Summary
Vi beskriver en avbildning metod för bestämning av den genomsnittliga oligomeriska tillstånd av mEGFP-märkta-receptor oligomerer induceras av ligand bindning i plasmamembranet av levande celler. Protokollet är baserat på den totala inre reflektions fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka (N & B) analys.
Abstract
Trots betydelsen och ubiquity av receptor oligomerization, är få metoder som gäller för att upptäcka klusterhändelser och mäta graden av klustring. Här beskriver vi en avbildning metod för att bestämma den genomsnittliga oligomeriska tillstånd av mEGFP-märkta-receptorn homokomplex i membranet av levande celler. Protokollet är baserat på den totala inre reflektions fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka (N & B) analys. N & B är en metod som liknar fluorescens-korrelationsspektroskopi (FCS) och Photon Counting histogram (PCH), som är baserade på den statistiska analysen av fluktuationerna i fluorescensintensiteten hos fluoroforer som sprider sig in och ut ur en belysnings volym under en observationstid. I synnerhet är N & B en förenkling av PCH för att få information om det genomsnittliga antalet proteiner i oligomeriska blandningar. Intensiteten fluktuation amplituder beskrivs av den molekylära ljusstyrkan hos fluorophore och det genomsnittliga antalet fluorofoder inom belysnings volymen. Således anser N & B endast den första och andra ögonblicken av amplitudfördelningen, nämligen den genomsnittliga intensiteten och variansen. Detta är, på samma gång, styrkan och svagheten i metoden. Eftersom endast två moment anses, N & B kan inte bestämma molar fraktion av okända oligomerer i en blandning, men det bara uppskattar den genomsnittliga oligomerisering tillstånd av blandningen. Det kan dock tillämpas på relativt små tidsserier (jämfört med andra moment metoder) av bilder av levande celler på en pixel-för-pixel-basis, helt enkelt genom att övervaka tids variationer av fluorescensintensiteten. Det minskar den effektiva tiden per pixel till några mikrosekunder, vilket gör att förvärv inom tidsintervallet sekunder till millisekunder, vilket är nödvändigt för snabb oligomerisering kinetik. Slutligen kan stora cellområden och subcellulära fack utforskas.
Introduction
Vi beskriver en total intern reflektion fluorescens-antal och ljusstyrka (TIRF-N & B) avbildning metod för att bestämma den genomsnittliga oligomeriska tillstånd av receptor molekyler vid plasmamembranet i levande celler, som syftar till att länka receptorn församlingen dynamiken till proteiners biologiska funktion (figur 1).
Vid extracellulära ligand bindning, receptorer initiera intracellulära signaltransduktion beroende på deras konformation, oligomerisering, potentiella Co-receptorer och membran sammansättning. Trots betydelsen och ubiquity av receptor oligomerization, erkänd som en viktig händelse i cellulära signalering1,2,3,4,5,6, 7, få metoder kan upptäcka klusterhändelser och mäta graden av kluster experimentellt8,9. Den konfokalvolym (x, y ≈ 300 nm, z ≈ 900 nm) är otillräckligt löst för att bevisa molekylär interaktion och stökiometri, även efter optimering av bildrestaurering algoritmer10. Den sub-Unit sammansättningen av protein oligomerer kan inte lösas på en rent rumslig grund även av super-upplösning metoder på x, y upplösning på 20-70 nm som PALM11, Storm12, och sted13. Dessutom kan deras temporala upplösning (i storleksordningen minuter per bild) inte följa kinetik i intervallet sekunder. Single molekyl Step-blekning löser stoichiometri av protein oligomerer endast om de är orörbara14.
En av de mest mångsidiga metoderna för att mäta densitet och oligomerisering av fluorescerande märkta proteiner inom enstaka bilder är den rumsliga intensiteten fördelning analys (SpIDA), som förlitar sig på rumsliga provtagning. Den är tillämplig på både kemiskt fasta och levande celler, och gör det möjligt att analysera flera regioner av intresse i cellen samtidigt med hjälp av standardfluorescens mikroskopi15. Alternativt moment metoder, såsom fluorescens-korrelationsspektroskopi (FCS)16, Photon Counting histogram (PCH)17, och antal och ljusstyrka (N & B)18,19, är lämpliga för kvantitativa Oligomer Mätningar. Dessa metoder analyserar variationer i fluorescensintensiteten som kan observeras i tid när fluoroforerna sprids in och ut ur en belysnings volym. Amplituderna i intensiteten kan beskrivas unikt genom den molekylära ljusstyrkan hos fluorophore (ε) och det genomsnittliga antalet fluoroforer (n) inom belysnings volymen17 (figur 2). Normalt kan diffusions koefficienten för fluoroforer och det genomsnittliga antalet molekyler (omvänt besläktade med G (0)-värdet) inom belysnings volymen erhållas genom FCS20. Men eftersom diffusions tiden bara skalas med kubisk roten av massan, är FCS inte tillräckligt känslig för att upptäcka förändringar i molekylmassa21. I praktiken kan enfärgade FCS inte detektera Dimerization av membran receptorer. PCH löser blandningar av olika oligomerer noggrant. Med mer än två moment av amplitudfördelningen upptäcker den molekyler med olika ljusstyrka som upptar samma belysnings volym. Scanning FCS22 och utveckling, såsom intressant par-korrelation av molekylär ljusstyrka (pcomb) Approach23, infördes för att utvidga räckvidden för tillämpligheten av fluorescenskorrelations metoder i biologiska system24 , förbli Single Point-metoder som saknar förmåga att snabba mätningar i ett stort område av en cell, som kräver många på varandra följande observationer vid varje pixel och datainsamling i storleksordningen sekunder.
N & B är en förenklad version av pch som endast beaktar den första och andra ögonblicken av amplituden för fluorescensfördelningen, nämligen Medelintensiteten, < i > och varians, σ2 (figur 2)18,19 och på grund av detta, kan den inte bestämma molar fraktion av okända oligomerer i en blandning, men bara uppskattar den genomsnittliga oligomerisering tillstånd av blandningen. N & B har dock fördelen av att arbeta med relativt mindre tidsserier av bilder av levande celler än PCH på en pixel-för-pixel-basis, helt enkelt genom att övervaka fluktuationerna i tiden för fluorescensintensiteten. Eftersom N & B minskar tiden per pixel till några mikrosekunder, kan det följa snabbt oligomerisering kinetik över stora cellområden, vilket gör att bild förvärv på en tidsskala av sekunder i raster skanning mikroskopi (t. ex., konfokal, 2-Photon) och millisekunder i kamerabasbaserad mikroskopi (t. ex. TIRFM).
Flera rapporter har visat förmåga N & B att kvantifiera antalet subenheter i protein kluster genom att avbilda utökade cell regioner. Paxillin-EGFP-kluster upptäcktes vid vidhäftnings platserna i CHO-K1-cellerna25, och den intracellulära aggregeringen av patogenen Httex1p peptid BESKREVS i cos-7-celler26. N & B applicerades för att följa den ligand-drivna oligomeriseringen av ErbB-receptorn27, och effekten av LIGAND FGF21 på Klothob (KLB) och FGFR1c i hela cells28. Kombinationen av tirf Imaging och N & B-analys användes för att visa att dynamin-2 i första hand är tetrameriska genom hela cellmembranet29. Vi tillämpade N & B till både raster skanning och tirf bilder för att bevisa ligand-driven Dimerization av uPAR och FGFR1 cellmembran receptorer30,31.
Fluorescenskorrelations metoder, såsom N & B, FCS och PCH, bygger på föreställningen att ockupationen av partiklar i en öppen volym följer en Poissonfördelning. Eftersom endast fotoner som avger fluoroforer kan upptäckas, är medelvärdet för en uppmätt fluorescensintensitet kontra tid i en bildpunkt i bilden 
, produkten av det genomsnittliga antalet fluorofomedel i belysnings volymen, n, och deras Molekylär ljusstyrka, ε17:
där ε uttrycks som det antal fotoner som avges per tidsenhet (konventionellt per sekund) per molekyl när molekylen står i centrum för belysnings volymen.
Ljusstyrka är en egenskap hos varje fluorophore i en given förvärvs uppsättning, medan intensiteten är summan av alla bidrag från alla fluoroforer. I biologiska tävlingar kommer ljusstyrkan att öka med ökningen av antalet fluoroforer som fluktuerar tillsammans, vilket ger information om oligomeriseringstillståndet hos det fluorescerande-märkta proteinet. Fluktuationsamplituderna vid en given pixel mäts från variansen för fluorescenssignalen, σ2:
Om medelvärdet av kvadraten på intensitet, 
och kvadraten på medelvärdet av intensiteten, 
beräknas utifrån de individuella intensitetsvärdena i varje pixel i varje ram:
där K är antalet totala bildrutor i tidsserierna. Experimentellt är det nödvändigt att beräkna för hela bildserien variansen som beskriver scattern för de enskilda intensitetsvärdena vid varje pixel i en enskild bild runt medelintensitetsvärdet. Avvikelsen inkluderar alla variationer av olika ursprung. I en första närhet, variancen som de diffusa partiklarna i belysnings volymen, σ20, kan AVS kil ras från variancen tack vare som avkännaren sköt stojar, σ2d. De två varianserna är oberoende; således ges total avvikelsen av summan:
Variationen, på grund av molekylära variationer in och ut ur detekterings volymen, är linjärt beroende av den molekylära ljusstyrkan och intensiteten:
Omdisponering av EQ. 6 enligt EQ. 1:
Enligt det typiska konceptet i fluorescenskorrelationspektroskopi, anger ekvation 7 att variationen på grund av antalet variationer beror på kvadraten på partikel ljusstyrkan.
Därefter är variansen på grund av detektor svängningar en linjär funktion av den upptäckta intensiteten, under antagandet att detektorn drivs under dess mättnadsgräns19:
I fallet av fotonen som räknar avkännare a= 1 och c= 0, således är detektor avvikelsen jämbördig till den genomsnittliga styrkan:
För att tillämpa dessa begrepp på verkliga mätningar i Live-celler, Gratton och kollegor18 definiera skenbar ljusstyrka, B, för varje pixel som förhållandet mellan variansen över den genomsnittliga intensiteten:
B är den parameter som mäts experimentellt. I detta arbete, tidsserie bilder av FGFR1-receptorer vid plasmamembranet av HeLa celler fångas upp av TIRF mikroskopi och den genomsnittliga skenbara ljusstyrkan, B, bestäms av N & B-analys. Sedan, efter tillsats av FGF2, på varandra följande tidsserier fångas för att följa förändringarna i själv-församlingen av receptorn molekyler i membranet ytan efter stimulering av receptorn med den kanoniska ligand.
Men eftersom detektorn i TIRF-mikroskopet är en EMCCD-kamera måste uttrycket för den skenbara ljusstyrkan ändras till19:
där offset är intensitetsförskjutningen av detekterings elektroniken som är kännetecknande för detektor inställningarna. Varians och medelintensitet för en analog detektor ges respektive av:
där G är den analoga förstärkningen i digitala nivåer (DL/fotoner), S, de digitala nivåerna per foton19, ges av lutningen på en intensitet kontra var Ians tomt för en ljuskälla med konstant intensitet (inga temporala fluktuationer). Γ-faktorn är relaterad till pixel detekterings volymens form. Enligt Hassler et al.32, den γ faktorn är lika med 0,3 för tirf Imaging arbetar vid maximal vinst på detekterings kameran19. Offset-, S-och G-parametrarna är kamerans och mikroskopens egenskaper. Den skenbara ljusstyrkan, B, erhålls genom omdisponering av EQ. 11 enligt EQ. 12 och 13:
Experimentellt är ε en komplex funktion av laserintensitet och detekterings effektiviteten i systemet. Eftersom B/S är linjärt beroende av ε är det dock endast viktigt att fastställa det relativa värdet av ε för ett givet detektions läge:
där ε står i proportion till ε. En kalibrering utförs fortfarande med en intern referens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. provberedning
- Dag 1. Utsäde HeLa celler i komplett medium vid en koncentration av 100000-200000 cell/mL i glas-botten rätter. Utsäde 6-8 replikera rätter.
Anmärkning: I detta exempel, mediet kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 100 U/100 μg penicillin/streptomycin. Flera replikaträtter tillagas. - Dag 2-3. När celler är på sub-confluency, transfect hälften av rätterna med proteinet plasmid och andra halvan med referens plasmider (monomer och dimer), i serumfritt medium.
Anmärkning: Transfektion görs i serumfritt medium kompletterat med antibiotika, 0,1% bovint serumalbumin och 25 mM HEPES buffert, utan fenolrött. - Dag 3-4. Kontrollera att de transfekterade cellerna är anhängare till botten av rätterna och cellmembranet är fluorescerande. Kassera rätter med övervuxna celler eller med mycket låg fluorescens.
Anmärkning: Låt inte cellerna växa. Cellerna skall vara väl utdelade och hållas i rätt glasyta (figur 1A). Precoated glasbotten rätter kan användas för att gynna cellernas vidhäftning. Cellkulturen testas för Mycoplasma kontamination innan något experiment. I detta exempel transfekterade celler med en (A207K) megfp-FGFR1 plasmid och referenscellerna transfekterade med en GPI-(A207K) megfp och en GPI-(A207K) megfp-(A207K) megfp plasmider med hjälp av standardprotokoll. För levande cellmikroskopi rekommenderas ett indikator fritt medium. 25 mM HEPES buffert tillsätts för att förhindra pH-förändringar under bildtagning.
2. TIRF Imaging-anpassning av laser linjen och optimering av TIRF belysning
- Fyra timmar före experiment, aktivera temperaturen inkubator av mikroskopet vid 37 ° c.
- Slå på mikroskopet, datorerna och kamerorna och vänta tills kamerorna uppnår rätt arbetstemperatur.
Anmärkning: Arbetstemperaturen för den kamera som används i denna studie är-75 ° c. - Placera en liten droppe olja på målet. Sätt ett prov skålen på plats. Stäng dörrarna till inkubatorn och låt temperaturen i skålen jämvikt (~ 10 min).
- Slå på epifluorescenslampan och 488 nm-lasern.
- Välj läget för epifluorescenskontrast för att utforska provet, söka i en cell för att fokusera från ögat.
Anmärkning: Användningen av en lysrörslampa för att söka celler tråg i ögat är inte obligatoriskt. I stället kan en passande laserlinje användas. - Välj rätt filter för uppsamling av det gröna utsläppet genom Mikroskop kameran (band pass ex 490/20 (500) band pass EM 525/50, eller liknande.
- Växla från okulär till kamerans port (kamera #1 i figur 1) i epifluorescensmikroskopi-läge, förfina fokus och ändra till tirf-läge. Epifluorescence och TIRF lägen kan namnges med en annan nomenklatur beroende på märke av mikroskopet.
Anmärkning: Det kan finnas problem med fokusering eller justering av lasern om det inte finns några fluorescerande markörer på täckglasgränssnittet. För att justera lasern ordentligt (viktigt för bra TIRF), fokusera på täckglassen. Det är ofta mycket svårt att avgöra om täckslip är i fokus. Som ett förslag, fokusera på kanterna av cellerna. - Aktivera den automatiska justeringen enligt instruktionerna i TIRF-mikroskopet.
Anmärkning: Kortfattat, för steg från 2,4 till 2,8, först hitta cellerna genom okulära och fokusera på dem, sedan skicka utsläpp till kameran porten av TIRF Mikroskop, åter fokusera cellerna på Mikroskop datorskärmen och aktivera förfarandet för laser justering. Justeringen består i att hitta den kritiska vinkeln vid vilken belysningen blir försvinnande (figur 3). Kommersiella Mikroskop kan ha något olika justerings protokoll och även vara helt automatiserad; andra kanske har en liten kamera för att underlätta visualiseringen av de kritiska vinkel förhållandena. - Välj ett lämpligt belysningsdjup och optimera riktningen för det försvinnande fältet (figur 3).
Anmärkning: Penetrationsdjupet hålls konstant för alla reglage och prover.
3. TIRF Imaging: fånga av tidsserierna
- Definiera en intresse region (ROI) för minst 256 x 256 pixlar.
Anmärkning: I detta set up görs fångsten med kamera #2 under programvara som direkt styr endast kameran (se figur 1 Legend). - Ställ in exponeringen på 1 MS och EM-förstärkningen till 1 000 (detta är G-faktorn i EQ. 12 och 13). Vid en sådan hastighet kan det vara nödvändigt att justera eller öka lasereffekten. Här är lasereffekten 0,5 mW.
Anmärkning: Beroende på vilken typ av kamera och de gränser som införts genom diffusion koefficienten av proteinet, fluorescens intensitet och bakgrund, de allmänna kriterierna för att ställa in lasereffekt är inte att mätta detektorn, minimera photoblekning, och fånga som snabbt som möjligt på en rimlig S/N. EM-förstärkningen ställs alltid in på kamerans maximum (se Introduktion). - Kör en första utvärderingssekvens under inledande förhållanden och uppskatta S/N-värdet grovt. Villkoren är acceptabla på S/N = 2-3 eller högre, mätt i den första bildrutan i den första tidsserien.
- Använd reglaget för avgassystem som ansluter kamera #2 till mikroskopet för att maskera en sida av bilden (figur 1B, figur 4a-b)
Anmärkning: I detta Ställ in en Multichannel Imaging Connector är installerad på kamera #2 för att möjliggöra förvärvet av två rumsligt identiska bilder samtidigt. Systemet är försett med diabilder för montering av olika avgas filter. En av skjutreglagen monterar en svart mask för att täcka en sida av bilden. Det maskerade området används för den interna kalibreringen av varje tidsserie för att bestämma kamerans parametrar (EQ. 12 och EQ. 13). På detta sätt finns det inget behov av ett oberoende kalibrerings steg och, viktigast av allt, kalibrering utförs parallellt med fångst av varje tidsserie. I avsaknad av detta system, kan kameran kalibreras tillämpa publicerade protokoll33. - Välj alternativet kamera fils Autospara .
- Starta förvärvet av bildserien. Förvärva minst 700 bildrutor med ett lägsta S/N-förhållande på 2.
Anmärkning: Antalet ramar som behövs för analysen beror på prov stabiliteten för foto blekning och på spridningen av data. Därför bedöms kvaliteten på varje tidsserie under N & B-analys. - Utan att ta skålen ur mikroskopet, tillsätt ligand.
- Välj en cell med ett ljust fluorescensmembran och starta snabbt den första tidsserien av den kinetiska körningen.
Anmärkning: Om tillägget av ligand görs snabbt, denna första fånga sätter punkten = 0 tid för ligand Kinetics. Programvaran registrerar den exakta tiden för infångst. - Sök en andra cell och förvärva andra gången punkten i Kinetics.
Anmärkning: Point-besökande rutiner finns i vissa Mikroskop utrustade med x, y, z motoriserade etapper. Dessa tillåter memorering av flera positioner på cell skålen, och kan hjälpa till att hålla ett mer konstant tidsintervall mellan bild-serien på olika celler. - Fånga en ny cell för varje tidspunkt i den kinetiska körningen.
Anmärkning: Efter att fånga, en cell är delvis fotoblekt och det kan inte åter avbildas. På grund av detta, den kinetik erhålls genom att kombinera tidsserier av många celler, varje fångas vid en annan tidpunkt. - Upprepa protokollet för varje ny maträtt från steg 2,3 till 3,9.
Anmärkning: För referens rätter, tillsätt en volym av fordonet (PBS kompletteras med 0,01% bovint serum albumin) motsvarande den som används för ligand.
4. nummer & ljusstyrka (N & B): kvalitetskontroll av tidsserierna
- Konvertera och Spara som. TIFF-filerna som har köpts med kamerans programvara (SIF-filer i det här exemplet).
- Importera. TIFF-filer i analysprogram rutinen genom att aktivera det grafiska användargränssnittet (GUI) för N & B MATLAB.
Anmärkning: En anpassad MATLAB körbara N & B rutin används här (N & B analys på https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Genom att öppna en importerad. TIFF-fil genererar rutinen den genomsnittliga intensitetsbilden, den genomsnittliga intensitetsprofilen och gör det möjligt att inspektera serien bildruta för bildruta (kompletterande figur 1). Annan programvara finns för N & B-analys (t. ex. SimFCS-programvara). - Kasse rings serie för vilken den genomsnittliga intensitetsprofilen visar mer än 10% foto blekning, och serier där det har förekommit en uppenbar förvrängning eller översättning av cellmembranet under förvärvet.
- Beskärningsramar som uppenbarligen är ur fokus.
Anmärkning: Ett beskärningsverktyg implementeras i rutinen som ignorerar enstaka eller flera bildrutor i bildserien. Den här åtgärden är tillåten eftersom ram-till-Frame-tid inte är kritisk medan pixel dröj tiden (exponeringstid) är (se diskussion). - Behåll endast för analysserien med minst 500 tidsramar.
5. nummer & ljusstyrka (N & B): bestämning av kamerans parametrar (offset, σ och S)
- Aktivera den rutinmässiga kalibrera kameran.
- Välj ett område med minst 20 x 50 pixlar i området detektor brus (figur 4).
Anmärkning: Rutinen påbörjar ett histogram av värdena (även definierad Digital nivå, DL) och returnerar en logaritm av frekvensen kontra digitala nivåer. - I logg frekvensen kontra Digital nivå Plot, flytta den linjära röda markören för att avgränsa Gaussian och den linjära delen av kurvan.
Anmärkning: Den röda markören delar de två delarna av kurvan, och aktiverar rutinen återvänder förskjutningen, som är centrum för den Gaussiska funktionen av kamerans respons, den σ av Gaussisk passform, och S-faktorn, som är lutningen på den linjära delen av kameran respons e (figur 4C-D).
6. numrera & ljusstyrka (N & B): uträkning av B-värderar i utvald region-av-intresserar (ROI)
- Aktivera B -tangenten.
Anmärkning: Den här åtgärden genererar den genomsnittliga intensitetsbilden (figur 5, första kolumnen) och b-bilden där varje enskilt B-värde associeras med den relaterade pixeln i bilden (tilläggs figur 1). - Applicera ett minimum Binning (2 2) för att minska spridningen av data och för att generera B-I-histogrammet (figur 5, andra kolumnen).
Anmärkning: B-I-histogrammet representerar fördelningen av B-värdena för alla pixlar i bilden jämfört med pixelintensiteten. Y = B/S; X = (
-offset)/S (kompletterande figur 1 och EQ. 11 och 15). - Inspektera B-I-histogrammet med hjälp av den interaktiva kvadratmarkören.
- Välj en fyrkantig ROI för analysen (figur 5, tredje kolumnen).
Anmärkning: Markören synkroniserar en mobil mask på bilden med genomsnittlig intensitet och markerar de pixlar som är markerade i området för kvadratmarkören (kompletterande figur 1). Genom denna inspektion är det möjligt att från analysen utesluta bakgrund och områden med mycket låg intensitet. - Generera B-Map för vald ROI (figur 5, fjärde kolumnen).
- Spara ASCII-filen för B-värden som är associerade med markeringen.
- Importera ASCII-filen i en grafisk programvara för att beräkna frekvensfördelningen av data och få det genomsnittliga B-värdet ± S. E (figur 5, femte kolumnen).
Anmärkning: Om uppgifterna är homogena, approximerar frekvensfördelningen av B-värdena en Gaussisk fördelning. - Använd EQ. 15 för att härleda den genomsnittliga
ljus 
styrkan =-1 [(antal/molekyl) per uppehållstid] för varje cell vid varje tidspunkt i den kinetiska körningen. Normalisera data enligt:
var
är det genomsnittliga b-värdet mätt vid tiden "t" efter ligand addition, och 
är det genomsnittliga b-värdet mätt vid tidpunkten t = 0 (10-20 s efter ligand tillägg).
Anmärkning: Normaliseringen av resultaten gör det möjligt att direkt jämföra experiment som utförs under olika dagar. Det kompenserar för skillnader i den uppmätta ljusstyrkan på grund av lasereffekt och tekniska svängningar. - Rita den normaliserade genomsnittliga ljusstyrkan kontra förvärvs tiden för att bygga den kinetiska körningen (figur 6).
ljus 
styrkan =-1 [(antal/molekyl) per uppehållstid] för varje cell vid varje tidspunkt i den kinetiska körningen. Normalisera data enligt:
är det genomsnittliga b-värdet mätt vid tiden "t" efter ligand addition, och 
är det genomsnittliga b-värdet mätt vid tidpunkten t = 0 (10-20 s efter ligand tillägg).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten för två representativa HeLa-mEGFP-FGFR1-celler som är seedade i samma odlings fat visas i figur 5 och kompletterande tabell 1. De två cellerna fångades vid tiden 0 min (figur 5a, topp) och 7 min (figur 5a, botten) efter tillsats av FGF2 ligand.
Figur 5 visar också resultaten av två representativa hela celler som uttrycker antingen ren monomer, GPI-megfp (figur 5b, topp), eller kovalent länkade dimeriskt fluorophore, GPI-megfp-megfp (figur 5b, botten ), exponeras vid cellmembranet och fångas under samma experimentella betingelser.
Den genomsnittliga skenbara ljusstyrkan, B, i hela-megfp-FGFR1-cellerna ökar från 1,070 ± 0,001 e till 1,141 ± 0,001 e, medan referens monomeren (figur 5b, topp) och dimeriskt (figur 5b, botten) prover returneras B 1,070 ± 0,001 och 1,141 ± 0,001 S. E. Således, i jämförelse, den FGFR1 receptorn är närvarande främst i monomerform på cellmembranet ytan vid start, men det fortskrider mot en dominerande dimeriskt tillstånd vid stimulering med dess kanoniska ligand FGF2. I genomsnitt är då det förhärskande tillståndet hos de FGFR1 molekylerna i de två representativa cellerna helt klart annorlunda.
Genom att tillämpa analysen på flera celler i samma maträtt, var och en fångas vid en annan tidpunkt, den genomsnittliga ljusstyrkan som en funktion av tid erhålls (figur 6a). Den kinetiska kör i figur 6a beskriver en långsam process av Dimerization som kvarstår i flera minuter på cellytan. FGF2-inducerad FGFR1 Dimerization och efterföljande internalisering av receptorn är en välkänd mekanism34; Därför är resultaten i full enighet med den nuvarande uppfattningen om FGFR1 signaltransduktion, och bekräfta potentialiteten i TIRF-N & B metod för att studera oligomerisering av cellmembran proteiner upp till bestämning av subtila monomer-dimer dynamik.
Den normaliserade genomsnittliga ljus styrke analysen av resultaten är ett lämpligt verktyg för att jämföra effekten av olika ligander på samma receptor. Ett exempel ges i figur 6B. Protokollet upprepades med samma standarder och stimulerar cellerna med en icke-kanoniska FGFR1 ligand, NCAM-FC (50 μg/mL). I detta fall, den kinetiska profilen avslöjar snabba och cykliska övergångar av receptorn i oligomeriska blandningar, som också når ljusstyrka värden ovanför den i dimer. Ett normaliserat Genomsnittligt värde på 3 observeras upprepade gånger. Emellertid, begränsningen av N & B-analys (endast två stunder av intensiteten fluktuation kontra tid anses) inte tillåter att visa utan tvekan bildandet av en trimeric form. Samma normaliserade genomsnittliga ljusstyrka kan vara resultatet av olika kombinationer av större oligomerer och monomerer av receptorn. Ändå visar resultaten tydligt de spatiotemporal skillnaderna av effekten av de två liganderna på samma receptor.
Figur 1: översikt över experiment protokollet. (A) cellerna är pläterade på glasbotten rätter och transfekterade med Fluorescent märkta receptor. (B) tidsserie bilder fångas på ett kommersiellt tirf Mikroskop utrustad med en tirf 100x 1,46 olje mål och inkubator kammare. I denna kommersiella setup, programvaran tillåter inte den inbyggda EMCCD kameran #1 att arbeta vid mycket korta exponeringstider som krävs för att förvärva N & B tidsserier. Detta är en viktig punkt eftersom exponeringstiden begränsar utbudet av molekylära diffusioner som kan fångas. Ju kortare exponeringstid, desto snabbare molekylär diffusion som kan analyseras. Exponeringar mellan 0,5 och 1 MS är tillräckligt snabba för membranprotein diffusion. Därför läggs en andra EMCCD kamera (#2) till en extra port av mikroskopet att arbeta direkt under kamerans programvara, kringgå Mikroskop programvaran. I denna anpassade konfiguration, Mikroskop programvara och kamera #1 används endast för TIRF justering. TIRF tidsserie förvärvas sedan med hjälp av kamera #2 som körs vid mycket korta exponeringstider som 1 MS och vid maximal EM Gain. Kamera #2 har också en pixelstorlek på 124 nm som tillåter översampling och Binning av bilderna (se protokoll avsnitt 6,2). Andra konfigurationer för att få bildhastighet är möjliga, beroende på egenskaperna hos olika TIRF Mikroskop, medan användningen av sCMOS kameror är inte tillrådligt, eftersom brus inte är slumpmässigt i bilden35. (C) när tidsserierna har infångats inspekteras de som en kvalitetskontroll. Serien kasseras om foto blekning är högre än 10% eftersom det kan bestämmas genom att den genomsnittliga bild Rute intensiteten kontra bildrutenumret ritas. Serie kasseras också om det har förekommit en uppenbar snedvridning av cellmembranet eller översättningen av cellen under förvärvet. (D) den genomsnittliga intensiteten i varje pixel sparas. (E) ett b-I-histogram som representerar den skenbara ljusstyrkan b i varje pixel i bilden genereras. (F) B-i-histogrammet används för att välja en ROI som ligger över bakgrunden. G) frekvensfördelningen för b-värdena analyseras för att fastställa det genomsnittliga b-värdet ± Se Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: N &Amp; B-principen. N & B kvantifierar den genomsnittliga oligomeriserings tillstånd av fluoroforer genom att mäta fluorescensfluktuationer som uppstår när de rör sig in och ut i belysnings volymen under förvärvet av en Time stack-serie med "K"-bilder. Amplituden av svängningarna karakteriseras statistiskt, genom att beräkna förhållandet mellan varians av den fluktuerande signalen, σ2, och medelintensitetsvärde, . I det enklaste scenariot (a), när belysnings volymen är tom (dvs. inga fluoroforer), beskriver förhållandet instrument brus. Om fluorescenssignalen fluktuerar på grund av mobila fluoroforer (B, C), är den "extra" avvikelsen direkt proportionell mot den molekylära ljusstyrkan, ε (detekterad fotons tal per molekyl och per sekund), av de diffusa molekylerna. I (B), det finns 8 monomer sprida fluoroforer och i (C), samma fluoroforer diffus som 2 tetrameriska oligomerer. I dessa två fall är den genomsnittliga intensiteten densamma, men standardavvikelsen och ljusstyrkan är olika (1ε, 4ε), eftersom amplituderna av variationerna är olika. ε = 0 när fluoroforer är orörbara eller frånvarande. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: TIRF-mikroskopi. Även om N & B går lika bra med raster scanning Mikroskop utrustade med multiphoton, kontinuerlig våg eller pulsad Single Photon lasrar och analog eller Photon Counting detektorer, är tirf mikroskopi idealisk för snabb temporala avbildning av molekylär dynamisk händelser som inträffar vid eller nära cellytan med hastigheter, upplösning och signal/brus förhållande (S/N) som inte är möjliga att uppnå med andra avbildningstekniker. (A) tirf mikroskopi sysselsätter principen om total inre reflektion genom vilken en vinklad excitation laserljus Exciter endast fluoroforer som är precis under ett glas-vatten gränssnitt av täckglasburk. Lasern bestråla preparatet i en infallsvinkel som är större än eller lika med den kritiska vinkeln av refraktion medan excitation laserljuset är helt reflekterat. Reflektionen genererar ett mycket tunt elektromagnetiskt fält i provet som kallas The försvinnande Wave. Den resulterande fluorescerande ljus som avges av den lilla belysta delen av preparatet samlas in genom ett Mikroskop mål placerat vinkelrätt nedan till bilden. (B) panelen visar ett representativt exempel vid en given våglängd av den relativa intensiteten av ett försvinnande fält kontra djup, vilket minskar exponentiellt med ökande avstånd från ytan, vilket ger hög axiell upplösning fluorescens Bilder. Den laterala upplösningen ställs in av den numeriska bländaren och förstoringen av målet och pixelstorleken på detekterings kameran. Cell interiören är inte upplyst och det bidrar inte till signalen med intracellulär autofluorescence. Multi-Angle TIRF Mikroskop tillåter val av olika penetrationsdjup. De ger en skala som beror på excitation våglängd och går vanligtvis från 70 nm upp till 250 nm djup för enfärgad TIRF bild. Den försvinnande belysning djup valts för detta protokoll är 110 nm, och det är resultatet av en kompromiss mellan nödvändigheten av att använda låg lasereffekt och intensiteten i fluorescenssignalen som minskar kraftigt med minskningen av penetrationsdjupet. Det är viktigt att undvika alltför stora försvinnande fält som kan belysa många intracellulära blåsor och intracellulära populationen av fluoroforer. Därför, beroende på vilken typ av prov, flera penetrationdjup bör undersökas, söka efter den bästa kombinationen: hög signal-brus-förhållande, låg excitation makt, kort exponeringstid, kort penetration djup. När denna optimering är klar hålls penetrationsdjupet konstant för alla kontroller och prover. (C) representativa epifluorescensmikroskopi och tirf bilder av en hela-GPI-megfp cell efter programvarustyrd optimering av djupet och riktningen av den försvinnande fältet. Multi Angle tirf Mikroskop gör det också möjligt att optimera riktningen för den försvinnande fältet. Detta steg rekommenderas för att minimera spridningen (dvs., kraftig ökning av intensiteten och mindre skarp bild), och det kan utföras enligt instruktionerna i det specifika Mikroskop som används. I detta protokoll innehåller Mikroskop programvaran en automatisk optimering av riktningen av den försvinnande fältet. För manuell optimering, se publicerade protokoll36,37. D) representativ cell som uttrycker megfp-FGFR1 konstruktionen i epifluorescens och efter optimering av tirf-belysningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: tagning av tidsserierna och kalibrering av kamerans respons på enstaka fotoner. (A) exempel på den första ramen av 700-Frame tidsserier fångas på en hela-MEGFP-FGFR1 cell i den beskurna sensorn läge. Kamera kretsen är delvis maskerad (röda rektanglar) med hjälp av Dual View-kontakten installerad på TIRF-mikroskopet (figur 1B). De interna kalibrerings regionerna redovisas i den genomsnittliga intensitetsbilden (B) och bearbetas (C) för uppskattning av kamerans parametrar genom plottning av log-frekvens kontra digitala nivåer (D). Ett analogt detekteringssystem, såsom en EMCCD-kamera, detekterar pulser av photocurrent istället för fotons räkning, och fotons puls höjd fördelning är kvasi-exponentiell. Den första delen av distributionen beror på förstärkaren och analog-till-digital-omvandlare och det bidrar en Gaussian avläsning buller (avvikelsen infördes genom signal inspelning). Den mest befolkade kanalen (d.v.s. det mest frekventa värdet) för distributionen är förskjutningen (EQ. 13). Med hjälp av en vertikal markör i en logg handling, är den första delen av distributionen separeras från den exponentiella andra delen, över 250 DL, som representerar den genomsnittliga kameran svar på en enda fotonen (lutningen är S faktorn i EQ. 12). Mätningen av dessa parametrar gör det möjligt att uppskatta tätheten av fotoner som registreras under förvärvet. Antal (DL) är i pseudo färgskala. Pixel storlek = 124 nm; Bildformat = 256x256 pixlar, penetrationsdjupet av det försvinnande fältet ~ 110 nm; Kalibrering ROI #1 = 19x256 pixlar; Kalibrering ROI #2 = 5x256 pixlar. DL = digitala nivåer. Exponering = 1 MS och EMGain (G-faktorn i EQ. 12, 13 och 14) = 1000. Observera att kameror som arbetar i fotons räknings läge med bakgrund motsvarar analoga detektorer med S = 1 (EQ. 12) och med σ2d och offset (EQ. 13) mätt på samma sätt som för ett analogt system18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: N &Amp; B analys av FGFR1 oligomerisering. (A) representativa resultat från två hela-celler i samma maträtt som uttrycker megfp-FGFR1 och fångas vid tiden 0 min (överst) och 7 min (botten) efter tillsats av 20 ng/ml FGF2, och (B) två hela celler som uttrycker referenskonstrukterna GPI-megfp (överst) och GPI-mEGFP-mEGFP (nederst). Hela analyssekvens visar (från vänster till höger): genomsnittlig intensitet i tidsserierna; Plot av alla B-värden som en funktion av fluorescensintensitet där färgkod representerar antalet pixlar med samma B-värde i bilden och de rektangulära markörer avgränsa intresseregionen (ROI), bakgrunden (BG) och regioner med mycket låg intensitet (LI). Observera att orörbara fluoroforer kommer att ge B-värde = 1 eftersom det i avsaknad av fluktuationer ε = 0; B-karta över vald ROI och tillhörande B-distributionhistogram. B-värdefördelningen är försedd med en Gaussisk funktion (streckad röd linje) för att beräkna den genomsnittliga skenbara ljusstyrkan, B (full röd linje) och fördelnings statistiken (tilläggstabell 1) b-värde = b ' = b/S (EQ. 15); Intensitet = ( - offset)/s; M = monomer; D = dimer; skalstreck = 10 mikrometer. Rådata tidsserier i kompletterande film 1, kompletterande film 2, kompletterande film 3, och kompletterande film 4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: kinetik av FGFR1 oligomerisering inducerad av ligand aktivering. Representativa kinetiska körningar beskrivs av den normaliserade genomsnittliga ljusstyrkan (EQ. 16) av HeLa-mEGFP-FGFR1 celler efter stimulering med 20 ng/mL FGF2 (a) eller 50 μg/ml Ncam-FC (B). Celler i samma maträtt fångades vid stigande tidpunkter och den skenbara genomsnittliga ljusstyrkan, B ± s, beräknades från B-fördelningen histogram. Figurera anpassas med tillåtelse från Zamai et al. föra journal över av cell vetenskap (2019)31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: snabb kinetik och data tolkning. Punktdiagram över alla normaliserade genomsnittliga ljusstyrkevärden som erhålls från replikerad kinetisk kör där HeLa-mEGFP-FGFR1 celler stimulerades antingen med NCAM-FC (50 μg/mL) eller FGF2 (20 ng/mL). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: skärm ögonblicksbild av analys rutinen i MATLAB. Skärm ögonblicksbild av N & B grafiskt användargränssnitt (GUI) MATLAB-rutin som visar de inledande analysstegen: uppladdnings tidsserie; beräkna genomsnittlig intensitet bild, beräkna intensitet profil, Compute B-Map och B-I histogram. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Parametern | GPI-mEGFP | GPI-mEGFP-mEGFP | mEGFP-FGFR1 (tid = 0 ') | mEGFP-FGFR1 (tid = 10 ') |
| Gaussiskt medelvärde B-värde | 1,070 | 1,141 | 1,070 | 1,141 |
| S i medelvärde B-värde | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,001 |
| SD av B-vaue-distributionen | 0,059 | 0,067 | 0,077 | 0,075 |
| 95% konfidensintervall för medelvärdet för B-värdet | 1,069 till 1,071 | 1,139 till 1,143 | 1,069 till 1,072 | 1,139 till 1,143 |
| SD av 95% konfidensintervall för B-värdet | 0,058 till 0,060 | 0,065 till 0,069 | 0,075 till 0,079 | 0,073 till 0,078 |
| Montering begränsa | SD-> 0 | SD-> 0 | SD-> 0 | SD-> 0 |
| A standardfel; Standardavvikelse för SD | ||||
Kompletterande tabell 1: analys av skenbar ljusstyrka. Statistik och parametrar för Gaussisk montering av B-fördelningarna i figur 5 genomfördes. De minst kvadratiska Gaussiska passformar erhölls under Bibehåll av standardavvikelse > 0 med X-Range automatiskt valda och maximala iterationer = 1000. R kvadrat: mEGFP-FGFR1 monomer = 0,9957, mEGFP-FGFR1 dimer 0,9940; GPI-mEGFP = 0,9985; GPI-mEGFP-mEGFP = 0,9970.
Kompletterande film 1: Tidsserier för en HeLa-mEGFP-FGFR1-cell vid tiden = 0 minuter efter FGF2 stimulering (20 ng/mL i PBS kompletterad med 0,01% BSA) visas i figur 5. Serien av 800 ramar återges okomprimerade på 7 fps. Bildformat = 256 x 256 pixlar; pixelstorlek = 124 nm; Det interna kalibreringsområdet identifieras som mörka sido band. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande film 2: Tidsserier som visas i figur 5 i en hela-MEGFP-FGFR1-cell vid tid = 7 minuter efter FGF2 stimulering (20 ng/ml i PBS kompletterad med 0,01% BSA) serien av 800 bildrutor återges okomprimerade med 7 fps. Bildformat = 256 x 256 pixlar; pixelstorlek = 124 nm; Det interna kalibreringsområdet identifieras som mörka sido band. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande film 3: Tidsserier som visas i figur 5 i en hela-GPI-megfp-cell efter tillsats av fordonet (PBS kompletterad med 0,01% BSA). Serien av 1 000 ramar återges okomprimerade på 7 fps. Bildformat = 256 x 256 pixlar; pixelstorlek = 124 nm; Det interna kalibreringsområdet identifieras som mörka sido band. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande film 4: Tidsserier som visas i figur 5 i en hela-GPI-megfp-megfp-cell efter tillsats av fordonet (PBS kompletterad med 0,01% BSA). Serien av 1 000 ramar återges okomprimerade på 7 fps. Bildformat = 256 x 256 pixlar; pixelstorlek = 124 nm; Det interna kalibreringsområdet identifieras som mörka sido band. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
N & B kräver flera försiktighetsåtgärder vid valet av cell modell och märknings strategi. Den kan endast tillämpas på levande celler som förblir stabilt under bildfångst tiden. Extra svängningar på grund av hela cellen stel förskjutning kan hanteras med lämpliga bildrestaurering metoder38. Men i allmänhet när en cell rör sig, cellmembranet också deformeras, och struktur deformation, producerar stor extra varians, introducerar allvarlig begränsning till analysen av membranproteiner. I detta arbete uttrycks fluorescerande konstruktionen i hela cell linjen eftersom konstitutiva FGFR1 är försumbar. Närvaron av konstitutiva proteinet är ett villkor för att undvika, annars blandade populationer av fluorescerande och icke-fluorescerande receptor oligomerer skulle sannolikt bildas. Följaktligen skulle N & B-analysen, som endast bygger på ljusstyrkan hos den Fluorescent-märkta protein populationen, returnera en opålitlig uppskattning av den genomsnittliga oligomerstaten. Denna aspekt är särskilt viktigt vid applicering av N & B för att detektera receptor Dimerization händelser där ljusstyrkan bara ökar med en faktor 2, såsom FGFR1 Dimerization i närvaro av FGF2 ligand. I ett sådant fall kan förekomsten av blandade dimerer helt dölja Dimerization händelser detekterbara av N & B. Föroreningen av fluorescerande oligomerer med icke-fluorescerande konstitutiva former är en av de potentiella fallgropar av någon metod som bygger på detektion av fluorescens, om inte det märkta proteinet är till stor del överuttrycks. Emellertid, oligomerisering studier i villkor av protein överuttryck väcker farhågor om deras funktionella betydelse. Transiently transfekterade celler kommer sannolikt att ha varierande nivåer av fluorescens (dvs proteinkoncentration) och är användbara för att testa oberoende av den genomsnittliga ljusstyrkan på protein koncentrationen, eftersom N & B kan appliceras på ett brett spektrum av koncentrationer, under förutsättning av linjär respons av detektorn (se definitionen av ljusstyrka, EQ. 1).
En annan begränsning är den stökiometriska märkningen av receptorn med hjälp av en stabil fluorophore i levande celler. Halo-taggar, fluorescerande proteiner (fp) eller andra kovalent fluorescerande taggar är lämpliga etiketter för att få ett exakt antal bundna fluoroforer per molekyl av protein i cellen. För att minska komplexiteten i N & B-analysen använder vi antingen fluorescerande proteiner eller Halo-Tags som ger en 1-till-1 fluorophore-till-protein-märkning. FP val måste monomeriska i den mogna formen, med en försumbar själv Association tendens att, annars, kan framkalla artificiell oligomerisering av FP-märkta receptorer. I detta protokoll använder vi (A207K) megfp eftersom denna enda punktmutation avskaffar megfp själv aggregering tendens som tidigare visat31,39,40. Oberoende av märknings strategin bör det fluorescerande märkta proteinet kontrolleras för bibehållande av den biologiska aktiviteten i den valda cell modellen, eftersom funktionaliteten hos de taggade molekylerna är nödvändig för att koppla oligomeriseringshändelser till receptor signalering. I vår modell, vi bevisade autophosphorylation av fluorescerande (A207K) megfp-FGFR1 efter stimulering av transfekterade celler med receptorn ligand FGF231.
N & B är baserad på diffusion av molekyler i belysnings volymen. Vid digital kamera detektering måste exponeringstiden (dvs. pixel dröms tiden i analog detektering, tDwell) vara kort nog att en och endast en konfiguration av partiklar i brännvidden fångas. Det vill säga att sannolikheten för att en fluorophore kommer in i eller ut ur den upplysta volymen under exponeringstiden är mycket liten. Exponeringstiden måste vara kortare än tiden för fluorophore-uppehållet (τD), vilket är den genomsnittliga tid som en fluorofore tillbringar i den upplysta volymen. Därför, innan du påbörjar ett N & B experiment, är det nödvändigt att ha någon aning om uppehållstiden (eller diffusion koefficient) av målproteinet, som i en första tillnärmning, beror på subcellulära lokalisering och molekylmassa. Bildrutehastighet är inversen till den tid som behövs för att kameran ska få en bild och sedan helt läsa den bilden, och den är ofta Beräknad ungefär från det totala antalet pixlar och avläsnings hastigheten, kombinerat med exponeringstiden. Även om bildrutehastigheten inte behöver vara snabb, kan cykeltid (t-cykel), som är summan av bildrutehastigheten och tiden för att förbereda infångandet av nästa bildruta, påverka analysen. Dessa begränsningar kan generaliseras som: t-cykelns > > τD > > tDwell. Om cykeltiden är för snabb, kommer molekylerna inte att ha rört sig nämnvärt från en bildruta till nästa på den tiden, och kommer att visas som orörlig (B = 1). Men eftersom hundratals ramar behövs för analysen, är cykling inställd så snabbt som möjligt (öka eller minska bildformatet i antal pixlar) för att undvika cell förskjutningar och snedvridning av cellmembranet som skulle lägga till stor extra varians under serie förvärvet. I exemplet med detta protokoll, den långsammaste cykeltid är 22 MS, så att 500 ramar kan förvärvas i 11 s.
Molekyl ljusstyrka är inte en evig sanning antal; Det beror på de molekylära egenskaperna hos fluorophore (tvärsnitt och Quantum yield), på den experimentella uppsättningen (detektor och optik) samt på excitation villkor såsom lasern makt. Således ger tirf-N & B-metoden en skenbar ljusstyrka och på grund av att det är grundläggande att inrätta en "referenscell modell" som uttrycker en referens konstruktion med okomplicerad oligomeriska tillstånd. Referens konstruktionen bär samma fluorophore tag av proteinet under studie [här, den (A207K) mEGFP] och det lokaliserar i samma subcellulära fack (här, plasmamembranet). I detta arbete använder vi en glykosylfosfatidylinositol (GPI) förankrade-(A207K) mEGFP konstruera att vi har upprepade gånger visat sig vara en pålitlig monomerisk ljusstyrka standard för cellytan receptorer märkta med samma fluorophore30, 31.
En stor nackdel är förekomsten av fluorophore photoblekning som mycket sannolikt händer när samma cell är upprepade gånger utsätts för ljus under en kinetisk körning, och leder till en underskattning av oligomerisering staten. För att förhindra detta erhålls ljus styrke kinetiken genom att kombinera den genomsnittliga ljusstyrkan i olika celler som varje fångas vid en annan tidpunkt (figur 6). Detta är att säga att i en petriskål varje cell är en annan tidpunkt för kinetik och en petriskål representerar en hel kinetisk springa.
När oligomerisering dynamiken är snabb och komplex, såsom FGFR1 oligomerisering induceras av en icke-kanoniska ligand, NCAM31, profilen för normaliserad genomsnittlig ljusstyrka kontra tid kan vara varierande och instabil (figur 6B ). I ett sådant fall kan reproducerbarhet inte bestämmas genom att läsa replikera rätter av celler vid exakta tidpunkter, på grund av nödvändigheten av att flytta och fokusera på en ny cell varje gång, Välj en ROI, fånga och inspektera/kassera tidsserier. Således kan reproducerbarhet utvärderas i termer av kinetisk profil likhet och amplitud av ljusstyrkan ändras.
En översikt över resultaten presenteras i figur 7. Scatterhandlingen illustrerar endast den genomsnittliga ljusstyrkan mätt i celler av samma maträtt, vilket försummar tiden för varje fångst. I denna handling den stora skillnaden induceras av de två ligander på oligomerisering tillstånd av receptorn förbli uppenbara, även om all kinetisk information tas bort. Men för båda experiment (FGF2-kontra NCAM-inducerad oligomerisering), den konventionella metoden för att bestämma medelvärdet ± SD för varje körning i figur 7 skulle leda till vilseledande slutsatser eftersom FGFR1 molekyler STIMULERAS av FGF2 klart Transit i två väl definierade stater, medan NCAM inducerar instabila och cykliska oligomeriska FGFR1 blandningar som inte skulle vara väl representerade med ett medelvärde ± SD-värde.
Sammanfattnings, från en experimentell synvinkel, N & B kräver endast tillgång till ett Mikroskop utrustad med en snabb anskaffningsmodul och en dedikerad programvara. Proteinet av intresserar kan märkas med en variation av monomer fluorescerande proteiner eller organiska fluorophores, men kvantitativa mätningar kräver flera villkorar för att uppfyllas: stökiometriska etikettering, hänvisa till ljusstyrka standart, avkännare kalibrering och ingen foto blekning. I detta sammanhang är N & B-metoden ett kraftfullt verktyg för att dechiffrera den spatiotemporal oligomeriseringen av proteiner i levande celler. Vidare har de senaste framstegen när det gäller omsampling av rådata för att lösa den statistiska viktningen41 och kombinationen av fluorescenskorrelations-spektroskopi med tvär korrelation n & B42 raffinering och förbättring av tillämpligheten av n & B metod för proteinoligomerisering och interaktionsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
CNIC stöds av ministeriet för Ciencia, Innovacion y Universidades och Pro CNIC Foundation, och är en Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Vi stöds också av Europeiska regionala utvecklingsfonden (FEDER) "Una Manera de hacer Europa". UC erkänner stödet från Associazione Italiana ricerca Sul Cancro, föreningen för internationell cancerforskning (numera känd som global cancer Research), och det italienska hälsoministeriet. At erkänner "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" för att delvis stödja hans arbete med PV Fellowship "Progetto Professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Albumin from Bovine Serum 98% minimun | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A7906-100G | |
| DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 21063029 | Used serum free for microscopy |
| DMEM high-glucose GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10566-016 | Used for complete medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| Emission splitting system Photometrics DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10270106 | 10% inactivated supplement for complete medium |
| Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | uncoated, glass thickness 0.17 microns |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
| Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series | |
| Matlab Executable N&B routine | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg. |
| pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector | Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy | Zamai et al., 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA. | |
| Sodium pyruvate GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 1 mM supplement for medium |
| TransIt-LT1 Transfection Reagent | MirusBio LLC, Madison, WI, USA | MIR 2300 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 25200056 | |
| Type F Immersion liquid 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections |
References
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
- Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
- Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
- Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
- Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
- Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
- Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
- Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
- Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
- Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
- Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
- Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
- Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
- Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
- Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
- Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
- Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
- Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
- Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
- Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
- Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
- Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
- Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
- Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
- Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
- Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
- Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
- Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
- Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
- Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
- Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
- Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
