Summary
Utvikling av murine modeller med spesifikke gener mutert i hode og nakke kreftpasienter er nødvendig for å forstå neoplasi. Her presenterer vi en protokoll for in vitro transformasjon av primær murine tungen celler ved hjelp av en adeno-assosiert virus-Cas9 system for å generere murine HNC cellelinjer med bestemte genomisk endringer.
Abstract
Bruken av primære normale epitelceller gjør det mulig å reproduserbar indusere genomisk endringer som kreves for mobilnettet transformasjon ved å innføre spesifikke mutasjoner i oncogenes og tumor Suppressor gener, ved hjelp av klynger regulatoriske oppdelt kort palindromic gjenta (CRISPR)-baserte Genova redigering teknologi i mus. Denne teknologien gjør det mulig for oss å nøyaktig etterligne de genetiske endringene som forekommer i menneskelig kreft ved hjelp av mus. Ved genetisk transformasjon av murine primære celler, kan vi bedre studere kreftutvikling, progresjon, behandling og diagnose. I denne studien, brukte vi grobunn-induserbart Cas9 mus tungen epitelceller for å aktivere Genova redigering ved hjelp av adeno-assosiert virus (AAV) in vitro. Nærmere bestemt, ved å endre KRAS, p53, og APC i normale tungen epitelceller, genererte vi en murine hode og nakke kreft (HNC) cellelinje in vitro, som er tumorigene i syngeneic mus. Metoden som presenteres her beskriver i detalj hvordan å generere HNC cellelinjer med spesifikke genomisk endringer og forklarer deres egnethet for å forutsi tumorprogresjon i syngeneic mus. Vi ser for oss at denne lovende metoden vil være informativ og nyttig å studere tumor biologi og behandling av HNC.
Introduction
HNC er en vanlig kreft verden over1. Modellering av Genesis av HNC neoplasi er for tiden på et vitenskapelig vendepunkt2. Mens mange genetiske mutasjoner har blitt identifisert i HNC2,3,4 (f. eks, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, og RAS) den spesifikke kombinasjoner av genomisk endringer som kreves i konserten for å indusere HNC fortsatt uklart.
Den nåværende bruk av menneskelige HNC cellelinjer har betydelig bidratt til å belyse mekanismene forbundet med patogenesen og behandling3. Men studiet av menneskelige cellelinjer i immunsupprimerte murine systemer har sine begrensninger, fordi disse systemene ikke ta opp in vivo neoplastic prosessen, rollen til spesifikke genmutasjoner, og behandling svar i en immun mikromiljøet. Derfor er utvikling og etablering av murine cellelinjer med spesifikke genetiske endringer av primær betydning for å studere hvordan ulike gener bidrar til transformerings prosessen og for å teste romanen molekyl BAS ert behandling i immunkompetente mus.
Gen funksjon studier i biomedisinsk forskning har blitt betydelig påvirket av fremskritt innen DNA-redigering teknologier, ved å innføre dobbel-strand pauser (DSBs), for eksempel5. Disse teknologiene, inkludert bruk av sink finger nukleaser, transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser, og klynger regulatoriske oppdelt korte palindromic gjentar (CRISPR/Cas9), tillate manipulering av ethvert gen av interesse på sitt geometriske. De nyeste CRISPR/Cas9 systemer består av en guide RNA (gRNA) som dirigerer Cas9 nuklease å generere en DSB på et bestemt sted i Genova. Dette systemet har fått omfattende anerkjennelse i å endre endogene gener i noen celle eller mål vev, selv i de mest tradisjonelt vanskelige å behandle organismer5. Den har flere fordeler fremfor andre systemer på grunn av sin enkelhet, hastighet og effektivitet.
I onkologi, CRISPR/CAS9 teknologi har oppfylt behovet for å effektivt etterligne kreftceller. For å etablere dette systemet i HNC, manipulert vi den potente KRAS diagnostisk og to viktige tumor Suppressor gener, APC og p536. Ifølge GENIE database7, denne kombinasjonen er sjelden i HNC. RAS mutasjoner (HRAS, NRAS, og KRAS) er tilstede i bare ~ 7% av alle HNC populasjoner. Disse tumorer tendens til å være motstandsdyktig mot terapi8,9.
Levering av Cas9 og dens gRNA oppnås gjennom viral Transduction bruker enten AAVs eller lentiviruses. Rekombinant AAV er ofte den foretrukne metoden for å levere gener for å målrette celler på grunn av sin høye titer, milde immunrespons, evne til å overfører et bredt spekter av celler, og generell sikkerhet. Ved hjelp av et AAV system, har ulike vev-spesifikke muse cellelinjer er generert, og nye cellelinjer er fortsatt under utvikling10,11,12. Imidlertid gjenstår en effektiv genomisk redigering system som kan generere murine HNC cellelinje modeller celler som skal utvikles. I denne studien forsøkte vi å utvikle et in vitro AAV-Cas9-basert system for å transformere primær murine tunge celler til en tumorigene tilstand. Denne unike CRISPR/Cas9 transformasjon protokollen og den etablerte tumor cellelinje kan brukes til å bedre forstå biologi av HNC indusert av et mangfold av genomisk endringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Ben Gurion University of the Negev Animal Care og use Committee. Dyre eksperimenter ble godkjent av IACUC (IL. 80-12-2015 og IL. 29-05-2018 (E)). Alle aspekter av dyreforsøk, bolig, og miljømessige forhold som brukes i denne studien var i samsvar med guide for Stell og bruk av Laboratoriedyr13.
1. Adeno-assosiert virus produksjon
- Dag 1: cellekultur
- Seed 4 x 106 HEK293T celler per 14,5 cm plate i 15 ml DMEM. Forbered 10 plater for transfeksjoner med polyethylenimine (PEI) (1 μg/μL).
- Dag 2: Transfeksjoner av HEK293T celler ved hjelp PEI
- Fjern Media og refeed med varm DMEM 1 h før transfeksjoner.
- Prewarm transfeksjoner reagenser og DMEM.
- Bruk 10 μg av plasmider av interesse som inneholder AAV ITR (AAV pCM109 EFS grobunn SG APC SG KRAS SG P53-KRAS HDR), 10 μg av AAV 2/9N kapsid plasmider (med rep genet av AAV2 og cap genet av AAV9, og 10 μg av hjelperen plasmider (pAdDelta F5 hjelperen) per plate (se tabell av materialer).
Merk: en ny generasjon av Helper plasmider-pAdDeltaF614,15,16 som kan også brukes til AAV produksjon er tilgjengelig. - Bland plasmider i 1 mL vanlig DMEM per tallerken. Deretter legger 90 μL av polyethylenimine (totalt plasmider: PEI konsentrasjon = 1:3) til plasmider mix og Vortex kort.
- Ruge den PEI-plasmider DNA mix i 20 min ved romtemperatur (RT).
- Tilsett Mix dråpevis på toppen av HEK293T celler og overføre platene til cellen kultur inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 for 24 h.
- Dag 3: middels endring etter transfeksjoner
- Fjern mediet helt og tilsett 15 mL fersk DMEM.
- Dag 5: høsting av viruset
- Forbered en tørr is/etanol bad.
- Samle cellene med en celle skraper og overføre dem til 50 mL rør (2 plater per 50 mL rør).
- Spin rør ved 800 x g i 15 min ved romtemperatur.
- Kast supernatanten fra alle rørene. Tilsett 0,5 mL av lyseringsbufferen (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) per plate (dvs. 5 mL for 10 plater) til kun det første røret. Resuspend cellene og Overfør det totale volumet til neste rør og Fortsett til det siste røret.
- Overfør celle fjæringen til et friskt 50 mL rør. Vask rørene med samme volum av lyseringsbuffer (0,5 mL per plate) med samme overføringsmetode som beskrevet i trinn 1.4.4.
- Subject cellen suspensjon til tre runder på ~ 10 min fryse/tine sykluser mellom en tørr is/etanol bad og en 37 ° c vannbad. Vortex kort etter hver tine.
- Hvis rensingen utføres på samme dag, angi likevekts og eluering buffer (se tabell 1 for oppskriften) på RT.
- Tilsett 50 enheter av benzonase per tallerken og ruge ved 37 ° c for 1,5 h.
Merk: Benzonase brukes til å fordøye rester av nukleinsyre syrer fra verts produsent cellene og plasmider DNA som finnes i celle fjæringen. - Snurr rørene på 3 000 x g i 15 min ved 4 ° c.
- Samle supernatanten i en sprøyte ved hjelp av en 18 G stål nål og skyv løsningen gjennom et 0,45 μm-filter til et 15 mL rør for å oppnå rå lysat.
- Oppbevar råoljen lysat ved 4 ° c i noen uker før rensing eller fortsette rensing.
2. AAV rensing
- Dag 5 eller nyere
- Plasser likevekts og eluering buffer på RT.
- Vask kromatografi søyler med 10 mL likevekts buffer.
- Tilsett 0,5 mL per tallerken heparin-agarose til kolonnen17 og legg deretter til likevekts buffer (4X volumet av heparin-agarose). Bland løsningene ved invertere kolonnen og la agarose sediment.
- Eluere likevekts buffer fra kolonnen ved tyngdekraften.
Merk: la noen likevekts buffer for å hindre at agarose tørker ut. - Legg råolje lysat på søylen og ruge i 2 timer ved 4 ° c med konstant omrøring. Bring kolonnen inn i en oppreist posisjon og la agarose til sediment.
- Eluere råoljen lysat av tyngdekraften.
- Vask kolonnen med likevekts buffer (4X volumet av heparin-agarose).
- Sett et 100-filter på kDa-filteret under kolonnen og eluere viruset ved hjelp av en eluering buffer (3x volumet av heparin-agarose) i filteret.
Merk: eluering buffer bør ikke overstige 15 mL. - Sentrifuger filteret ved 3 000 x g for ~ 30 min til mindre enn 1 ml er igjen i filteret.
- Fyll opp filteret med PBS og sentrifuger på 3 000 x g for ~ 30 min til mindre enn 1 ml er igjen i filteret. Gjenta dette trinnet 2x for å fjerne alle salter.
- Konsentrer viruset løsningen i filteret ved sentrifugering på 3 000 x g for å komme frem til et volum så liten som mulig (mindre enn 200 μL).
- Aspirer virus løsningen med en nål og sprøyte og skyv løsningen gjennom et 0,22 μm filter inn i et rør.
- Lag alikvoter av konsentrerte virale partikler for lagring.
Merk: alikvoter skal være ~ 20 μL for kortvarig lagring ved 4 ° c og ~ 5 μL for langtidslagring ved-80 ° c. - Bestem viral titer og viral Transduction effektivitet som beskrevet tidligere14,18,19,20.
3. isolering og kultur av primær celler
- Dag 1
- Euthanize en 6-ukers gammel mannlig eller kvinnelig B6; 129-gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9 *,-EGFP) Fezh/J av co2 kvelning eller noen annen IACUC godkjent protokoll.
Merk: disse CRISPR/Cas9 knockin musene har grobunn recombinase uttrykk for Cas9 ENDONUCLEASE og EGFP regissert av en CAG promoter. Den oppstrøms LOX-Stop-LOX (LSL) sekvensen til stede i Genova av disse musene hindre uttrykk for Cas9 og EGFP i fravær av grobunn recombinase. Når den brukes i kombinasjon med én guide RNAs (sgRNAs) og en grobunn kilde, de tillater redigering av én eller flere mus gener in vivo eller ex vivo14. - Analysere tungen fra euthanized mus ved hjelp av kirurgisk saks.
- Manuelt distansere vevet ved hakking tungen vev i svært små fragmenter ved hjelp av en skalpell. Samle vevs fragmentene i et 15 mL rør som inneholder 4,5 ml RPMI vanlig medium (med ut serum).
- Tilsett trippel enzym blandingen (200 μL) (se tabell 1 for oppskriften) til vevs fragmentene.
- Ruge vevet-enzymet Mix ved 37 ° c i 30 min og trykk på røret hver 10 min for å forbedre enzymatisk dissosiasjon av vevet.
- Tilsett 5% fosterets storfe serum (FBS) som inneholder HBSS/PBS til vevet-enzym mix for å stoppe enzymet handling.
- Filtrer over celle suspensjonen gjennom en steril 70 μm nylon mesh for å skille de spredte cellene og større vev fragmenter.
- Vask den filtrerte celle suspensjonen ved sentrifugering for 300 x g i 5 min i HBSS/PBS ved RT.
- Resuspend pellet i kultur medium (10% FBS i RPMI/DMEM) og vokse i 60 mm kultur retter til distinkte celle kolonier dannes.
- Kultur celle aggregater beholdt på toppen av filteret i en 60 mm kultur rett som inneholder 3 mL komplett Media (10% FBS i RPMI/DMEM) til celle kolonier dannes.
- Mikroskopisk undersøke primær cellene for tilstedeværelsen av Fibroblast forurensning etter 1 uke med kultur. Behandle de primære cellene utviklet fra aggregater og celle suspensjoner med 0,25 Trypsin 0,02% EDTA-løsning ved 37 ° c i 1 min for å fjerne fibroblaster.
Merk: vanligvis produserer den primære kulturen fra celle aggregater flere kolonier sammenlignet med enkelt celle suspensjoner. Cellene fra disse koloniene gir bedre Transduction effektivitet med AAV Transduction.
- Euthanize en 6-ukers gammel mannlig eller kvinnelig B6; 129-gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9 *,-EGFP) Fezh/J av co2 kvelning eller noen annen IACUC godkjent protokoll.
4. AAV Transduction av primær celler
- Dag 10
- Seed 2 x 105 primær celler per brønn i 6 brønn plater i 2 ml komplett Media (10% FBS i RPMI/DMEM).
- Neste dag, overfører cellene med 1012 viral Genova/ml (1010 transducing enheter/ml) og ruge cellene i viral partikkel-inneholdende medier for 48 h ved 37 ° c.
- Fjern viral partikkel-inneholdende Media og fôrer AAV-transduced celler med komplett Media.
Merk: bare celler som gjennomgikk Transduction vil uttrykke GFP og begynne å spre. Celler som ikke gjennomgår Transduction vil til slutt dø innen 2 uker. - Etter 2 uker med kultur ekspansjon, frø cellene for validering og in vivo tumorigene eksperimenter.
Merk: genomisk DNA fromAAV-transduced celler og normale primær celler fra Cas9 mus ble ekstrahert for å validere bestemte Genova redigering ved hjelp av standardprotokoller. Sekvensering av den utpakkede DNA og analyse av sekvensert data (tabell 2) ble utført ved hjelp av en hybridisering fangst-basert neste generasjons sekvensering analysen (f. eks MSK-Impact plattform) som beskrevet tidligere21.
5. validere transformasjonen av normale celler til tumorigene celler ved hjelp immunofluorescence og vestlig blotting
- Immunofluorescence
- Seed 2 x 105 celler på 12 mm glass coverslips og plassere dem i en inkubator over natten.
- Fix celler i 4% paraformaldehyde i PBS (pH = 7,4) og prosess for immunofluorescence merking.
- Ruge de faste cellene med det første primære antistoff i 1% BSA eller 1% serum i PBST i et fuktet kammer for 1 time ved RT eller over natten ved 4 ° c. Det primære Antistoffene anvendt er kaninen monoklonale anti-KRT 14, kanin monoklonale anti-E-cadherin antistoff, og Cas9 musen mAb.
- Fjern den primære antistoff løsningen fra coverslips ved å vaske cellene 3x i 5 minutter med 1x PBS.
- Ruge cellene med Cy3 esel anti-kanin IgG og/eller Cy3 geit anti-mus IgG sekundære antistoffer i 5% BSA i PBST for 1 time ved RT i mørket.
- Fjern den sekundære antistoff oppløsningen fra coverslips og vask cellene 3x som beskrevet i trinn 5.1.4.
- Monter coverslips med en dråpe festemiddel som inneholder DAPI (DAPI Fluoromount).
- Oppbevares i mørket ved 4 ° c til lysbildene er avbildet ved hjelp av fluorescens mikroskopi.
- Vestlig blotting
- Seed 1 x 106 forvandlet cellene i en 100 mm kultur rett og plassere dem i en inkubator over natten.
- Vask og skrap de forvandlet cellene til 200 μL iskald PBS.
- Sentrifuger røret som inneholder celle fjæringen i 10 min ved 2 000 x g ved 4 ° c til pellets cellene.
- Aspirer supernatanten og lyse cellene ved hjelp av lyseringsbuffer (se tabell 1) som inneholder fosfatase inhibitor cocktails og en protease inhibitor i 10 min ved 4 ° c. Sentrifuger lysater i 10 min ved 10 000 x g og 4 ° c og samle de ryddet lysater.
- Bruk en kommersielt tilgjengelig Bradford analysen kit å bestemme proteinkonsentrasjon etter produsentens protokoll. Bruk 4X prøve buffer (500 mM Tris pH = 6,8, 40% glyserol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% bromophenol blå) for å justere protein prøvene til 0,5 eller 1 μg/ΜL. kok ved 96 ° c i 5 minutter.
Merk: prøvene kan oppbevares ved-80 ° c eller til en Western Blot-analyse utføres. - Separate like mengder total lysat (30 μg) med 10% natrium natriumdodecylsulfat sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side). Sørg for at fargestoffet når bunnen av gelen. Overfør proteinet til nylon membranen ved semi-tørt blotting ved 25 V i 30 min.
- Hell 5% BSA i Tris-bufret saltvann (TBS)-0,1% mellom (TBST) over membranen for å dekke det helt. Blokker membranen for 1 time ved RT. ruge mebrane med primære antistoffer (anti-grobunn, anti-Cas9, anti-GFP, anti-β catenin, anti p53, anti-fosfat-ERK, og anti-β utgangen fortynnet i 5% BSA TBST) ved 4 ° c over natten.
- Etter inkubasjons, vask membraner i 10 minutter med 1x TBST å sørge for at løsningen dekker membranen helt. Utfør denne vasken 3x, og legg deretter til pepperrot peroksidase (HRP)-bøyd sekundært antistoff (fortynnet 1:10000 i 5% BSA TBST) til membranen. Ruge for 1 time ved RT.
- Etter inkubasjons, vask membraner i 10 minutter med 1x TBST å sørge for at løsningen dekker membranen helt. Utfør kjemiluminescens avbildning (se tabell over materialer) for å eksponere båndene, og ta bilder i henhold til dette.
- Validere tumorigene potensialet i transformert celler i immunkompetente mus
Merk: mus ble vedlikeholdt og behandlet i henhold til de institusjonelle retningslinjene for Ben-Gurion University of the Negev. Nikk. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (NOD. SCID) og C57BL/6-mus ble brukt til in vivo-studiene. Mus ble plassert i luft-filtrert laminær Flow skap med en 12 timers lys/mørk syklus og ble matet mat og vann ad lib.- Bruk 6-8 uke gammel kvinnelig NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (NOD. SCID) og C57BL/6-mus for studien.
- Trypsinize den AAV-Cas9 forvandlet celler. Stopp trypsinization med DMEM prewarmed ved 37 ° c og samle inn et 50 mL rør.
- Sentrifuger røret ved 800 x g i 10 min ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspend celle pellet i DMEM medium uten FBS. Utfør sentrifugering igjen og resuspend celle pellet i 1x PBS.
Merk: ikke Hold cellene i 1x PBS for lenge. Hold alltid cellen suspensjon på isen for å hindre celle klumper. - Bruk en automatisk celle teller for å telle cellene og fortynne cellene til ønsket konsentrasjon (2,5 x 107 celler/ml) ved hjelp av 1x PBS. Generer svulster gjennom en subkutan injeksjon av AAV-Cas9 forvandlet celle suspensjon i høyre flanke av hver NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (NOD. SCID) mus (2 x 106 celler/mus). For å generere en lasteceller modell i syngeneic mus, injisere 0,5 × 106 primær celler eller AAV-Cas9 forvandlet celler til TUNGEN av C57BL/6 immunkompetente mus.
- Euthanize dyrene 2 ukens postinjection av CO2 kvelning, og analysere svulster fra euthanized mus for immunhistokjemi analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke AAV-systemet til å transformere normale Cas9-celler
Figur 1 gir et detaljert vektor kart over AAV transgene plasmider som brukes i denne studien. Figur 2 skisserer design og arbeid av AAV-Cas9 basert-system. Å produsere viral partikler, HEK293T cellene ble transfekterte med AAV transgene vektor og andre viral emballasje vektorer bruker PEI transfeksjoner metoden. Etter transfeksjoner ble viruset som inneholder celler samlet og lysert, og ved hjelp av heparin-agarose rensing prosessen, ble viral partiklene renset og konsentrert (figur 2A). Disse renset viral partikler ble brukt for in vitro transformasjon av primær celler isolert fra Cas9 mus for å sjekke effekten. I vårt system, den AAV transgene Expression kassetten er innført gjennom homologe rekombinasjon inn i grobunn-avhengige Cas9 Rosa26 målretting mal innen muse celler som bærer en allestedsnærværende CAG promoter (pCAG), en LoxP-Stop-LoxP kassett (LSL), en Cas9 nuklease genet, en selv-spalte P2A peptid, og reporteren genet (EGFP) flankert av to homologe armer14. Den grobunn recombinase aktivitet av transduced celler avgifter LSL og induserer Cas9 og GFP uttrykk (figur 2B). Cas9 nuklease aktivitet introduserer en dobbel-strandet pause på målnettsteder av interesse, regissert gjennom gRNAs, og hjelper i genredigering. AAV-systemet som brukes i denne studien hjelper med å levere multiplekset gRNAs (sgRNAs for KRAS, p53 og APC), og også i å uttrykke en kreftfremkallende KRASG12D allel gjennom homologi-rettet reparasjon (HDR) i de transduced cellene.
Figur 1: Vector kart over AAV transgene plasmider brukt i denne studien. Dette AAV systemet har en AAV ryggrad som uttrykker grobunn recombinase og tre U6-drevet sgRNAs målgruppe KRAS, p53, og APC. Den inneholder også en KRAS G12D homologi-regissert reparasjon (HDR) donor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: design og arbeid av et AAV-Cas9 system for å transformere normale celler. (A) omriss av produksjon og rensing av AAV partikler fra HEK293T etter transfecting dem med AAV transgene og emballasje plasmider. (B) viral Transduction av primære celler med AAV partikler og mekanismen som grobunn-avhengige Cas9 uttrykk muliggjør CRISPR redigering og transformasjon av primær celler til tumorigene celler. En enkelt AAV vektor integrere gRNAs for tre forskjellige gener med en knockin av KRAS G12D allel gjennom HDR med en grobunn recombinase uttrykk kassetten ble levert inn grobunn-avhengige Cas9 mus primære celler. Grobunn recombinase aktivitet i transduced cellene fører til fjerning av LoxP-Stop-LoxP kassett og induserer Cas9 og GFP uttrykk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Validering av AAV-Cas9 system in vitro i isolerte mus embryonale Fibroblast celler
Primær mus embryonale Fibroblast (MEF) celler har blitt brukt utelukkende for å studere konsekvensene av gen ablasjon i mobilnettet vekst og spredning22. For å validere effektiviteten av AAV-Cas9 systemet i å transformere normale celler, transduced vi MEF celler isolert fra Cas9 mus embryo (E14) med AAV. De MEF cellene ble isolert som beskrevet tidligere23,24. MEFs fra 14-dagers-gammel Cas9 mus embryo ble brukt fordi de er enkle å kultur og overfører in vitro. I korte trekk, for å transformere MEFs via AAV Transduction, ble primære MEFs på ca. 30% samløpet betraktet som klare for Transduction. En time før Transduction ble MEF kultur Media endret. Den renset AAV ble tint på isen og MEF kulturen Media ble pustende. Viral supernatanten med en titer varierende fra 106-1014 viral Genova/ml ble tilsatt til hver brønn og inkubert over natten ved 37 ° c. Den virale supernatanten ble fjernet etter 48 h, erstattet med 2 mL MEF kultur medium, og deretter inkubert ved 37 ° c til GFP uttrykk, ca 5 dager etter Transduction. GFP-uttrykker MEFs ble subcultured og validert. Merk at for denne vektoren fant vi at 1012 viral genomer/ml (tilsvarende 1010 transducing enheter/ml) kunne effektivt transformere primære MEF celler til tumorigene MEFs (Figur 3A). De transduced cellene uttrykte grobunn, Cas9, og GFP (Figur 3B, C). For å få tilgang til tumorigene potensialet i AAV transformert MEF-celler, 0,5 x 106 celler (Primær/AAV-transduced MEF) ble injisert i tungen, leppe, og SUBKUTANT i Nod-SCID mus. Transformert celler dannet svulster i disse musene, sammenlignet med den primære MEF, som ikke danner svulster (Figur 3D-F).
Figur 3: validering og in vitro-transformasjon av PRIMÆRE MEF-celler ved hjelp av AAV-Cas9-systemet. (A) omrisset av in vitro transformasjon av fibroblaster fra embryo innsamlet fra Cas9 mus ved hjelp av AAV partikler. (B) representant immunofluorescence bilde av primære MEF og AAV-transduced MEF celler som viser uttrykk for GFP, grobunn, og Cas9. DAPI ble brukt til å beis kjernen. (C) vestlige blotting viser grobunn, CAS9, GFP, og β-utgangen i embryonale normale fibroblaster og genetisk redigerte fibroblaster. (D) representative bilde av en tungen svulst som utviklet seg i en Nod-SCID mus etter injisere den med forvandlet Fibroblast celler. (E) representative bilde av en leppe svulst som dannes i en Nod-SCID mus etter injisere den med forvandlet Fibroblast celler. (F) representative bilde av en flanke svulst som utviklet seg i en Nod-SCID mus etter injisere den med forvandlet Fibroblast celler. Pilene indikerer en svulst. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
In vitro generasjon av tumorigene murine tungen epitel cellelinje fra primær tungen epitelceller ved hjelp av AAV-Cas9 system
Etter å ha validert transformere eiendommen til AAV systemet ved hjelp av MEF cellene, isolerte vi primær tungen epitelceller fra Cas9 mus og kultivert dem in vitro. Den primære tungen cellene ble transduced med AAV viral partikler (1010 CFU/ml), og etter en uke celler begynte å uttrykke GFP. Den tumorigene transformasjonen av primær tungen epitelceller (Figur 4A) ble bekreftet ved hjelp immunofluorescence og vestlige blotting (Figur 4B, C). De forvandlet cellene utstillingen forbedret KRT 14, E-cadherin, og GFP uttrykk (Figur 4B). Den tumorigene transformasjonen av primær tungen epitelceller ble bekreftet av uttrykket av GFP (dvs. det grobunn-avhengige uttrykk for Cas9 og GFP) (Figur 4C). Uttrykket av KRT14 og E-cadherin bekrefter deres epitel celle egenskaper. Protein godkjenningen bekreftet forbedret β-catenin, fosfat-erk, og redusert p53 uttrykk (Figur 4C), som indikerer effektiv downregulation av APC og p53 og inkorporering av mutant KRAS i tungen celler, og dermed gjør dem tumorigene. Genomisk analyse av dype sekvenser av DNA isolert fra transformert celler bekreftet effektiv genredigering og ramme-forskyvning av TP53 og APC gener ved AAV-Cas9 system (tabell 2). Den tumorigene eiendommen til AAV-transformert tungen cellelinje ble ytterligere vurdert ved å injisere den i tungen av immunkompetente vill type C57BL/6 mus. De forvandlet tungen celler, utpekt som KRAS mutant epitelceller i tungen (KRAS mut EpT), form svulster effektivt i C57BL/6 mus (Figur 4D). KRAS mut EpT-svulster ble evaluert av en oral og Maxillofacial patologen av rutinemessige hematoksylin og eosin (H & E) farging og ved immunhistokjemi. Den svulster utstilt en spindel celle morfologi med fremtredende kjernefysiske atypi: PleoMorphism, hyperchromatism, gigantiske kjerner, flere nucleoli, og en høy mitotisk hastighet med atypisk mitotisk tall. Inflammasjon invasjon og angioinvasion ble også notert. Disse morfologiske funksjoner ble ledsaget av svært begrenset til ikke-eksisterende tumor-assosiert betennelse. Immunohistochemically, de neoplastic cellene var cytoplasmically positive for E-cadherin og KRT 14, begge markører av epitel vev. KRT 14 er typisk for plateepitel, støtter plateepitel opprinnelsen til tumorceller og dermed diagnostisering av plateepitelkreft (Figur 4E). Derfor gir denne tilnærmingen en allsidig metodikk for å transformere primære celler in vitro med en ønsket gen endring. I tillegg forenkler denne metodikken bruken av disse utviklede cellelinjene i vivo i syngeneic mus for bedre forståelse av neoplasi i en reell tumor mikromiljøet miljø.
Figur 4: in vitro transformasjon av primær tunge epitelceller ved hjelp av AAV-Cas9 system. (A) skjematisk fremstilling av in vitro transformasjon av normale epitelceller Hentet fra tungen av Cas9 mus. (B) representativ immunofluorescence bilde av AAV-transduced tunge epitelceller som viser uttrykk for KRT14, E-cadherin, og GFP. (C) Western Blot viser Cas9, β-catenin, og FOSFAT-erk oppregulering med p53 protein nivå downregulation, viser genetisk redigerte epitelceller. (D) representativt bilde av en svulst som utviklet seg i tungen til immunkompetente musene etter å ha injisert dem med transformert tungen epitelceller (KRAS mut EpT). (E) representative bilder av tumor vev seksjoner for H & E, e-cadherin, og KRT 14 farging på 20x og 40x forstørrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Cellelyse Rings buffer for viral høsting | Volum |
| 150 mM NaCl | 876.6 mg |
| 50 mM Tris-HCl | 605.7 mg |
| Bruk HCl til å justere pH 8,5 | |
| Molekylær karakter vann | Utgjør 100 mL |
| Likevekts buffer | |
| 1 mM MgCl2 | 9,52 mg |
| 2,5 mM KCl | 18.64 mg |
| Bland alt i PBS 1X og justere pH til 7,2 | Utgjør 100 mL |
| Eluering buffer | |
| 0,5 M NaCl | 2.92 g |
| Bland alt i PBS 1X og justere pH til 7,2 | Utgjør 100 mL |
| 10X trippel enzym lagerløsning: | |
| Kollagenase | 1 g avsluttende CONC. [10 mg/ml] |
| Hyaluronidase | 100 mg [1 mg/ml] |
| DNase | 20 000 enheter endelig CONC. [200 mg/ml] |
| PBS 1X | Utgjør 100 mL |
| Plasmider mix (for en 14.5 cm plate) | |
| AAV pCM109 EFS grobunn SG APC SG KRAS SG P53-KRAS HDR | 10µg |
| AAV 2/9 kapsid vektor | 10µg |
| pAD delta F5 hjelper | 10µg |
| PEI (1μg/μL Stock) | 90 μL |
| DMEM | 1 mL av |
Tabell 1: oppskrifter av buffere som brukes i denne studien.
Tabell 2: Genova analysedata av Kras mut EpT-celler. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere metoder har tidligere blitt brukt til å transformere primær celler i kultur med varierende grad av suksess25,26,27,28. De fleste av disse metodene bruker mus Fibroblast celler for transformasjon14,17,18,19 eller bruke kreftfremkallende stoffer som 4-nitroquinoline-1-oksid (4-NQO)21,22 for utvikling av murine cellelinje modeller. Bruk av knockout og transgene Mouse modeller har også kraftig forbedret vår forståelse av de ulike molekylære trasé som styrer utvikling og differensiering av HNC. Bruk av murine orale epitel cellelinjer med en unik genetisk mønster ville sikkert utfylle disse studiene, og deres påfølgende biokjemiske analyser ville bidra til behandling og diagnostisering av HNC. Men bare noen få rapporter har beskrevet etablering av musen oral epitelceller28,29,30,31,32,33 og disse cellelinjer er ikke i utbredt bruk.
Den store begrensningen av disse murine oral epitel cellelinjer er at de ikke er preget mye på molekylær nivå og ble funnet å uttrykke uvanlig gen mønstre. Således, begrenset molekylær forståelse av disse murine cellelinje modeller og mangelen på en effektiv metodikk bedt oss om å utnytte det unike potensialet i AAV-CRISPR Genova redigering teknologi i Cas9 knock-in mus for å etablere murine cellelinjer med spesifikke gen endringer. I denne studien, introduserte vi og utviklet en in vitro AAV-Cas9 system for å transformere primære murine celler til en tumorigene tilstand for å bekrefte de genetiske endringene som gir opphav til kreftceller. Vi lyktes etablert murine tungen epitelceller med spesifikke genmutasjoner med høy effektivitet ved hjelp av AAV-mediert CRISPR-indusert somatiske genredigering av flere sgRNA kombinasjoner.
Denne metodikken tilbyr en ny eksperimentell tilnærming for bedre å forstå den celle-autonome etiologi av HNC. Fra og med murine primære tunge epitelceller, var vi i stand til å transformere slike celler til tumorgenisitet hos ved å slette et begrenset sett av gener og innføre en enkelt KRAS mutasjon. Ved hjelp av denne metodikken, er det nå mulig å undersøke om andre gener kjent for å være innblandet i andre kreftsvulster kan produsere ondartet som ligner nærmere HNC. De morfologiske egenskapene til svulster fra KRAS mut EpT bekreftet plateepitelkreft. Histopathological analyse av KRAS mut EpT-svulster i syngeneic mus er assosiert med og støttende for den aggressive biologiske oppførselen til hode-og nakke kreft. Således kan det være mulig å knytte genotyper av kreftceller til spesifikke kliniske og histopathological funksjoner av svulster.
De viktigste fordelene med denne metodikken er evnen til å utvikle cellelinjer fra primær celler fra ethvert organ ved hjelp av spesifikke genmutasjoner og bruk av AAV-Cas9, som gjør systemet mer robust og stabilt. Den endogene Cas9 systemet gjør det mulig å utnytte andre genet Knockouts. Den store ulempen med dagens metodikk er tiden det tar å isolere og etablere den primære kulturen samt høy titer av viral partikler som trengs for å overfører de primære cellene. Dette kan imidlertid overvinnes ved å standardisering isolasjons prosessen for hver celle type. Problemet med å kreve en høy AAV viral titer for effektiv Transduction kunne lindres ved bruk av den nyeste generasjonen av kapsid og hjelper plasmider for viral pakking og en bedre rensing prosess.
I fremtiden kan et bedre og mer effektivt AAV-system utformes og ekstrapolert in vivo for å gjøre organ spesifikk genetisk modifiserte tumor modeller. I konklusjonen, etablere murine cellelinjer ved denne tilnærmingen vil tjene som en verdifull in vitro cellekultur-basert verktøy for å teste flere hypoteser i sammenheng med onkologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.S. er på Advisory Board of the Bioscience Institute, og Menarini Ricerche har fått forskningsmidler fra Puma bioteknologi, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics, og Menarini Ricerche. M.S. er også en av grunnleggerne av Medendi Medical Travel, og har i de siste 2 årene fått honoraria fra Menarini Ricerche og ADC Pharma. Alle andre forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Dr. Daniel Gitler for å gi oss med pAd delta 5 Helper plasmider. Dette arbeidet ble finansiert av Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (til ME), USA-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (til Me og MS), Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (til ME), Israels Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (til ME), og bekymringen Foundation (#7895) (til ME). Fellowship: den Alon fellesskap til meg og BGU Kreitman stipend til SJ og MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
