Summary
Vi beskriver en tenkelig tilnærming for fastsettelse av gjennomsnittlig oligomer tilstand mEGFP-Tagged-reseptor oligomers indusert av ligand binding i plasma membranen av levende celler. Protokollen er basert på total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinert med tall og lysstyrke (N & B) analyse.
Abstract
Til tross for viktigheten og ubiquity av reseptor oligomerisering, er det få metoder som gjelder for å oppdage klynge hendelser og måle graden av klynger. Her beskriver vi en tenkelig tilnærming for å bestemme den gjennomsnittlige oligomer tilstand mEGFP-Tagged-reseptor homocomplexes i membranen av levende celler. Protokollen er basert på total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinert med tall og lysstyrke (N & B) analyse. N & B er en metode som ligner på fluorescens-korrelasjon spektroskopi (FCS) og Foton telling histogram (PCH), som er basert på statistisk analyse av svingningene i fluorescens intensiteten av fluorophores spre inn og ut av en belysning volum under en observasjonstid. Spesielt er N & B en forenkling av PCH for å få informasjon om gjennomsnittlig antall proteiner i oligomer blandinger. Intensiteten svingninger amplituder er beskrevet av den molekylære lysstyrken på fluoroforen og gjennomsnittlig antall fluorophores innenfor belysning volum. Således, N & B vurderer bare første og andre øyeblikk av amplitude fordelingen, nemlig gjennomsnittet intensitet og varians. Dette er, på samme tid, styrken og svakheten av metoden. Fordi bare to momenter blir vurdert, kan N & B ikke bestemme molar brøkdel av ukjent oligomers i en blanding, men det bare anslår den gjennomsnittlige oligomerisering tilstand av blandingen. Likevel, det kan brukes til relativt liten tid serien (sammenlignet med andre øyeblikk metoder) av bilder av levende celler på en piksel-for-piksel basis, bare ved å overvåke tiden svingninger av fluorescens intensitet. Det reduserer effektiv tid per piksel til noen få mikrosekunder, slik at anskaffelse i tidsintervallet av sekunder til millisekunder, noe som er nødvendig for rask oligomerisering Kinetics. Til slutt kan store celleområder samt sub-cellulære rom utforskes.
Introduction
Vi beskriver en total intern refleksjon fluorescens-nummer og lysstyrke (TIRF-N & B) Imaging tilnærming for å bestemme den gjennomsnittlige oligomer tilstand reseptor molekyler ved plasma membranen av levende celler, med sikte på å knytte reseptoren forsamlingen dynamikk til biologisk funksjon av proteiner (figur 1).
Upon ekstracellulære ligand binding, reseptorer initiere intracellulære signal Transduction avhengig av deres konformasjon, oligomerisering, potensielle co-reseptorer og membran sammensetning. Til tross for viktigheten og ubiquity av reseptor oligomerisering, anerkjent som en viktig hendelse i mobilnettet signalering1,2,3,4,5,6, 7, få metoder kan oppdage Clustering hendelser og måle graden avClustering eksperimentelt. Den konfokalmikroskopi volum (x, y ≈ 300 NM, z ≈ 900 NM) er utilstrekkelig løst for å bevise molekylær interaksjon og støkiometri, selv etter optimalisering av bildet restaurering algoritmer10. Den sub-enhet sammensetning av protein oligomers kan ikke løses på en rent romlig basis, selv ved super-oppløsning metoder ved x, y oppløsning på 20-70 NM som PALM11, Storm12, og sted13. Videre kan deres timelige oppløsning (i størrelsesorden minutter per bilde) ikke følge Kinetics i løpet av sekunder. Enkelt molekyl trinn-bleking løser støkiometri av protein oligomers bare hvis de er Immobile14.
En av de mest allsidige metoder for å måle tetthet og oligomerisering av fluorescensmerkete merkede proteiner i enkeltbilder er den romlige intensitet distribusjon analyse (SpIDA), som er avhengig av romlig prøvetaking. Det gjelder både kjemisk faste og levende celler, og tillater analyse av flere regioner av interesse av cellen samtidig ved hjelp av standard fluorescens mikroskopi15. Alternativt, øyeblikk metoder, som fluorescens-korrelasjon spektroskopi (FCS)16, Foton opptellingen histogram (PCH)17, og antallet og klarheten (N & B)18,19, er egnet til kvantitativ oligomer Målinger. Disse metodene analyserer fluorescens intensitet svingninger som kan observeres i tid når fluorophores diffus inn og ut av en belysning volum. Amplituder av intensiteten svingninger kan være unikt beskrevet av den molekylære lysstyrken på fluoroforen (ε) og gjennomsnittlig antall fluorophores (n) innenfor belysning volum17 (figur 2). Vanligvis kan diffusjon koeffisient av fluorophores og gjennomsnittlig antall molekyler (omvendt relatert til G (0) verdi) innenfor belysning volumet fås ved FCS20. Men siden diffusjon tiden bare skalerer med kubikkroten av massen, er FCS ikke tilstrekkelig følsom for å oppdage endringer i molekylær masse21. I praksis kan én farge FCS ikke oppdage dimerization av membran reseptorer. PCH løser blandinger av forskjellige oligomers nøyaktig. Ved hjelp av mer enn to øyeblikk av amplitude fordelingen, oppdager det molekyler av ulik lysstyrke som opptar samme belysning volum. Skanning FCS22 og utvikling, slik som interessant par-korrelasjon av molekylær lysstyrke (pCOMB) tilnærming23, innført for å utvide omfanget av anvendelsen av fluorescens korrelasjons metoder i biologiske systemer24 , forbli enkelt punkt metoder mangler evnen til raske målinger i et stort område av en celle, som krever mange påfølgende observasjoner på hver piksel og datainnsamling i rekkefølgen av sekunder.
N & B er en forenklet versjon av PCH som bare vurderer første og andre øyeblikk av amplituden til den fluorescens fordelingen, nemlig gjennomsnittlig intensitet, < i > og variansen, σ2 (figur 2)18,19 og på grunn av det, kan det ikke bestemme molar brøkdel av ukjent oligomers i en blanding, men bare anslår den gjennomsnittlige oligomerisering tilstand av blandingen. N & B har imidlertid fordelen av å arbeide med relativt mindre tidsserier av bilder av levende celler enn PCH på piksel for piksel basis, ganske enkelt ved å overvåke svingningene på tidspunktet for fluorescens intensitet. Fordi N & B reduserer tiden per piksel til noen få mikrosekunder, kan den følge rask oligomerisering Kinetics over store celleområder, slik at bildeinnhenting på en tidsskala på sekunder i raster skanning mikroskopi (f.eks. konfokalmikroskopi, 2-Foton) og millisekunder i kamerabasert mikroskopi (f.eks. TIRFM).
Flere rapporter har vist evnen til N & B å kvantifisere antall under enheter i protein klynger av Imaging utvidede celleområder. Paxillin-EGFP klynger ble oppdaget ved vedheft steder i CHO-K1 celler25, og intracellulære aggregering av patogene Httex1p peptid ble beskrevet i cos-7 celler26. N & B ble søkt om etter den ligand-drevne oligomerisering av ErbB reseptor27, og effekten av ligand FGF21 på KLOTHOB (KLB) og FGFR1c i jakten på cellene28. Kombinasjonen av TIRF Imaging og N & B analyse ble brukt for å vise at dynamin-2 er primært tetramerisk gjennom hele cellemembranen29. Vi anvendt N & B å begge to raster skanning og TIRF profilen å bevise ligand-kjørt dimerization av uPAR og FGFR1 cellen membran reseptorer30,31.
Fluorescens korrelasjons metoder, slik som N & B, FCS og PCH, er basert på forestillingen om at okkupasjons antallet partikler i et åpent volum følger en Poisson-fordeling. Fordi bare fotoner at fluorophores avgir kan oppdages, gjennomsnittlig verdi for en målt fluorescens intensitet versus tid i en piksel av bildet, 
er produktet av gjennomsnittlig antall fluorophores i belysning volum, n, og deres molekylær lysstyrke, ε17:
der ε uttrykkes som antall fotoner som slippes ut per tidsenhet (konvensjonelt per sekund) per molekyl når molekylet er midt i belysnings volumet.
Lysstyrke er en egenskap ved hver fluoroforen i et gitt oppkjøp satt opp, mens intensiteten er summen av alle bidrag fra alle fluorophores. I biologiske konkurranser vil lysstyrken øke med økningen av antall fluorophores som svinger sammen, noe som gir informasjon om oligomerisering tilstand av det fluorescensmerkete proteinet. Svingningene amplituder ved en gitt piksel måles fra variansen i fluorescens signalet, σ2:
Der gjennomsnittet av kvadratet av intensitet, 
og kvadratet av gjennomsnittet av intensitet, 
er beregnet fra de enkelte intensitet verdier i hver piksel i hver ramme:
der K er antallet totale del bilder i tidsserien. Eksperimentelt, er det nødvendig å beregne for hele bildet serien variansen som beskriver spredningen av de enkelte intensitet verdier på hver piksel i et enkelt bilde rundt gjennomsnittet intensitet verdi. Variansen omfatter alle svingninger i ulik opprinnelse. I en første tilnærming kan variansen som skyldes de spre partiklene i belysnings volumet, σ20, skilles fra variansen på grunn av at detektoren skjøt støy, σ2d. De to avvikene er uavhengige. Dermed blir den totale variansen gitt av deres sum:
Variansen, på grunn av molekylære svingninger inn og ut av deteksjons volumet, er lineært avhengig av molekyl lysstyrke og intensitet:
Omorganisere EQ. 6 i henhold til EQ. 1:
Ifølge den typiske konseptet i fluorescens korrelasjon spektroskopi, ligningen 7 fastslår at variansen på grunn av antall svingninger avhenger av kvadratet av partikkel lysstyrken.
Deretter er variansen på grunn av detektor svingninger en lineær funksjon av den oppdagede intensiteten, under forutsetning av at detektoren betjenes under metnings grensen19:
Når det gjelder Foton telle detektorer a= 1 og c= 0, dermed detektor avviket er lik den gjennomsnittlige intensiteten:
For å anvende disse begrepene på reelle målinger i levende celler, Gratton og kolleger18 definere den åpenbare lysstyrken, B, for hver piksel som forholdet mellom variansen over gjennomsnittlig intensitet:
B er parameteren som måles eksperimentelt. I dette arbeidet, tid serie bilder av FGFR1 reseptorer på plasma membranen av HeLa celler er fanget av TIRF mikroskopi og den gjennomsnittlige tilsynelatende lysstyrken, B, bestemmes av N & B-analyse. Deretter, etter tilsetning av FGF2, er påfølgende tidsserier tatt for å følge endringene i selv-montering av reseptoren molekyler i membranen overflaten etter stimulering av reseptoren med den kanoniske ligand.
Men siden detektoren til TIRF-mikroskopet er et EMCCD-kamera, må uttrykket for den tilsynelatende lysstyrken endres som19:
der forskyvning er intensiteten forskyvning av deteksjons elektronikken som er karakteristisk for detektor innstillingene. Variansen og gjennomsnittlig intensitet for en analog detektor er henholdsvis gitt av:
der G er analog gevinst i digitale nivåer (DL/fotoner), S, den digitale nivåer per Foton19, er gitt ved skråningen av en intensitet versus varians tomten for en lyskilde med konstant intensitet (ingen timelige svingninger). Den γ faktoren er knyttet til formen på piksel deteksjons volumet. Alt etter Hassler et al.32, det γ faktoren er lik å 0,3 for TIRF tenkelig arbeider for det maksimum fortjene av oppdagelsen kameraet19. Offset-, S-og G-parametrene er kjennetegn på kameraet og mikroskopet. Den tilsynelatende lysstyrken, B, oppnås ved å omorganisere EQ. 11 i henhold til EQ. 12 og 13:
Eksperimentelt, ε er en kompleks funksjon av laser intensitet og deteksjon effektiviteten av systemet. Likevel, siden B/S er lineært avhengig av ε, er det bare viktig å bestemme den relative verdien av ε for en gitt deteksjons modus:
der ε ' er proporsjonal med ε. Likevel utføres en kalibrering ved hjelp av en intern referanse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prøveforberedelse
- Dag 1. Seed HeLa celler i komplett medium ved en konsentrasjon på 100000-200000 Cell/mL i glass-Bottom retter. Seed 6-8 gjenskape retter.
Merk: I dette eksempelet suppleres mediet med 10% varme deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 100 U/100 μg penicillin/Streptomycin. Flere gjenskape retter er forberedt. - Dag 2-3. Når cellene er på sub-confluency, transfect halvparten av rettene med proteinet plasmider og andre halvdel med referanse plasmider (monomer og dimer), i serum fritt medium.
Merk: Transfeksjoner er laget i serum fritt medium supplert med antibiotika, 0,1% av storfe serum albumin og 25 mM HEPES buffer, uten fenol Red. - Dag 3-4. Kontroller at de transfekterte cellene er tilhenger til bunnen av rettene og cellemembranen er fluorescerende. Kast retter med overgrodd celler eller med svært lav fluorescens.
Merk: Ikke la cellene overgrow. Cellene må være godt fordelt og bli overholdt glass området på fatet (figur 1A). Precoated glassbunn retter kan brukes for å favorisere celle vedheft. Cellen kultur er testet for mycoplasma forurensning før noen eksperiment. I dette eksempelet er celler transfekterte med en (A207K) mEGFP-FGFR1 plasmider og referansecellene er transfekterte med en GPI-(A207K) mEGFP og en GPI-(A207K) mEGFP-(A207K) mEGFP plasmider ved hjelp av standardprotokoller. For levende celle mikroskopi anbefales et indikator fritt medium. 25 mM HEPES-buffer er lagt til for å hindre pH-endringer under bildebehandling.
2. TIRF Imaging-justering av laser line og optimalisering av TIRF belysning
- Fire timer før eksperimentet, Aktiver temperatur inkubator for mikroskopet ved 37 ° c.
- Slå på mikroskopet, datamaskinene og kameraene, og vent til kameraene har nådd riktig arbeidstemperatur.
Merk: Arbeidstemperaturen på kameraet som brukes i denne studien er-75 ° c. - Plasser en liten dråpe olje på målet. Sett en prøve parabolen på plass. Lukk dørene til inkubator og la temperaturen på parabolen likevekt (~ 10 min).
- Slå på epifluorescence lampen og 488 NM laser.
- Velg epifluorescence kontrastmodus for å utforske prøven, og søk i en celle for å fokusere på øye.
Merk: Bruk av en lysrør for å søke celler gjennom øye er ikke obligatorisk. En egnet laser linje kan brukes i stedet. - Velg riktig filter for å samle inn det grønne utslippet gjennom mikroskop kameraet (band pass ex 490/20 (500) band pass EM 525/50 eller lignende.
- Bytt fra øye til kamera porten (kamera #1 i figur 1) i epifluorescence modus, Juster fokuset og Bytt til TIRF-modus. Epifluorescence-og TIRF-moduser kan navngis med en annen nomenklatur, avhengig av merket til mikroskopet.
Merk: Det kan være problemer med å fokusere eller samkjøre laseren hvis det ikke er noen fluorescerende markører på dekkglass grensesnittet. For å justere laseren riktig (avgjørende for god TIRF), Fokuser på dekkglass. Det er ofte svært vanskelig å avgjøre om dekkglass er i fokus. Som et forslag, fokus på kantene av cellene. - Aktiver den automatiske justeringen ved å følge instruksjonene til TIRF-mikroskopet.
Merk: Kort, for skritt fra 2,4 til 2,8, først finne cellene gjennom øye og fokusere på dem, og deretter sende utslipp til kamera porten på TIRF mikroskop, re-fokusere cellene på mikroskopet dataskjermen og aktivere prosedyren for laser justering. Justeringen består i å finne den kritiske vinkelen der belysningen blir evanescent (Figur 3). Kommersiell mikroskop kan ha litt forskjellige justerings protokoller og også være helautomatisk; andre kan ha et lite kamera for å tilrettelegge for visualisering av kritiske vinkel forhold. - Velg en passende belysnings dybde og Optimaliser retningen til evanescent feltet (Figur 3).
Merk: Gjennomtrenging dybden holdes konstant for alle kontroller og prøver.
3. TIRF Imaging: fangst av Time Series
- Definer en region av interesse (ROI) på minst 256 x 256 piksler.
Merk: I denne satt opp, er fangst gjort med kameraet #2 underProgramvare som direkte styrer bare kameraet (se figur 1 Legend). - Sett eksponeringen til 1 MS og EM gevinsten til 1 000 (dette er G-faktoren i EQ. 12 og 13). Med en slik hastighet kan det være nødvendig å justere eller øke laser strømmen. Her laser kraft er 0,5 mW.
Merk: Avhengig av typen av kameraet og grensene pålagt av diffusjon koeffisient av proteinet, fluorescens intensitet og bakgrunn, de generelle kriteriene for å sette laseren makt er ikke å mette detektoren, minimere photobleaching, og fange så rask som mulig til en rimelig S/N. EM gevinsten er alltid satt til det maksimale av kameraet (se Innledning). - Kjør en første prøve sekvens under innledende forhold og grovt anslå S/N-verdien. Betingelsene er akseptable på S/N = 2-3 eller høyere, målt i det første bildet i første gangs serien.
- Bruk glidebryteren for utslipps kløyve systemet som kobler kameraet #2 til mikroskopet for maskering av en side av bildet (figur 1B, Figur 4a-B)
Merk: I denne sette opp en flerkanals Imaging Connector er installert på kameraet #2 for å muliggjøre oppkjøpet av to romlig identiske bilder samtidig. Systemet er utstyrt med sklier for montering av forskjellige utslipps filtre. En av glidebryterne monterer en svart maske for å dekke en side av bildet. Det maskerte området brukes til intern kalibrering av hver tidsserie, for å bestemme kamera parametrene (EQ. 12 og EQ. 13). På denne måten er det ikke behov for en uavhengig kalibrering trinn, og viktigst, er kalibrering utført parallelt med fangst av hver gang serien. I fravær av dette systemet, kan kameraet kalibreres søker publiserte protokoller33. - Velg alternativet for automatisk lagring av kamera filer.
- Start oppkjøpet av bildeserien. Anskaffe et minimum av 700 rammer på et minimum S/N ratio på 2.
Merk: Antallet rammer som er nødvendige for analyse, avhenger av prøve stabiliteten til photobleaching og spredningen av dataene. Kvaliteten på hver tidsserie vurderes derfor i løpet av N & B-analysen. - Tilsett ligand uten å ta fatet ut av mikroskopet.
- Velg en celle med en lys fluorescens membran og raskt starte første gang serien av kinetisk kjøre.
Merk: Hvis tillegg av ligand er gjort raskt, setter denne første fangst punktet = 0 tid av ligand Kinetics. Programvaren registrerer den nøyaktige tiden for innspillingen. - Søk i en annen celle og få andre gang punktet av Kinetics.
Merk: Point-Besøks rutiner er tilgjengelig i noen mikroskop utstyrt med x, y, z motoriserte etapper. Disse tillater memorization av flere posisjoner på cellen parabolen, og kan hjelpe i å holde en mer konstant intervall mellom bilde-serien på forskjellige celler. - Fang en ny celle for hvert gang punkt av kinetisk løpe.
Merk: Etter innspillingen er en celle delvis photobleached, og den kan ikke bli avbildet på nytt. På grunn av dette oppnås Kinetics ved å kombinere tidsserier for mange celler, som hver ble tatt med et annet tidspunkt. - For hver ny rett, gjenta protokollen fra trinn 2,3 til 3,9.
Merk: For referanse retter, legge til et volum av kjøretøyet (PBS supplert med 0,01% storfe serum albumin) tilsvarende som brukes for ligand.
4. tall & lysstyrke (N & B): kvalitetskontroll av tidsserien
- Konverter og lagre som. TIFF filene som ble anskaffet med kameraprogramvaren (sif-filer i dette eksemplet).
- Importere. TIFF-filer i analyseprogramvare rutine ved å aktivere N & B grafisk brukergrensesnitt (GUI) MATLAB.
Merk: En tilpasset MATLAB kjørbar N & B-rutine brukes her (N & B-analyse på https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Ved å åpne en importert. TIFF-fil, genererer rutinen gjennomsnittlig intensitet bildet, gjennomsnittlig intensitet profil og det kan inspisere serien ramme-for-Frame (supplerende figur 1). Annenprogramvare er tilgjengelig for N & B-analyse (f.eks. SimFCS-programvare). - Forkast serien der den gjennomsnittlige intensitet profilen viser mer enn 10% photobleaching, og serier der det har vært en tydelig celle membran forvrengning eller oversettelse under oppkjøpet.
- Beskjære rammer som er tydeligvis utenfor fokus.
Merk: Et Beskjæringsverktøy implementeres i rutinen for å forkaste én eller flere del bilder i bildeserien. Denne operasjonen er tillatt fordi ramme-til-ramme-tiden ikke er kritisk, mens piksel levetiden (eksponeringstid) er (se diskusjon). - Hold for analysen bare serien med minst 500 tidsrammer.
5. nummer & lysstyrke (N & B): bestemmelse av kamera parametre (offset, σ og S)
- Aktiver rutinemessig Kalibrer kamera.
- Velg et område på minst 20 x 50 piksler i detektor støy området (Figur 4).
Merk: Rutinen stammer et histogram av verdiene (også definert Digital Level, DL), og den returnerer en logaritmen plott av frekvens versus digitale nivåer. - I loggen frekvens versus digitalt nivå plot, flytte den lineære røde markøren for å avgrense Gaussian og den lineære delen av kurven.
Merk: Den røde markøren deler de to delene av kurven, og aktiverer rutinen tilbake offset, som er sentrum av Gaussian funksjon av kameraet respons, σ av Gaussian Fit, og S-faktoren, som er skråningen av den lineære delen av kameraet respons e (Figur 4C-D).
6. nummer & lysstyrke (N & B): beregning av B-verdier i valgt region-av-interesse (ROI)
- Aktivere B -tasten.
Merk: Denne handlingen genererer bildet for gjennomsnittlig intensitet (figur 5, første kolonne) og B-bildet der hver enkelt B-verdi er knyttet til den relaterte pikselen i bildet (tilleggs figur 1). - Påfør et minimum binning (2 2) for å redusere spredningen av data og for å generere B-I histogrammet (figur 5, andre kolonne).
Merk: Det B-I histogram representerer fordelingen av B-verdiene for alle bildepunkter i bildet kontra piksel intensiteten. Y = B/S; X = (
-offset)/S (supplerende figur 1 og EQ. 11 og 15). - Inspiser B-I histogram med den interaktive firkantede markøren.
- Velg et kvadrat ROI for analysen (figur 5, tredje kolonne).
Merk: Markøren synkroniserer en mobil maske på bildet med gjennomsnittlig intensitet, og fremhever bildepunktene som er valgt inne i det firkantede markør området (supplerende figur 1). Ved denne inspeksjonen, er det mulig å ekskludere fra analysen bakgrunnen og områder med svært lav intensitet. - Generer B-kart over den valgte AVKASTNINGEN (figur 5, fjerde kolonne).
- Lagre ASCII-filen for B-verdiene som er knyttet til det merkede området.
- Importer ASCII-filen i en grafisk programvare for å beregne frekvens fordelingen av data og få den gjennomsnittlige B-verdi ± S. E (figur 5, femte kolonne).
Merk: Hvis dataene er homogene, er frekvens fordelingen av B-verdiene tilnærmet en Gaussian-fordeling. - Påfør EQ. 15 for å utlede den gjennomsnittlige
lys 
styrken =-1 [(teller/molekyl) per botid] for hver celle på hvert tidspunkt av kinetisk løpe. Normalisere dataene i henhold til:
hvor
er den gjennomsnittlige b-verdi målt på tid "t" etter ligand tillegg, og 
er gjennomsnittlig b-verdi målt på tidspunktet t = 0 (10-20 s etter ligand tillegg).
Merk: Normalisering av resultatene tillater direkte sammenligning av eksperimenter som utføres i forskjellige dager. Den kompenserer for forskjeller i den målte lysstyrken på grunn av laser kraft og tekniske svingninger. - Tegn opp normalisert gjennomsnittlig lysstyrke kontra oppkjøpet tid til å bygge kinetisk kjøre (figur 6).
lys 
styrken =-1 [(teller/molekyl) per botid] for hver celle på hvert tidspunkt av kinetisk løpe. Normalisere dataene i henhold til:
er den gjennomsnittlige b-verdi målt på tid "t" etter ligand tillegg, og 
er gjennomsnittlig b-verdi målt på tidspunktet t = 0 (10-20 s etter ligand tillegg).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene for to representative HeLa-mEGFP-FGFR1 celler seeded i samme kultur parabolen er vist i figur 5 og supplerende tabell 1. De to cellene ble fanget på tid 0 min (figur 5a, topp) og 7 min (figur 5a, bunn) etter tilsetning av FGF2 ligand.
Figur 5 viser også resultatene av to representative HeLa celler uttrykker enten den rene MONOMER, GPI-MEGFP (figur 5B, topp), eller covalently knyttet dimeric Fluoroforen, GPI-mEGFP-mEGFP (figur 5B, Bottom ), eksponert på cellemembranen og tatt under samme eksperimentelle forhold.
Den gjennomsnittlige åpenbare lysstyrken, B, i HeLa-mEGFP-FGFR1 cellene øker fra 1,070 ± 0,001 S.E. til 1,141 ± 0,001 S.E., mens referansen monomere (figur 5b, topp) og dimeric (figur 5b, bunn) prøvene Return B verdier på henholdsvis 1,070 ± 0,001 S.E. og 1,141 ± 0,001 S. E. Således, til sammenligning, FGFR1 reseptoren er til stede hovedsakelig i monomere form på cellemembranen overflaten ved start, men det utvikler seg mot en dominerende dimeric tilstand ved stimulering med sin kanoniske ligand FGF2. I gjennomsnitt da er den utbredte tilstanden til FGFR1 molekyler i de to representative cellene klart forskjellig.
Ved å bruke analysen til flere celler i samme parabolen, hver og en fanget på et annet tidspunkt, gjennomsnittlig lysstyrke som en funksjon av tid er innhentet (figur 6a). Den kinetisk kjøre i figur 6a beskriver en langsom prosess av dimerization som vedvarer i flere minutter på celleoverflaten. Den FGF2-indusert FGFR1 dimerization og påfølgende internalisering av reseptoren er en velkjent mekanisme34; Derfor er resultatene i full enighet med den nåværende oppfatningen på FGFR1 signal Transduction, og bekrefte potensialet av TIRF-N & B tilnærming for å studere oligomerisering av celle membran proteiner opp til fastsettelse av subtile monomer-dimer dynamikk.
Normalisert gjennomsnittlig lysstyrke analyse av resultatene er et egnet verktøy for å sammenligne effekten av ulike ligander på samme reseptor. Et eksempel er gitt i figur 6B. Protokollen ble gjentatt med de samme standardene og stimulere cellene med en ikke-Kanonisk FGFR1-ligand, NCAM-FC (50 μg/mL). I dette tilfellet avslører kinetisk profil raske og sykliske overganger av reseptoren i oligomer blandinger, som også når lysstyrkeverdier over dimer. En normalisert gjennomsnittsverdi på 3 observeres gjentatte ganger. Men begrensningen av N & B-analyse (bare to øyeblikk av intensiteten svingninger versus tid er vurdert) tillater ikke å demonstrere utvilsomt dannelsen av en trimeric form. Det samme normalisert gjennomsnittlig lysstyrke kan være et resultat av ulike kombinasjoner av større oligomers og monomerer av reseptoren. Likevel viser resultatene tydelig spatiotemporal forskjellene av effekten av de to ligander på samme reseptor.
Figur 1: oversikt over den eksperimentelle protokollen. (A) celler er belagt på glass bunnen retter og transfekterte med fluorescensmerkete merket reseptoren. (B) tidsserie bilder fanges opp på et kommersielt TIRF-mikroskop utstyrt med en TIRF 100-1,46 oljeobjektiv og inkubator kammer. I denne reklamen setup, edb-programmer tillater ikke det bygget-inne EMCCD kameraet #1 å arbeide med meget kort avsøring timene på krevd for erverve N & B tid serien. Dette er et viktig poeng siden eksponeringstiden begrenser omfanget av molekylær diffusions som kan fanges. Jo kortere eksponeringstid, jo raskere molekyl diffusjon som kan analyseres. Eksponeringer som spenner fra 0,5 til 1 MS er tilstrekkelig rask for membran protein diffusjon. Derfor legges et andre EMCCD-kamera (#2) til en ekstra port av mikroskopet for å fungere rett under kameraprogramvaren og omgå programvaren for mikroskop. I denne tilpassede konfigurasjonen brukes mikroskop programvaren og kamera #1 bare til TIRF-justering. TIRF tid serien er så ervervet benytter kameraet #2 det starter for meget kort avsøring timene som 1 MULTIPLE SCLEROSIS og for det maksimum EM fortjene. Kameraet #2 likeledes har en pixel størrelse av 124 NM det innrømmer oversampling og binning av avbildningene (se protokollen avdeling 6,2). Andre konfigurasjoner for å få Imaging hastighet er mulig, avhengig av egenskapene til ulike TIRF mikroskop, mens bruk av sCMOS kameraer er ikke tilrådelig, fordi støy er ikke tilfeldig i bildet35. (C) etter opptak inspiseres tids seriene som en kvalitetskontroll. Serien forkastes hvis photobleaching er høyere enn 10%, ettersom det kan fastslås ved å plotte den gjennomsnittlige ramme intensiteten kontra ramme nummeret. Serien er også forkastet hvis det har vært en tydelig forvrengning av cellemembranen eller oversettelse av cellen under oppkjøpet. (D) gjennomsnittlig intensitet i hvert bildepunkt lagres. (E) A b-i histogram som representerer den tilsynelatende lysstyrken, B, i hvert bildepunkt i bildet er generert. (F) B-i histogrammet brukes til å velge en avkastning som er over bakgrunnen. (G) frekvens fordelingen av B-verdiene analyseres for å fastslå den gjennomsnittlige B-verdien ± S.E. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: N &Amp; B-prinsippet. N & B kvantifiserer den gjennomsnittlige oligomerisering tilstanden til fluorophores ved å måle de fluorescens svingningene som oppstår når de beveger seg inn og ut av belysnings volumet under oppkjøpet av en tids stabel serie med "K"-bilder. Amplituden av svingningene er karakterisert statistisk av databehandling forholdet mellom variansen av det varierende signalet, σ2, og bety intensitet verdi, . I det enkleste scenariet (A), når lyset volumet er tomt (dvs. ingen fluorophores), forholdet beskriver instrument støy. Hvis det fluorescens signalet svinger på grunn av mobile fluorophores (B, C), er "ekstra" variansen direkte proporsjonal med den molekylære lysstyrken, ε (påvist Foton teller per molekyl og per sekund), av spre molekyler. I (B), er det 8 monomere spre fluorophores og i (C), det samme fluorophores diffus som 2 tetramerisk oligomers. I disse to tilfellene er den gjennomsnittlige intensiteten den samme, men standardavviket og lysstyrken er forskjellige (1ε, 4ε), fordi amplituder av svingningene er forskjellige. ε = 0 når fluorophores er Immobile eller fraværende. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: TIRF-mikroskopi. Til tross for N & B starter i like høy grad frisk med raster skanning mikroskop utstyrt med med multiphoton, sammenhengende bølge eller pulserende enkelt Foton laser og analog eller Foton opptellingen detektorer, TIRF mikroskopi er ideal for rask Temporal tenkelig av molekylær drivkraft hendelser som oppstår på eller nær celleoverflaten med hastigheter, oppløsning og signal/støy-forhold (S/N) som ikke er mulig å oppnå ved andre tenkelig teknikker. (A) TIRF mikroskopi sysselsetter prinsippet om total intern refleksjon som en vinklet eksitasjon laser lys interesserer bare fluorophores som er like under et glass-vann-grensesnitt av dekkglass. Laseren utstråler prøven i en vinkel på forekomsten som er større enn eller lik den kritiske vinkelen for brytning, mens det eksitasjon laser lyset er helt reflektert. Refleksjon genererer et svært tynt elektromagnetisk felt i prøven kalles evanescent bølgen. Den resulterende fluorescerende lys som slippes ut av den lille opplyste delen av prøven er samlet gjennom et mikroskop objektiv plassert vinkelrett under til lysbildet. (B) panelet viser et representativt eksempel på en gitt bølgelengde av den relative intensiteten av et evanescent felt kontra dybde, noe som reduserer eksponentielt med økende avstand fra overflaten, og gir høy aksial oppløsning fluorescens Bilder. Den laterale oppløsningen er satt av numerisk blenderåpning og forstørrelse av målet og av pixel størrelsen på deteksjon kameraet. Celle interiøret er ikke opplyst, og det bidrar ikke til signalet med intracellulære autofluorescence. Multi-vinkel TIRF mikroskop tillate å velge ulike penetrasjon dybder. De gir en skala som avhenger av eksitasjon bølgelengde og vanligvis går fra 70 NM opp til 250 NM dybde for enkelt farge TIRF bilde. Den evanescent lys dybden valgt for denne protokollen er 110 NM, og det er et resultat av et kompromiss mellom nødvendigheten av å bruke lav laser kraft og intensiteten av fluorescens signal som avtar kraftig med reduksjon av penetrasjon dybden. Det er viktig å unngå altfor store evanescent felt som kan belyse mange intracellulære blemmer og intracellulære befolkning på fluorophores. Derfor, avhengig av hvilken type prøve, flere penetrasjon dybder bør utforskes, søker etter den beste kombinasjonen: høy signal-til-støy-forhold, lav eksitasjon strøm, kort eksponeringstid, kort penetrasjon dybde. Når denne optimaliseringen er ferdig, er gjennomtrenging dybden holdes konstant for alle kontroller og prøver. (C) representative EPIFLUORESCENCE og TIRF bilder av en HELA-GPI-mEGFP celle etter Software-guidet optimalisering av dybden og retning av evanescent feltet. Multi vinkel TIRF mikroskop også tillate å optimalisere retning av evanescent feltet. Dette trinnet er anbefalt for å minimere spredning (dvs. skarp økning av intensiteten og mindre skarpe bilder), og det kan utføres i henhold til instruksjonene for den spesifikke mikroskop brukes. I denne protokollen inkluderer mikroskop programvaren en automatisk optimalisering av retningen av evanescent feltet. For manuell optimalisering, se publiserte protokoller36,37. (D) representative celle uttrykker MEGFP-FGFR1 konstruere i epifluorescence og etter optimalisering av TIRF belysning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: fangst av tidsserien og kalibrering av kameraet respons på enkelt fotoner. (A) eksempel på den første rammen ut av 700-Frame tidsserier fanget på en HeLa-MEGFP-FGFR1 celle i beskjæres sensor modus. Kamera brikken er delvis maskert (røde rektangler) ved hjelp av den doble visnings kontakten som er installert på TIRF-mikroskopet (figur 1B). De interne kalibrerings områdene gjenkjennes i bildet med gjennomsnittlig intensitet (B) og behandlet (C) for beregning av kamera parametrene ved å plotte Logg frekvensen kontra digitale nivåer (D). En analog oppdagelsen system, som en EMCCD kameraet, merker impuls av photocurrent istedet for Foton teller, og det Foton impuls høyde distribusjon er kvasi-eksponentiell. Den første delen av distribusjonen skyldes forsterkeren og analog-til-digital omformer og det bidrar en Gaussian avlesning støy (variansen innført av signalet innspillingen). Den mest befolkede kanalen (dvs. den hyppigste verdien) av fordelingen er offset (EQ. 13). Ved hjelp av en vertikal markør i et Logg plott skilles den første delen av fordelingen fra den eksplosive andre delen, over 250 DL, som representerer gjennomsnittlig kamera respons på et enkelt Foton (stigningstallet er S-faktoren i EQ. 12). Målingen av disse parametrene gjør det mulig å estimere tettheten av fotoner som registreres under anskaffelsen. Antall (DL) er i pseudo fargeskala. Pikselstørrelse = 124 NM; Bildeformat = 256x256 piksler, gjennomtrenging dybden av evanescent feltet ~ 110 NM; Kalibrerings ROI #1 = 19x256 piksler; Kalibrerings ROI #2 = 5x256 piksler. DL = digitale nivåer. Eksponering = 1 MS og EMGain (G-faktoren i EQ. 12, 13 og 14) = 1000. Merk at kameraer som arbeider i Foton telle modus med bakgrunn tilsvarer analoge detektorer med S = 1 (EQ. 12) og med σ2d og offset (EQ. 13) målt på samme måte som for et analogt system18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: N &Amp; B-analyse av FGFR1 oligomerisering. (A) representative resultater fra to jakten celler i samme rett uttrykker MEGFP-FGFR1 og fanget på tid 0 min (øverst) og 7 min (nederst) etter tilsetning av 20 ng/ml FGF2, og (B) to jakten celler uttrykker referanse konstruksjoner GPI-mEGFP (øverst) og GPI-mEGFP-mEGFP (nederst). Hele analyse sekvensen viser (fra venstre til høyre): gjennomsnittlig intensitet av tidsserien; Plot av alle B-verdier som en funksjon av fluorescens intensitet der fargen koden representerer antall piksler har samme B-verdi i bildet og de rektangulære markører avgrense regionen av interesse (ROI), bakgrunnen (BG) og områder av svært lav intensiteten (LI). Legg merke til at Immobile fluorophores vil gi B-verdi = 1 siden i fravær av svingninger ε = 0; B-kart over den valgte AVKASTNINGEN og tilhørende B-distribusjon histogram. B-verdi-fordelingen er utstyrt med en Gaussian-funksjon (stiplet rød linje) for å beregne den gjennomsnittlige tilsynelatende lysstyrken, B (full rød linje) og distribusjons statistikken (supplerende tabell 1) B-verdi = b ' = b/S (EQ. 15); Intensitet = ( - offset)/s; M = monomer; D = dimer; skala bars = 10 mikron. Tidsserier for RAW-data i tilleggs film 1, tilleggs film 2, tilleggs film 3og tilleggs film 4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Kinetics av FGFR1 oligomerisering indusert av ligand aktivering. Representative kinetisk kjører beskrevet av normalisert gjennomsnittlig lysstyrke (EQ. 16) av HeLa-mEGFP-FGFR1 celler etter stimulering med 20 ng/mL FGF2 (A) eller 50 μg/ml NCAM-FC (B). Celler i samme rett ble fanget på økende tid poeng og den tilsynelatende gjennomsnittlige lysstyrken, B ± S.E., ble beregnet fra B-distribusjon histogrammer. Figuren er tilpasset med tillatelse fra Zamai et al. Journal of Cell Science (2019)31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: rask Kinetics og data tolkning. Scatter plott av alle normalisert gjennomsnittlig lysstyrkeverdier Hentet fra replikere kinetisk kjører der HeLa-mEGFP-FGFR1 celler ble stimulert enten med NCAM-FC (50 μg/mL) eller FGF2 (20 ng/mL). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: skjermbilde av analysen rutine i MatLab. Screen øyeblikksbilde av N & B grafisk brukergrensesnitt (GUI) MATLAB rutine som viser den første analysen trinn: opplasting tid serien; beregne gjennomsnittlig intensitet bilde, beregne intensitet profil, beregne B-kart og B-I histogram. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Parameteren | GPI-mEGFP | GPI-mEGFP-mEGFP | mEGFP-FGFR1 (tid = 0 ') | mEGFP-FGFR1 (tid = 10 ') |
| Gaussian Mean B-verdi | 1,070 | 1,141 | 1,070 | 1,141 |
| S.E. på gjennomsnittlig B-verdi | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,001 |
| S.D. av B-vaue distribusjon | 0,059 | 0,067 | 0,077 | 0,075 |
| 95% sikkerhetsintervall for gjennomsnittlig B-verdi | 1,069 til 1,071 | 1,139 til 1,143 | 1,069 til 1,072 | 1,139 til 1,143 |
| S.D. for 95% sikkerhetsintervall for B-verdien | 0,058 til 0,060 | 0,065 til 0,069 | 0,075 til 0,079 | 0,073 til 0,078 |
| Begrensning for tilpassing | S.D. > 0 | S.D. > 0 | S.D. > 0 | S.D. > 0 |
| S.E. standard feil; S.D. standardavvik | ||||
Tilleggs tabell 1: åpenbar lysstyrke analyse. Statistikk og Gaussian montering parametre for B-distribusjoner i figur 5 ble utført. Den minst firkantede Gaussian passer ble innhentet under begrensning av standardavvik > 0 med X-Range automatisk valgt og maksimal gjentakelser = 1000. R-firkant: mEGFP-FGFR1 monomer = 0,9957, mEGFP-FGFR1 dimer 0,9940; GPI-mEGFP = 0,9985; GPI-mEGFP-mEGFP = 0,9970.
Tilleggs film 1: Time serie av en HeLa-mEGFP-FGFR1 celle på tid = 0 minutter etter FGF2 stimulering (20 ng/mL i PBS supplert med 0,01% BSA) vist i figur 5. Serien av 800 rammer er gjengitt ukomprimert ved 7 fps. Bildeformat = 256 x 256 piksler; pikselstørrelse = 124 NM; Det interne kalibrerings området identifiseres som mørke sidebånd. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggs film 2: Time serien vist i figur 5 av en HeLa-MEGFP-FGFR1 celle på tid = 7 minutter etter FGF2 stimulering (20 ng/ml i PBS supplert med 0,01% BSA) serien av 800 rammer er gjengitt ukomprimert ved 7 fps. Bildeformat = 256 x 256 piksler; pikselstørrelse = 124 NM; Det interne kalibrerings området identifiseres som mørke sidebånd. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggs film 3: Time serien vist i figur 5 av en HELA-GPI-mEGFP celle etter å ha lagt bilen (PBS supplert med 0,01% BSA). Serien av 1 000 rammer er gjengitt ukomprimert ved 7 fps. Bildeformat = 256 x 256 piksler; pikselstørrelse = 124 NM; Det interne kalibrerings området identifiseres som mørke sidebånd. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggs film 4: Time Series vist i figur 5 av en jakten-GPI-mEGFP-mEGFP celle etter å ha lagt bilen (PBS supplert med 0,01% BSA). Serien av 1 000 rammer er gjengitt ukomprimert ved 7 fps. Bildeformat = 256 x 256 piksler; pikselstørrelse = 124 NM; Det interne kalibrerings området identifiseres som mørke sidebånd. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
N & B krever flere forholdsregler ved valg av celle modell og merkings strategi. Den kan bare brukes på levende celler som fortsatt stabilt overholdt under bilde opptakstiden. Ekstra svingninger på grunn av hele cellen stiv forskyvning kan håndteres med riktig bilde restaurering tilnærminger38. Men generelt når en celle beveger seg, cellemembranen også deformeres, og struktur deformasjon, produsere store ekstra varians, introduserer alvorlig begrensning til analyse av membran proteiner. I dette arbeidet, er det fluorescerende konstruksjonen uttrykt i jakten cellelinjen fordi konstituerende FGFR1 er ubetydelig. Tilstedeværelsen av konstituerende protein er en forutsetning for å unngå, ellers blandet populasjoner av fluorescerende og ikke-fluorescerende reseptor oligomers ville trolig form. Følgelig vil N & B-analysen, som bare er basert på lysstyrken til den fluorescensmerkete protein populasjonen, returnere en upålitelig estimering av gjennomsnittlig oligomer tilstand. Dette aspektet er spesielt viktig når du søker N & B å oppdage reseptor dimerization hendelser der lysstyrken bare øker med en faktor på 2, for eksempel FGFR1 dimerization i nærvær av FGF2 ligand. I et slikt tilfelle, kan tilstedeværelsen av blandede dimers helt skjule dimerization hendelser oppdages av N & B. Forurensning av fluorescerende oligomers med ikke-fluorescerende konstituerende former er en av de potensielle fallgrubene enhver tilnærming basert på påvisning av fluorescens, med mindre merket protein er i stor grad overexpressed. Men oligomerisering studier i forhold til protein overuttrykte reise bekymringer om deres funksjonelle betydning. Midlertidig transfekterte celler vil trolig ha variable nivåer av fluorescens (dvs. proteinkonsentrasjon) og er nyttig for å teste uavhengighet av gjennomsnittlig lysstyrke på proteinkonsentrasjon, siden N & B kan brukes på et bredt spekter av konsentrasjoner, under forutsetning av lineær respons av detektoren (se definisjonen av lysstyrken, EQ. 1).
En annen begrensning er støkiometriske merking av reseptoren ved hjelp av en stabil fluoroforen i levende celler. Halo-Tags, fluorescerende proteiner (FP) eller andre kovalente fluorescerende koder er egnede etiketter for å få et eksakt antall bundne fluorophores per molekyl protein i cellen. For å redusere kompleksiteten i N & B-analysen, bruker vi enten fluorescerende proteiner eller Halo-tagger som gir en 1-til-1-fluoroforen merking. Den FP av valget må være monomere i den modne form, har en ubetydelig selvtillit forening tendens som ellers kan indusere kunstig oligomerisering av FP-Tagged reseptorer. I denne protokollen, bruker vi (A207K) mEGFP fordi dette enkelt punkt mutasjon opphever mEGFP Self-aggregering tendens som tidligere vist31,39,40. Uavhengig av merkings strategien bør fluorescensmerkete merket protein sjekkes for bevaring av den biologiske aktiviteten i den valgte celle modellen, ettersom funksjonaliteten til de kodede molekylene er avgjørende for å knytte oligomerisering hendelser til og reseptor signal. I vår modell, beviste vi reseptorautofosforylering av fluorescerende (A207K) mEGFP-FGFR1 etter stimulere transfekterte celler med reseptoren ligand FGF231.
N & B er basert på spredningen av molekyler i belysnings volumet. I digitalkamera deteksjon, eksponeringstiden (dvs. pixel dvele tid i analog deteksjon, tdvele) må være kort nok til at en og bare én konfigurasjon av partikler i fokal volumet er tatt. Dette er å si at sannsynligheten for en fluoroforen inn eller ut av opplyst volum under eksponeringstid er svært liten. Eksponeringstiden må være kortere enn fluoroforen oppholdstid (τD) som er den gjennomsnittlige tiden som en fluoroforen tilbringer i det opplyste volumet. Derfor, før du starter en N & B eksperiment, er det nødvendig å ha noen forestilling om botid (eller diffusjon koeffisient) av målet protein, som i en første tilnærming, avhenger av subcellulære lokalisering og molekylær masse. Frame Rate er den inverse av tiden som trengs for kameraet å erverve et bilde og deretter helt lese det bildet ut, og det er ofte, beregnet omtrent fra det totale antallet piksler og avlesning rate, kombinert med eksponeringstid. Selv om bildefrekvens ikke trenger å være rask, syklustid (tsyklus), som er summen av bildefrekvens og tid til å forberede fangst av neste ramme, kan påvirke analysen. Disse begrensningene kan være generalisert som: tcycle > > τD > > tdvele. Hvis syklustiden er for rask, vil ikke molekylene ha beveget seg merkbart fra en ramme til den neste i den tiden, og vil fremstå som Immobile (B = 1). Men fordi hundrevis av rammer er nødvendig for analysen, er sykling satt så raskt som mulig (øke eller redusere bildeformatet i antall piksler) for å unngå celle forskyvninger og forvrengning av cellemembranen som ville legge store ekstra varians i løpet av serien oppkjøpet. I eksempelet med denne protokollen, er den tregeste syklustiden 22 MS, slik at 500 rammer kan skaffes i 11 s.
Molekylær lysstyrke er ikke et absolutt antall; Det avhenger av de molekylære egenskapene til fluoroforen (tverrsnitt og Quantum yield), på den eksperimentelle satt opp (detektor og optikk) samt på eksitasjon forhold som laser makt. Dermed gir TIRF-N & B-tilnærmingen en tydelig lysstyrke, og på grunn av det er det grunnleggende å sette opp en "referanse celle modell" som uttrykker en referanse konstruksjon med univocal oligomer tilstand. Referansen konstruere bærer samme fluoroforen merke av proteinet under studien [her, det (A207K) mEGFP] og det lokaliseres i samme subcellulære kupé (her, plasma membranen). I dette arbeidet bruker vi en glycosylphosphatidylinositol (GPI) forankret-(A207K) mEGFP konstruere at vi gjentatte ganger har vist å være en pålitelig monomere lysstyrke standard for celleoverflaten reseptorer merket med samme fluoroforen30, 31i.
En stor ulempe er forekomsten av fluoroforen photobleaching som svært sannsynlig skjer når den samme cellen er gjentatte ganger eksponert for lys under en kinetisk kjøre, og fører til en undervurdering av oligomerisering tilstand. For å unngå dette oppnås lysstyrke Kinetics ved å kombinere den gjennomsnittlige lysstyrken til forskjellige celler som hver ble tatt med et annet tidspunkt (figur 6). Dette er å si at i en Petri parabolen hver celle er et annet tidspunkt av Kinetics og en Petri parabolen representerer en hel kinetisk løpe.
Når oligomerisering dynamikk er rask og kompleks, slik som FGFR1 oligomerisering indusert av en ikke-kanoniske ligand, NCAM31, profilen av normalisert gjennomsnittlig lysstyrke versus tid kan være variabel og ustabil (figur 6B ). I et slikt tilfelle kan reproduserbarhet ikke bestemmes ved å lese replikere retter av celler på nøyaktig tidspunkt, på grunn av nødvendigheten av å flytte og fokusere på en ny celle hver gang, velger du en avkastning, fangst og inspisere/forkaste tidsserier. Dermed kan reproduserbarhet evalueres i form av kinetisk profil likhet og amplitude av lysstyrke endringene.
En oversikt over resultatene er presentert i figur 7. Scatter plottet illustrerer bare den gjennomsnittlige lysstyrken målt i celler av samme rett, forsømmer tidspunktet for hver fangst. I denne tomten den store forskjellen indusert av de to ligander på oligomerisering tilstand reseptoren fortsatt tydelig, selv om all kinetisk informasjon er fjernet. Men for begge sett av eksperimenter (FGF2-versus NCAM-indusert oligomerisering), den konvensjonelle tilnærmingen til å bestemme gjennomsnittet ± S.D. av hvert løp i figur 7 ville føre til villedende konklusjoner siden FGFR1 molekyler STIMULERT av FGF2 klart transitt i to veldefinert stater, mens NCAM induserer ustabil og syklisk oligomer FGFR1 blandinger som ikke ville være godt representert ved en gjennomsnittlig ± S.D. verdi.
Oppsummert, fra et eksperimentelt synspunkt, krever N & B bare tilgang til et mikroskop utstyrt med en rask oppkjøpet modul og en dedikert programvare. Protein av interesse kan merkes med en rekke monomere fluorescerende proteiner eller organiske fluorophores, men kvantitative målinger krever flere forutsetninger for å være oppfylt: støkiometriske merking, referanse lysstyrke standard, detektor kalibrering og ingen photobleaching. I denne sammenhengen er N & B-tilnærmingen et kraftig verktøy for å dechiffrere den spatiotemporal oligomerisering av proteiner i levende celler. Videre siste fremskritt i oppdatere rådata for å løse den statistiske vekting41 og kombinere fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi med kryss-korrelasjon n & B42 er raffinering og forbedre anvendelsen av N & B tilnærming til protein oligomerisering og interaksjonsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Den CNIC støttes av departementet Ciencia, Innovacion y universidades og Pro CNIC stiftelsen, og er en Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Vi er også støttet av European Regional Development Fund (FEDER) "UNA manera de hacer Europa". UC anerkjenner støtten fra Associazione Italiana Ricerca Sul Cancro, foreningen for internasjonal kreftforskning (nå kjent som Worldwide Cancer Research), og det italienske Helsedepartementet. A.T. anerkjenner "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" for delvis støtte hans arbeid med PV Fellowship "Progetto Professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Albumin from Bovine Serum 98% minimun | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A7906-100G | |
| DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 21063029 | Used serum free for microscopy |
| DMEM high-glucose GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10566-016 | Used for complete medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| Emission splitting system Photometrics DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10270106 | 10% inactivated supplement for complete medium |
| Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | uncoated, glass thickness 0.17 microns |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
| Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series | |
| Matlab Executable N&B routine | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg. |
| pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector | Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy | Zamai et al., 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA. | |
| Sodium pyruvate GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 1 mM supplement for medium |
| TransIt-LT1 Transfection Reagent | MirusBio LLC, Madison, WI, USA | MIR 2300 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 25200056 | |
| Type F Immersion liquid 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections |
References
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
- Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
- Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
- Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
- Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
- Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
- Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
- Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
- Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
- Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
- Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
- Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
- Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
- Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
- Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
- Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
- Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
- Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
- Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
- Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
- Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
- Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
- Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
- Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
- Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
- Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
- Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
- Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
- Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
- Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
- Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
- Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
