均数に関する情報を得る。強度変動振幅は、蛍光色素の分子輝度と照明体積内の蛍光色素の平均数によって記述される。したがって、N&Bは振幅分布の第1と第2のモーメント、すなわち平均強度と分散のみを考慮します。これは、同時に、方法の強さと弱さである。2つの瞬間しか考慮されないため、N&Bは混合物中の未知のオリゴマーのモル分率を決定することはできませんが、混合物の平均オリゴマー化状態を推定するだけです。それにもかかわらず、蛍光強度の時間変動を監視するだけで、生細胞の画像の比較的小さな時系列(他のモーメント法と比較して)にピクセル単位で適用することができます。ピクセルあたりの有効時間を数マイクロ秒に短縮し、高速オリゴマー化動態に必要な秒からミリ秒までの時間範囲での取得を可能にします。最後に、大きな細胞領域と細胞下コンパートメントを探索することができます。
概要
我々は、受容体アセンブリの連結を目指し、生細胞の形質膜における受容体分子の平均オリゴマー状態を決定するための全内部反射蛍光数と輝度(TIRF-N&B)イメージングアプローチを記述する。タンパク質の生物学的機能に対するダイナミクス (図 1)
細胞外リガンド結合の際、受容体は、その立体構造、オリゴマー化、潜在的な共受容体および膜組成に応じて細胞内シグナル伝達を開始する。受容体オリゴマー化の重要性とユビキタス性にもかかわらず、細胞シグナル伝達1、2、3、4、5、6の重要な事象として認識される。 7、クラスタリングイベントを検出し、実験的にクラスタリングの程度を測定できる方法はほとんどありません。共焦点体積(x,y≥ 300 nm,z≥900 nm)は、分子相互作用および動....
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プロトコル
1. サンプル調製
- 1日目。ガラス底皿の100,000-200,000細胞/mLの濃度で完全な培地中の種子HeLa細胞。シード6-8は料理を複製します。
注:この例では、培地は10%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)、1mMピルビン酸ナトリウム、100 U/100 μgペニシリン/ストレプトマイシンで補充される。いくつかの複製料理が用意されています。 - 2-3日目。細胞が亜コンフルエンスの場合、タンパク質プラスミドで食器の半分をトランスフェクトし、後半を参照プラスミド(モノマーおよびダイマー)で、無血清培地でトランスフェクトする。
注:トランスフェクションは、フェノールレッドなしで、抗生物質、0.1%ウシ血清アルブミンおよび25 mM HEPES緩衝液を補充した血清フリー培地で行われる。 - 3-4日目。トランスフェクトされた細胞が皿の底に付着し、細胞膜が蛍光を発していることを確認します。過剰に生えた細胞や非常に低い蛍光を持つ料理を廃棄します。
注:細胞が過剰に成長しないようにしてください。細胞は十分に分布し、皿のガラス領域に付着する必要があります(図1A)。プレコーティングされたガラス底の皿は細胞の付着を支持するために使用することができる。細胞培養は、実験の前にマイコ....
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結果
同じ培養皿に播種された2つの代表的なHeLa-mEGFP-FGFR1細胞の結果を図5および補足表1に示す。2つの細胞は、FGF2リガンドを添加した後、時間0分(図5A、上)および7分(図5A、下)で捕捉した。
図5はまた、純粋なモノマー、GPI-mEGFP(図5B、上)、または共有結合二量体蛍光色素、GPI-mEGFP-mEGFP(図5B、
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ディスカッション
N&B では、セル モデルとラベリング戦略を選択する際に、いくつかの予防措置が必要です。画像のキャプチャ時間中に安定して付着したままの生細胞にのみ適用できます。セル全体の剛性変位による余分な変動は、適切な画像復元アプローチ38で処理され得る。しかしながら、一般に細胞が移動すると、細胞膜も変形し、構造変形が起き、大きな余分な分散を生じ、膜タンパク質の分析に重大な制限を生じる。この研究では、構成FGFR1は無視できるので、蛍光構築物はHeLa細胞株で発現される。構成タンパク質の存在は避けるべき条件であり、そうでなければ蛍光受容体オリゴマーと非蛍光受容体オリゴマーの混合集団が形成される可能性が高い。その結果、蛍光タグ付きタンパク質集団の明るさのみに基づくN&B分析は、平均オリゴマー状態の信頼性の低い推定を返します。この側面は、FGF2リガンドの存在下でFGFR1二量体化のような明るさが2倍だけ増加する受容体二量体化事象を検出するためにN&Bを適用する際に特に重要である。このような場合、混合ダイマーの存在は、N&Bによって検出可能な二量体化イベントを完全に隠すことができます。非蛍光構成形態を有する.......
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
CNICは、シエンシア省、イノバシオン・イ・ウニベルシダーデス、プロCNIC財団の支援を受けており、セベロ・オチョア・センター・オブ・エクセレンス(SEV-2015-0505)です。また、欧州地域開発基金(FEDER)「ウナ・マネラ・デ・ハーサー・エウロパ」の支援を受けています。UCは、アソシアツィオーネ・イタリアン・リケルカ・スル・カンクロ、国際がん研究協会(現在は世界がん研究)、イタリア保健省の支援を認めています。A.T.は、PVフェローシップ「プロゲット・プロイリタ・イヴァーノ・ベッキ」2011-2012で彼の作品を部分的にサポートした「フォンダツィオーネ・バンカ・デル・モンテ・ディ・ロンバルディア」を認めます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3色高速TIRF ライカAM TIRF MC倒立顕微鏡、SMI自動TIRFアライメント付き。顕微鏡には、ダイオード488nmレーザー、100x 1.46オイルTIRF対物レンズ、490/20および525/50のEx/Emバンドパスフィルター、温度/CO2インキュベーター、Andor DU 8285 VP EMCCDカメラが装備されています。顕微鏡はライカLIFソフトウェアによって操作されます。 | ライカマイクロシステムズ、ウェッツラー、ドイツ | ||
| 牛血清からのアルブミン 98% minimun | Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン州、米国 | A7906-100G | |
| DMEM フェノールレッドなし 25 mM HEPES | GIBCO サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国 | 21063029 | 顕微鏡検査に使用された血清フリー |
| DMEM 高グルコース GlutaMAX I | GIBCO サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国 | 10566-016 | 完全な媒体 |
| に使用 ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| エミッション分割システム フォトメトリクス DV2 | TeledynePhotometrics, ツーソン, アリゾナ州, 米国 | ||
| 胎児ウシ血清, 認定, ブラジル | GIBCO サーモフィッシャーサイエンティフィック, ウォルサム, マサチューセッツ州, 米国 | 10270106 | 完全培地のための 10% 不活性化サプリメント |
| ガラス底部 35 mm 滅菌 1.5 皿 | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | コーティングなし、ガラス厚 0.17 ミクロン |
| GraphPad | Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
| ヒト子宮頸がん (HeLa), 無血清動物成分 (AC) 細胞 | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD(裏面照射型)ANDORカメラANDORソフトウェアによって制御され | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | カメラは、顕微鏡の追加ポートに取り付けられ、N&B 時系列 | |
| Matlab 実行可能ファイル N&B routine | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x | BiowhittakerInc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg. |
| pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector | Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy | Zamai et al., 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | リガンド溶液: 0.01%BSAを添加したPBS中の20 ng/mLのFGF2。 | |
| ピルビン酸ナトリウム GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 1 mM supplement for medium |
| TransIt-LT1 Transfection Reagent | MirusBio LLC, Madison, WI, USA | MIR 2300 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 25200056 | |
| Type F Immersion liquid 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | トランスフェクションに使用したフェノールレッドを含まない培地用 0.1% サプリメント |
参考文献
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al.
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再版と許可
