Summary
Ce travail présente un protocole pour produire des cultures cellulaires homogènes des neurones moteurs oculomoteurs, trochléaires et spinaux primaires. Ces cultures peuvent être utilisées pour des analyses comparatives des caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques des neurones moteurs oculaires et spinaux.
Abstract
Les neurones oculomoteurs (CN3) et les neurones trochléaires (CN4) présentent une résistance remarquable aux maladies dégénératives des neurones moteurs comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) par rapport aux neurones moteurs rachidiens (SMN). La capacité d'isoler et de culture rattacher les CN3, les CN4 et les NSM primaires fournirait une approche des mécanismes d'étude sous-jacents à cette vulnérabilité sélective. À ce jour, la plupart des protocoles utilisent des cultures cellulaires hétérogènes, ce qui peut confondre l'interprétation des résultats expérimentaux. Pour minimiser les problèmes associés aux populations de cellules mixtes, les cultures pures sont indispensables. Ici, le premier protocole décrit en détail comment purifier et cultiver efficacement les CN3/CN4 aux côtés des homologues SMN des mêmes embryons en utilisant le jour embryonnaire 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embryons de souris transgéniques. Le protocole fournit des détails sur la dissection et la dissociation des tissus, l'isolement cellulaire à base de FACS et la culture in vitro de cellules des noyaux CN3/CN4 et SMN. Ce protocole ajoute un nouveau système de culture in vitro CN3/CN4 aux protocoles existants et fournit simultanément une culture SMN pure et équivalente à l'âge pour la comparaison. Des analyses axées sur les caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques des neurones moteurs sont réalisables dans ce système de culture. Ce protocole permettra de rechercher les mécanismes qui définissent le développement des neurones moteurs, la vulnérabilité sélective et la maladie.
Introduction
La culture des neurones moteurs primaires est un outil puissant qui permet l'étude du développement neuronal, de la fonction et de la susceptibilité aux facteurs de stress exogènes. Les cultures de neurones moteurs sont particulièrement utiles pour l'étude des maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA)1,2, dont les mécanismes de la maladie sont incomplètement compris. Fait intéressant, malgré la mort cellulaire significative des neurones moteurs rachidiens (SMN) chez les patients atteints de SLA et les souris modèles de SLA, la mort cellulaire dans les neurones oculomoteurs (CN3) et les neurones trochléaires (CN4) sont relativement rares1,3,4,5,6,7,8,9. Par conséquent, des analyses comparatives des cultures pures des CN3/CN4 et des NSM pourraient fournir des indices importants sur les mécanismes sous-jacents à la vulnérabilité relative. Malheureusement, un obstacle majeur à de telles analyses a été l'incapacité de cultiver des cultures purifiées de ces neurones moteurs.
De nombreux protocoles ont été décrits pour la purification des SMN à partir de modèles animaux. La plupart de ces protocoles utilisent la centrifugation de gradient de densité10,11,12 et/ou p75NTR-techniques de panoramique à base de cellules à base d'anticorps13,14,15,16. La centrifugation de gradient de densité exploite la plus grande taille des SMN par rapport à d'autres cellules spinales, tandis que p75NTR est une protéine extracellulaire exprimée exclusivement par des SMN dans la moelle épinière. Près de 100% pure cultures SMN ont été générés par l'un ou les deux de ces protocoles11,12,14. Cependant, ces protocoles n'ont pas réussi à générer des cultures CN3/CN4 parce que les CN3/CN4 n'expriment pas p75NTR, et d'autres marqueurs CN3/CN4 spécifiques n'ont pas été identifiés. Ils sont également plus petits que les NSM et, par conséquent, plus difficiles à isoler en fonction de la taille. Au lieu de cela, les études in vitro de CN3 ou CN4se se sont appuyées sur des cultures dissociées17,18,19,20,21, explanter17,22,23,24,25,26, et tranche27,28 cultures, qui sont composées de types de cellules hétérogènes, et aucun protocole n'a existé pour le l'isolement et la culture des CN3 primaires ou des CN4.
Ici, un protocole est décrit pour la visualisation, l'isolement, la purification et la culture des CN3, des CN4 et des NSM du même jour embryonnaire 11,5 (E11.5) IslMN:GFP souris transgéniques29 (Figure 1, Figure 2A). IslMN:GFP étiquette spécifiquement les neurones moteurs avec un GFP farnédilaté qui se localise à la membrane cellulaire. Ce protocole permet de comparer les espèces et l'âge de plusieurs types de neurones moteurs afin d'élucider les mécanismes pathologiques dans la maladie des neurones moteurs.
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Protocol
Toutes les expériences utilisant des animaux de laboratoire ont été réalisées conformément aux lignes directrices des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et avec l'approbation du Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Hôpital pour enfants de Boston.
1. Mise en place d'accouplements chronométrés avant la dissection
- Pour générer des souris embryonnaires prénatales pour la récolte des neurones moteurs, peser chaque souris femelle et mettre en place l'accouplement chronométré entre les souris transgéniques IslMN:GFP adultes 11,5 jours avant le jour de l'isolement neuronal. Pour développer ce protocole, 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP souris, âgés de 2 à 9 mois, ont été utilisés et l'accouplement chronométré a été mis en place dans la soirée.
- Examinez les souris femelles pour les prises vaginales le lendemain matin. Considérez la date à laquelle le bouchon est identifié comme jour embryonnaire (E) 0,5.
- Peser les souris femelles et examiner les chiots à l'aide de l'échographie (voir tableau des matériaux) entre E8.5-11. Vérifiez les signes d'accouplement réussi.
- Confirmez l'accouplement réussi en détectant le gain de poids chez les souris femelles (habituellement 1,5 g sur E9.5 s'il y a plus de 5 à 6 embryons).
- Confirmer visuellement les embryons par ultrasons. Les embryons sont facilement détectables par ultrasons après E9.5. Les échographies sont effectuées uniquement sur les femmes qui ont pris du poids parce qu'elles sont plus souvent enceintes que celles qui ne le font pas.
REMARQUE: Les souris femelles peuvent prendre du poids pour des raisons autres que la grossesse, de sorte que le gain de poids seul n'est pas un indicateur fiable de la grossesse. La confirmation par ultrasons empêche les sacrifices inutiles de femmes qui ne sont pas enceintes, mais qui ne sont pas cruciales si elles ne sont pas disponibles.
2. Conditions de dissection et préparation des instruments
- Effectuer tous les revêtements (sauf le nettoyage acide des couvertures), la préparation des médias, la dissociation des tissus (à l'exception de la centrifugation et l'incubation), et le travail de culture dans une hotte à flux laminaire pour assurer la stérilité des neurones moteurs des médias et des embryons.
- En accordavec une attention particulière à la technique stérile, effectuez une dissection tissulaire à l'extérieur d'une hotte à débit laminaire avec un risque minimal de contamination.
- Stérilisez une plaque de dissection, une paire de ciseaux microdissés, une paire de pinces de pansement, deux paires de pinces À pinces À #5 Dumont, un couteau microdissé, et une mini cuillère perforée Moria en plongeant dans 70 % d'éthanol avant d'être utilisé.
3. PDL/Laminin Coating of Dishes/Coverslips
REMARQUE: La culture a dissocié les neurones moteurs primaires dans 96 plaques de puits ou 24 puits, selon le nombre de cellules requises pour l'application. Les cellules peuvent être représentées directement dans la plaque de culture tissulaire sans l'utilisation de résilles si les puits sont optiquement transparents et les épaisseurs sont compatibles avec l'imagerie.
- Pour les applications nécessitant des couvertures, préparez des couvertures nettoyées à l'acide, stérilisées et séchées à l'air au moins 2 jours avant l'isolement des neurones, comme décrit précédemment30. Les lots de couvertures peuvent être préparés de cette manière bien avant les expériences et peuvent être stockés jusqu'à 6 mois sans impact sur la qualité expérimentale.
- Préparer une solution de travail de 20 g/mL poly D-lysine (PDL) en phosphate tamponné saline (PBS) 2 jours avant l'isolement neuronal.
- Aliquot PDL (1 mg/mL) à l'avance et stocker à -20 oC comme solution de stock.
- Couvrez la surface de chaque bordereau ou le puits de la plaque de culture tissulaire avec une solution de travail de solution PDL suffisante (p. ex., 100 L par puits sur 96 plaques de puits ou 500 l par puits sur 24 plaques de puits avec ou sans couvertures). Incuber toute la nuit à 37 oC.
- Le lendemain, lavez 3x avec de l'eau stérilisée.
- Sceller les assiettes avec du film de paraffine et conserver les assiettes lavées enduites de PDL à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 1 mois si elles sont séchées complètement après le lavage final.
- Préparer une solution de travail avec 10 l de laminin (1,1 à 1,2 mg/ml) dans 1,2 mL de PBS.
- Stocks de lamininali (1,1 à 1,2 mg/ml) à l'avance et entremtuens à -80 oC.
- Couvrir la surface de chaque bordereau ou bien avec une solution de laminine suffisante pour enrober uniformément la surface. Incuber pendant au moins 2 h à 37 oC avant de l'utiliser.
REMARQUE: Les plaques et les plaques de couverture enduites de PDL/laminin peuvent être stockées jusqu'à 1 semaine à 37 oC, mais la lamininine fraîchement enrobée est préférable. Retirer la laminine directement avant de placage30. Laminin ne doit pas être autorisé à sécher. Si les plaques doivent être stockées pendant plus de plusieurs heures, elles doivent être enveloppées dans du film de paraffine.
4. Préparation de dissection, de la culture de neurones moteurs, et des solutions de dissociation
REMARQUE: Les concentrations entre parenthèses indiquent les concentrations finales de chaque réactif.
- Préparer le milieu de dissection.
- Décongeler le sérum de cheval inactivé par la chaleur pendant la nuit à 4 oC, préparer 1 mL d'aliquots et conserver à -20 oC. Décongeler les aliquots à RT directement avant utilisation.
- Conserver le supplément de B27 (50x) dans 1 ml d'aliquots à -20 oC. Décongeler les aliquots à RT immédiatement avant utilisation. Évitez les cycles de gel/dégel.
- Conserver le supplément de glutamine (100x) à 4 oC ou -20 oC. Diviser en 0,5 ml d'aliquots en stockant à -20 oC.
- Conserver la pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) dans 1 mL d'aliquots à -20 oC. Décongeler les aliquots à RT immédiatement avant utilisation.
- Pour rendre le milieu de dissection, mélanger 9,4 mL d'Hibernate E avec 200 l de sérum de cheval (2 %), 200 oL de supplément de 50 x B27 (1x), 100 oL de supplément de glutamine 100x (1x) (p. ex. GlutaMAX) et 100 l de 10 000 U/mL de pénicilline-streptomycin (100 UL/mL). Utilisez ce milieu pour recueillir les tissus disséqués et faire la suspension finale des cellules dissociées.
- Ajouter 500 l de la dissection moyenne à individuelle 1,7 mL tubes microcentrifuge pour la collecte des tissus la veille de l'isolement neuronal. Préparer un tube pour chaque type de tissu qui sera recueilli (p. ex., contrôle positif, contrôle négatif, CN3/CN4, SMN) et le stocker à 4 oC avant l'utilisation.
- Combinez 49 mL de milieu hibernat E à faible fluorescence avec 1 ml de supplément B27 (1x) et remplissez une plaque de 24 puits avec ce milieu (2 mL/bien) la veille de l'isolement neuronal. Utilisez ce plat pour la collecte d'embryons de souris. Conserver à 4 oC avant l'utilisation.
- Préparer le milieu de culture des neurones moteurs.
- Préparer 250 aliquots ll de 25 mM 2-mercaptoethanol dans le milieu L15 de Leibovitz. Conserver à -20 oC.
- Générez 5 aliquots ll de 100 solutions de BDNF, CNTF et GDNF diluées dans de l'eau stérilisée. Conserver à -80 oC et décongeler les aliquots à RT immédiatement avant l'utilisation.
- Préparer une solution de forskoline de 10 mM en ajoutant 64 ll de sulfoxure de diméthyle (DMSO) à 5 mg (1,0670 M) de forskoline et de vortex pour bien se dissoudre complètement. Ajouter ensuite de l'eau stérilisée (1,003 ml) à la solution DMSO et à un puits de vortex. Entreposer 12 aliquots de 10 mm de forskoline à -20 oC et décongeler les aliquots à RT immédiatement avant l'utilisation.
- Préparer 12 aliquots ll de 100 mM d'isobutylmethylxanthine (IBMX) dilués dans DMSO. Conserver à -20 oC et décongeler les aliquots à RT immédiatement avant l'utilisation.
- Pour rendre le milieu de culture des neurones moteurs, mélanger 9,4 ml de milieu neurobasal avec 200 l de sérum de cheval (2 %), 200 l de supplément de 50x B27 (1x), 100 oL de supplément de glutamine 100x (1x 100 oL de 10 000 U/m : pénicilline-streptomycine (100 U/mL), et 20 l de 25 mM 2-mercaptoethanol (50 M), de préférence directement avant utilisation. Cette étape peut être effectuée jusqu'à 1 jour avant l'isolement des neurones.
- Juste avant l'utilisation, ajouter 1 oL chacun de 100 G/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL), et GDNF (10 ng/mL) et 10 oL de forskoline de 10 mM (10 m) et 10 ML de 100 mIBMX (100 m) au milieu de la culture du moteur. Préréchauffer le milieu à 37 oC.
- Préparer les solutions de dissociation.
- Préparer la solution de papaïne (20 U/mL papain et 0,005% DNase) et une solution d'inhibiteur d'albumine-ovomucoid (1 mg/mL inhibiteur ovomucoid, 1mg/mL albumin, et 0.005% DNase) suivant les instructions du fabricant.
- Préparer 500 aliquots ll de chacune des solutions d'inhibiteurs ovomucoid et de papaïne et entreposer à -80 oC. Décongeler les aliquots à 37 oC immédiatement avant l'utilisation.
5. Dissection du cerveau du cerveau et de la moelle épinière ventrales
REMARQUE: Effectuez toutes les étapes suivantes, à l'exception des étapes 5.1.1-5.1.3 et 5.1.5-5.1.6 sous un stéréomicroscope de dissection de fluorescence. Le temps total de dissection par expérience est généralement de 3 à 5 h, selon la compétence à la technique de dissection et le nombre de neurones moteurs requis pour chaque expérience.
- Dissection ventrale de midbrain
- Euthanasier une souris enceinte environ 11,5 jours après la fécondation par le gaz carbonique et la luxation cervicale.
- Vaporiser l'abdomen à fond avec de l'éthanol et enlever l'utérus à l'aide de ciseaux microdisséssants stériles et de forceps de pansement du pouce. Laver l'utérus brièvement dans le PBS stérile, puis transférer à la plaque de dissection remplie de PBS stérile préréfrigéré.
- Retirez soigneusement les embryons islMN:GFP-positifs de l'utérus à l'aide de ciseaux microdissés stériles, de pinces à pansement du pouce et de pinces À #5 Dedumont dans un PBS stérile glacé sous la lumière vive du microscope. À l'aide d'une cuillère stérile Moria mini-perforée, transférer chaque embryon dans un puits séparé d'une plaque de 24 puits remplie d'un milieu de faible fluorescence Hibernate-E préréfrigéré complété par 1x B27. Gardez la plaque de 24 puits sur la glace.
- Transférer un embryon dans une plaque de dissection stérile et le recouvrir complètement de la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hank, froide et stérile.
- Assurez-vous que les étapes de dissection sont effectuées sous l'illumination de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) du microscope. À l'aide d'une pince à épiler, enlever la queue et le visage de l'embryon sans endommager le cerveau moyen (Figure 2Ba). Placez l'embryon enclin avec des membres chevauchés en dessous et la queue pointant vers l'avant du microscope, vers le dissector (indiqué par un astérisque, Figure 2Bb).
- À l'aide d'une pince à épiler, ouvrir le toit du quatrième ventricule afin de générer une petite ouverture. Utilisez cette ouverture pour crocheter des pinces dans l'espace créé entre le quatrième ventricule et son toit. Disséquer le long de la surface dorsale de l'embryon rostral au cortex et latérale à la plaque de plancher et à la colonne motrice (Figure 2Ca,b). Ouvrez le tissu disséqué d'une manière ouverte-livre pour indiquer les noyaux GFP-positifs CN3 et CN4.
REMARQUE: Un petit morceau de tissu du cerveau moyen ventral contenant du mésenchyme, du CN3 et du CN4 sera maintenant exposé. - Séparez soigneusement le cerveau ventral du milieu de l'embryon et retirez le tissu méningéàen à l'aide d'une pince à épiler et d'un couteau microdissétant. Disséquez les noyaux CN3 et CN4 positifs bilatéraux de GFP loin de la plaque de plancher et d'autres tissus environnants GFP-négatifs à l'aide de pinces à épiler et d'un couteau microdissécutoire (figure 2D). Maximisez le nombre de neurones moteurs GFP-positifs dans le tissu excisé, mais évitez de les toucher ou de les endommager.
- Si une collection de noyaux CN3 et CN4 distincts est désirée, coupez le long de la ligne médiane de ces deux noyaux (ligne pointillée jaune dans la figure 2D). À l'aide d'une pipette P1000, recueillir le tissu ventral du cerveau ventral disséqué avec un HBSS minimal et le placer dans un tube de microcentrifuge de 1,7 ml étiqueté rempli de milieu de dissection (voir l'étape 4.1.5). Conserver sur la glace jusqu'à la dissociation.
- Continuer à mettre en commun les cerveaux ventrales à partir d'embryons supplémentaires dans le même tube jusqu'à ce que le nombre total réponde à l'exigence expérimentale (se référer à l'étape 8 pour les numéros cellulaires idéaux).
REMARQUE: Une collection mise en commun d'au moins 10 midbrains ventral produisant environ 1 x 104 neurones moteurs CN3/CN4 est recommandée parce que les tissus sont sujets au stress pendant la dissociation et le tri.
- Dissection ventrale de moelle épinière
- Gardez l'embryon enclin avec la tête face à l'avant du microscope, vers le dissector. Tenez l'embryon avec une pince à épiler et insérez la pointe de l'autre paire de pinces dans la partie caudale non ouverte du quatrième ventricule.
- Ouvrez le reste du cerveau postérieur et de la moelle épinière dorasiquement sur l'étendue rostrocaudale entière de l'embryon. Ouvrez en coupant le tissu dorsal, à partir du quatrième ventricule et en travaillant vers le canal central de la moelle épinière caudale en utilisant les forceps comme ciseaux (Figure 2Ca,b). Prenez soin d'éviter de toucher ou d'endommager la moelle épinière ventrale au cours de cette procédure.
- Tenez l'embryon avec une pince à épiler et pincez le lambeau du tissu dorsal de chaque côté avec l'autre paire de pinces (Figure 2Ea,b).
REMARQUE: Les tissus dorsaux excisés contiennent la peau dorsale, le mesenchyme, les ganglions de racine dorsal (DRGs), le cerveau postérieur dorsal, et la moelle épinière. Enlever autant de ces tissus que possible sans endommager les noyaux SMN, car ils sont adhésifs et peuvent piéger les NMS pendant le filtrage ou provoquer l'engorgement pendant le tri FACS. - Retirez la moelle épinière ventrale à l'aide du couteau à microdissection pour percer directement en dessous du SMN GFP-positif. Soulevez la moelle épinière ventrale avec des mouvements semblables à des scies des deux côtés (Figure 2Fa,b). Couper la moelle épinière ventrale flottante transversalement directement au-dessus de C1, où les premiers projets de corne antérieure GFP-positif (Figure 2G). De plus, coupez transversalement à la limite supérieure du membre inférieur (Figure 2G). Enlever la partie cervicale (C1)-lombaire (L2-L3) de la moelle épinière ventrale après cette procédure.
- Placez le côté dorsal ventral de moelle épinière vers le haut et maintenez en appuyant sur le tissu GFP-négatif entre les colonnes GFP-positives de SMN avec une paire de pinces. Enlever le mesenchyme, les DRG et la moelle épinière dorsal en coupant les deux côtés de la colonne SMN gFP-positive avec le couteau de microdissection (Figure 2H). Prenez soin de maximiser les neurones moteurs GFP-positifs sans les endommager.
- À l'aide d'une pipette P1000, recueillir le tissu ventral disséqué de la moelle épinière avec un MINIMUM de HBSS et le placer dans le tube microcentrifuge de 1,7 mL étiqueté SMN rempli de milieu de dissection. Conserver sur la glace jusqu'à la dissociation. Continuer à mettre en commun les moelles épinières ventrales à partir d'embryons supplémentaires dans le même tube jusqu'à ce que le nombre total réponde aux exigences expérimentales.
REMARQUE: La collecte d'au moins trois moelles épinières ventrales produisant environ 2,1 x 104 SMN est recommandée parce que les tissus sont sujets au stress pendant la dissociation et le tri. - Recueillir les neurones moteurs faciaux et les extrémités des embryons de souris IslMN:GFP comme contrôles GFP-positifs et GFP-négatifs pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), respectivement. Les extrémités sont GFP-négatives parce que les axones GFP-positifs des SMN n'ont pas encore étendu dans les extrémités à cet âge embryonnaire.
6. Dissociation tissulaire
REMARQUE: Le temps total de dissociation est généralement de 1,5 h par expérience.
- La solution d'inhibiteur de la papaïne chaude et de l'albumine-ovomucoid aliquots à 37 oC 30 min avant la dissociation.
- Faites brièvement tourner les tissus microdissés à basse vitesse.
- À l'aide d'une pipette P100, retirez soigneusement autant d'Hibernate E que possible sans aspirater les tissus.
REMARQUE: Assurez-vous d'enlever tous les résidus Hibernate E après cette étape pour éviter de réduire l'efficacité de la dissociation papaïne dans l'étape suivante. - Ajouter le volume approprié de solution de papaïne (tableau 1) à chacun des tubes microcentrifuges de 1,7 ml contenant les échantillons de tissus microdissés.
REMARQUE: Le volume approprié de papain pour la dissociation a été déterminé afin de maximiser la dissociation efficace tout en minimisant le stress sur les cellules. - Triturate doucement 8x avec une pipette P200. Effectuer toutes les étapes de trituration doucement pour préserver la viabilité des neurones moteurs.
- Incuber les tubes contenant les tissus pendant 30 min à 37 oC, en agitant par doigt clignotant 10 fois toutes les 10 min. Triturate doucement chaque suspension 8x avec une pipette P200 après l'incubation. Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min.
- Pour assurer l'efficacité de l'inhibition ovomucoid dans l'étape suivante, utilisez une pipette P1000 pour enlever et jeter autant de supernatant que possible sans aspiration des tissus.
- Resuspendre les granulés dans le volume approprié de solution d'inhibiteur albumin-ovomucoid (tableau 1) en tritutant doucement 8x avec une pipette P200.
- Attendez 2 min pour permettre à tous les morceaux restants de tissu non dissocié de se déposer au fond du tube.
- Recueillir autant de supernatant que possible sans aspirater les tissus non dissociés à l'aide d'une pipette P200. Transférer le supernatant dans des tubes microcentrifugefrais de 1,7 ml.
- Si certains morceaux de tissu restent non dissociés après l'étape 6.10, répétez les étapes 6.8-6.10 pour les tissus non dissociés qui restent dans les tubes microcentrifugerisateurs originaux de 1,7 mL pour maximiser le rendement final des cellules dissociées tout en minimisant le stress sur les cellules dissocié précédemment, contenu dans le supernatant de l'étape 6.10.
- Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement et jetez le supernatant à l'aide d'une pipette P1000.
- Resuspendre la pastille dans le volume approprié du milieu de dissection (tableau 1) en pipetting 8x à l'aide d'une pipette P1000. Le volume approprié de la suspension finale a été déterminé de sorte que la densité cellulaire ne dépasse pas 107 cellules/mL, ce qui peut bloquer le flux de la machine de cytométrie d'écoulement, mais aussi de sorte que les cellules ne soient pas excessivement diluées, ce qui entraîne une vitesse de tri ralentie.
- Filtrer les suspensions à travers des passoires cellulaires de 70 m pour éliminer les gros touffes ou les tissus non digérés. Transférer les suspensions dans des tubes à essai en polystyrène à fond rond de 5 ml et les conserver sur glace jusqu'à ce que nécessaire.
7. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
REMARQUE: Ce protocole a été optimisé à l'aide d'un trieur FACS équipé d'un laser violet de 15 mw 405 nm, d'un laser bleu de 100 mw 488 nm, d'un laser orange de 75 mw 594 nm et d'un laser rouge de 40 mw 640 nm. Les cellules ont été triées comme fluide de gaine dans le PBS stérile dans des conditions aseptiques par une buse de 100 m. Afin de minimiser le stress cellulaire, le débit a été fixé à une pression d'échantillon de 1 à 3, de sorte qu'un maximum de 1 000 à 4 000 événements par seconde ont été acquis. Le temps total de FACS est typiquement 1/2 h par expérience.
- Configurez des tensions pour la diffusion vers l'avant et latérale de sorte que la population cellulaire puisse être visualisée correctement. La mise en place de tensions appropriées pour le tri cellulaire est complexe et nécessite un opérateur FACS expérimenté.
- Pour distinguer les différentes populations cellulaires, tracer les cellules en fonction de la taille déterminée par la zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) par rapport à la complexité interne déterminée par la zone de dispersion latérale (SSC-A). Dessinez une porte autour des cellules vivantes, comme indiqué dans la figure 3Aa et la figure Ba pour exclure les débris et les cellules mortes. Regroupez les cellules dans la région fermée en tant que population 1 (P1).
- Pour exclure les amas cellulaires et les doublets, tracez ensuite les cellules P1 en fonction de la largeur de dispersion latérale (SSC-W) par rapport au SSC-A. Portez la population de cellules individuelles en tant que population 2 (P2)(figure 3Ab et Figure Bb).
- Tracer les cellules P2 en fonction de la largeur de diffusion vers l'avant (FSC-W) par rapport au FSC-A et la barrière de la population de cellules simples en tant que population 3 (P3) (Figure 3Ac et Figure Bc).
REMARQUE : L'utilisation de deux portes consécutives dans 7.3 et 7.4 exclut les amas et les doublets cellulaires (FSC-W élevé et FSC-A élevé). - Cellules P3 de porte basées sur GFP contre allophycocyanin (APC). Le canal APC détecte l'autofluorescence. Le gating sur ce canal évite de capturer les cellules autofluorescentes. Utilisez des cellules gFP-négatives pour ajuster la tension pour les canaux fluorescents FITC/GFP. Idéalement, les portes de position pour ces populations cellulaires autour de 102. Sélectionnez les seuils de porte pour la population GFP-positive 4 (P4) individuellement pour chaque type de neurone moteur(figure 3Ad et Figure Bd).
REMARQUE: Définir la porte GFP beaucoup plus haut pour les NMS que pour les CN3/CN4 afin d'obtenir une culture pure(figure 3Ad et Figure Bd). Une porte GFP inférieure pour les cultures SMN conduit à la contamination des cultures par des neurones gliales et non moteurs. C'est probablement parce qu'il y a l'expression de Bas-niveau de GFP dans quelques neurones de gligique et non-moteurs dus à un promoteur qui fuit. Le pourcentage de cellules GFP-positives par rapport aux cellules totales est généralement de 0,5 à 1,5 % pour les CN3/CN4 et de 1,5 à 2,5 % pour les NSM. Si la dissection a été couronnée de succès, ces chiffres peuvent servir de point de repère pour déterminer la position appropriée pour la porte positive du PFG(figure 3Ae et Figure Be). - Effectuer FACS selon le protocole du fabricant. Recueillir les cellules P4 dans des tubes microcentrifugefrais de 1,7 ml remplis de 500 l de milieu de culture de neurones moteurs. Conserver sur la glace jusqu'au placage.
REMARQUE: Bien que les cellules puissent être triées directement dans les puits, cela se traduit par un nombre inégal de cellules par puits. Trier les cellules dans des tubes microcentrifuges de 1,75 ml, puis les plaquer manuellement afin d'obtenir une distribution de placage plus uniforme.
8. Culture des neurones moteurs primaires purifiés
- Diluer les suspensions CN3/CN4 et SMN isolées par LES FACS avec un milieu de culture de neurones moteurs préréchauffé à 37 oC à des densités de 5 x 103 et 1 x 104 cellules/mL, respectivement.
REMARQUE: Un embryon E11.5 donne environ 1 x 103 CN3/CN4 et 7 x 103 SMN. Cependant, ces rendements reposent fortement sur la pureté des tissus disséqués, la rigueur de la dissociation cellulaire et le seuil approprié des portes GFP pendant les FACS. - Transférer 96 plaques de puits précouchées de PDL et de laminininde de l'incubateur de culture tissulaire de 37 oC à la hotte à flux laminaire et à aspirer la laminine de chaque puits. Utilisez immédiatement des assiettes et des récsinbières sans se laver.
- Ajouter 200 l de suspensions CN3/CN4 diluées et SMN dans le puits de 96 plaques de puits PDL/laminin-enduite. Les densités cellulaires finales devraient être de 1 x 103 et 2 x 103 cellules/puits pour CN3/CN4 et SMN, respectivement.
REMARQUE: La densité initiale de placage des SMN dans 96 plaques de puits (2 x 103 cellules/puits) est le double de celle des CN3/CN4 (1 x 103 cellules/puits) afin d'obtenir des nombres et des densités de neurones moteurs finaux similaires à 2 et 9 jours in vitro (DIV) (4 x 102 et 2 x 102 cellules par puits, respectivement). - Neurones de culture dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.
- Nourrir les neurones tous les 5 jours en supprimant la moitié des vieux médias (100 L) et en remplaçant par le même volume de milieu de culture de neurones moteurs frais. Veiller à ce que les processus neuronaux deviennent visibles sur 1 DIV et deviennent plus épais et plus longs par 14 DIV (Figure 4). Les corps cellulaires neuronaux s'agrandissent et ont tendance à s'agréger dans les cultures à long terme, en particulier pour les SMN (figure 4).
REMARQUE: Effectuer tous les changements moyens et de solution en laissant la moitié du volume moyen d'origine afin d'éviter de détacher les cellules cultivées. Cela comprend les étapes de fixation et d'immunocytochimie (ICC). Si tous les médias sont enlevés, quelle que soit la douceur, la plupart des cellules se détachent et seront emportées.
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Representative Results
L'objectif de ce protocole était de purifier et de culture fortement à la fois les CN3/CN4 primaires et les NMc à long terme afin de permettre des analyses comparatives des mécanismes sous-jacents aux troubles des neurones moteurs (voir la figure 1 et la figure 2 pour vue d'ensemble).
Une fois que les neurones ont été isolés et cultivés avec succès en culture, les cultures CN3/CN4 et SMN primaires presque pures ont été obtenues (figure 5A,B) et maintenues pendant au moins 14 DIV (Figure 4 et Figure 6). Les puretés des cultures CN3/CN4 et SMN à 2 DIV étaient de 93,5 à 2,2 % et de 86,7 % à 4,7 %, respectivement, lorsqu'elles ont été évaluées par icc à l'aide du marqueur de neurones moteurs Islet1 et du marqueur neuronal TUJ1(figure 5B). Toutefois, ces puretés élevées reposaient fortement sur l'âge des embryons et sur l'établissement de seuils appropriés pour les portes du PFG pendant le FACS (figure 3). La dissection des embryons à E10.5 est plus difficile que la dissection à E11.5 due à la douceur et à l'adhérence accrues des tissus, ayant pour résultat des rendements diminués de neurone moteur. Cependant, les puretés des E10.5 CN3/CN4 et des SNN étaient comparables à celles des embryons E11.5 (92,8% et 82,2% à 2 DIV, respectivement; données obtenues à partir d'une seule expérience). Les puretés des CN3/CN4 et des SNN ont considérablement diminué lorsque les embryons E13.5 ont été utilisés, même si seule la population gFP-positive la plus élevée a été recueillie (20,7 % et 7,4 % à 2 DIV, respectivement; données obtenues à partir d'une seule expérience), probablement en raison de l'expression du PAM dans les neurones non moteurs(figure 7). Cette même tendance s'est également maintenue pour les cultures E12.5, bien qu'elle soit beaucoup moins dramatique. Par conséquent, les embryons à E12.5 ou plus sont inappropriés pour une utilisation dans la purification des neurones moteurs en utilisant ce protocole.
Les cultures pures de neurone moteur sont valables pour comprendre des modèles de croissance, des comportements, et des vulnérabilités isolés des neurones moteurs. Cet exemple montre comment ces cultures peuvent être utilisées pour tester les réponses des neurones moteurs au traitement chimique. Pour déterminer si les CN3/CN4 primaires et les SNN montrent des réponses différentielles aux facteurs de stress de réticulum endoplasmique (ER), les monocultures primaires des CN3/CN4 et des SMN ont été obtenues en utilisant ce protocole et traitées avec des concentrations variables d'un facteur de stress er, l'acide cyclopiazonique (CPA). Les neurones ont été traités avec CPA (5, 10, 15, 20, 25, ou 30 M) ou le contrôle du véhicule (DMSO) à 2 DIV et fixé 3 jours plus tard pour l'ICC pour évaluer les ratios de survie (figure 8A). Le nombre de neurones viables dans chaque échantillon a été compté et les ratios de survie ont été calculés comme le nombre de cellules viables dans les puits traités par des médicaments divisé par le nombre de cellules viables dans les puits traités avec DMSO. Les monocultures CN3/CN4 étaient significativement plus résistantes au traitement de l'ACP (10 à 25 m) que les monocultures SMN(figure 9 et figure 8B)31.
En conclusion, ce protocole permet la génération de cultures CN3/CN4 et SMN hautement purifiées embryonnaires de souris qui fournissent un système puissant et fiable pour l'étude du comportement neuronal.
Figure 1 : Schéma de préparation des neurones moteurs embryonnaires de souris. Le schéma illustre les étapes impliquées dans l'isolement et la culture des neurones moteurs embryonnaires de souris et le temps approximatif en heures ou jours pour chaque étape. L'ordre de la procédure de dissection pour CN3/CN4 et pour SMN sont chacun étiqueté séquentiellement 1 à 4. Abréviations : CN3/CN4 - neurone oculomoteur/trochlear ; SMN - neurone moteur spinal; LE tri des cellules activée par la fluorescence, c'est-à-faire; h - heure; d jour. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Dissection du cerveau ventral et de la partie cervicale (C1)-lombaire (L2-L3) de la moelle épinière ventrale. (A) Lateral (a) and dorsal (b) views of GFP-positive motor neurons in an E11.5 IslMN:GFP transgenic mouse embryo under fluorescein isothiocyanate (FITC) illumination. Un embryon entier de monture E11.5 a été préparé comme décrit précédemment32 afin de rendre l'embryon transparent. Par la suite, l'embryon a été analysé par l'étiquetage d'immunofluorescence avec la coloration anti-GFP (vert). Des images ont été capturées sous un microscope confocal. Barres d'échelle de 200 m (vue latérale) et 400 m (vue dorsale). Abréviations: S - supérieur; I - inférieur; V et ventral; D et dorsal. (B-H) Étapes de dissection mises en évidence sur des images des tissus ventral de midbrain et de moelle épinière ventral d'E11.5 pris avec une caméra équipée sous la lumière lumineuse (Bb) ou l'éclairage de FITC utilisant un stéréomicroscope de dissection de fluorescence. Barres d'échelle de 200 m (D) et de 1 mm (A-C, E-H). (B) (a) Enlèvement du visage et de la queue de l'embryon en coupant le long des lignes rouges. (b) Embryon positionné pour dissection. Le positionnement de l'avant du microscope est indiqué par un astérisque. (C) Couper le long de la ligne rouge solide afin de fendu ouvrir le toit du quatrième ventricule (a) vue latérale et (b) vue dorsale. Utilisation de cette ouverture pour couper le long de la surface de l'embryon dorsal au cerveau (trajectoire indiquée par flèche rouge pointillée). Ceci expose le tissu contenant le mesenchyme, CN3, et CN4, qui peut être soulevé hors du crâne. Pour la dissection SMN, l'insertion de forceps dans la même ouverture entre le quatrième ventricule et son toit, puis la coupe vers le côté caudal de l'embryon (trajectoire indiquée par une flèche jaune pointillée). (D) Vue finale du cerveau moyen ventral contenant des noyaux CN3 et CN4 positifs bilatéraux. Les bords du tissu sont mis en évidence par un rectangle rouge. Couper le long de la ligne pointillée jaune pour recueillir séparément les noyaux CN3 et CN4, si désiré. (E) Après avoir ouvert le reste du cerveau postérieur et de la moelle épinière, le battement des tissus dorsaux pincé au-dessus des lignes rouges des deux côtés avec des pinces (a) avant, et (b) après. (F) Retrait bilatéral de l'excès de tissu ventral à la moelle épinière le long de la ligne rouge (a) avant, et (b) après. (G) Coupe de la moelle épinière ventrale aux deux endroits indiqués par les lignes rouges. Du côté rostral, la coupe de la moelle épinière ventrale flottante transversalement au-dessus de C1 où le premier GFP-positif corne antérieure projets. Couper l'extrémité caudale de la moelle épinière transversalement à la limite supérieure du membre inférieur. Une fois ces coupures faites, la partie cervicale (C1) par lombaire (L2-L3) de la moelle épinière ventrale peut être disséquée loin. (H) Vue finale de la moelle épinière ventrale contenant des colonnes SMN GFP-positives. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Trier les parcelles de cerveaux ventrales (A) et de moelle épinière ventrale (B). (Aa et Ba) Zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) par rapport à la zone de dispersion latérale (SSC-A) triée avant l'exclusion des débris et des cellules mortes. (Ab, Bb, Ac, C.-B.) Diagrammes triés pour l'exclusion des amas cellulaires (b) et des doublets (c) basés sur width (SSC-W) par rapport à SSC-A et Forward Scatter Width (FSC-W) par rapport à FSC-A, respectivement. (Ad et Bd) Des parcelles triées pour isoler les neurones moteurs islMN:GFP-positifs. Afin d'obtenir une culture pure, la porte GFP doit être fixée plus haut pour les SMN (Bd) que pour les CN3/CN4 (Ad). (Ae et Be) Pourcentages de cellules fermées pour la collecte par le tri FACS. %Parent représente le pourcentage de cellules dans la population fermée actuelle par rapport au nombre de cellules dans la population cellulaire fermée précédente, tandis que %Total représente le pourcentage de cellules fermées par rapport aux cellules totales. Les pourcentages attendus de cellules GFP-positives par rapport aux cellules totales (encadrées en rouge) sont de 0,5 à 1,5 % pour le CN3/CN4 et de 1,5 à 2,5 % pour le SMN. Si la dissection a été effectuée avec succès, ces pourcentages peuvent être utilisés comme point de référence pour mettre en place la porte GFP-positive dans (Ad et Bd). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Images en contraste séviscatif des monocultures CN3/CN4 et SMN primaires à 2, 7 et 14 DIV. Des images de contraste différentielreprésentatif représentatif des cultures CN3/CN4 et SMN ont été capturées à 2, 7 et 14 DIV avec microscope à fluorescence inversée à l'aide d'un logiciel d'acquisition et de traitement d'images correspondant et d'objectifs 40x. Les processus neuronaux sont devenus plus épais et plus longs par 14 DIV. Les tailles de corps neuronaux sont devenues agrandies et ont eu tendance à s'agréger dans les cultures à long terme, particulièrement pour des SMN. Les deux cultures peuvent être maintenues au moins 14 DIV. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Caractérisations des cultures E11.5 souris CN3/CN4 et SMN isolées. (A) Images immunocytochemistry représentatives des CN3/CN4 sourdeurs E11.5 souris (en haut) et SMN (en bas) cultivées pour 2 DIV. L'étiquetage immunofluorescence avec le marqueur neuronal TUJ1 (vert) et le marqueur de neurones moteurs Islet1 (rouge) effectués pour analyser les neurones et les nuclées ont été contrecarrés avec DAPI (bleu). Presque toutes les cellules cultivées étaient des neurones moteurs (TUJ1,Islet1). Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope à fluorescence inversée à l'aide d'un logiciel d'acquisition et de traitement d'images correspondant et d'objectifs 20x. Des échantillons ont été imagelés et traités pour atteindre l'intensité maximale du signal sans pixels saturés. Tous les travaux microscopiques et le traitement de l'image dans les figures suivantes ont été effectués dans ces conditions, sauf indication contraire. Barre d'échelle de 100 m . (B) Les puretés des cultures CN3/CN4 et SMN de souris E11.5 à 2 DIV. Les puretés des cultures CN3/CN4 et SMN étaient respectivement de 93,5 à 2,2 % et de 86,7 % à 4,7 %. Les corps neuronaux morts de cellules ont été évalués par le criblage pour la morphologie nucléaire pyknotic et le gonflement de membrane. Les processus neuronaux ont été classifiés en tant que processus dégénérants quand des signes de perlage et de gonflement ont été observés. Les cellules sans mort cellulaire ni processus de dégénérescence ont été considérées comme des neurones non moteurs viables (TUJ1,Islet1-) ou des neurones moteurs viables (TUJ1,Islet1)33. Les puretés des cultures de neurones moteurs ont été calculées comme le nombre de neurones moteurs viables divisés par le nombre total de neurones non moteurs viables ainsi que des neurones moteurs viables. Les valeurs représentent la moyenne de trois expériences distinctes. Pas significatif (p 'gt; 0.05) par l'étudiant t test. Le comptage cellulaire a été effectué manuellement sous le grossissement 20x. Abréviations: SEM - erreur standard de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Immunocytochimie représentative des monocultures primaires CN3/CN4 et SMN à 2, 7 et 14 DIV. Les cultures cN3/CN4 primaires et SMN ont été analysées à 2, 7, 14 DIV par étiquetage d'immunofluorescence avec TUJ1 (vert), et les noyaux ont été contre-tachés avec DAPI (bleu). Les processus neuronaux deviennent plus épais et plus longs par 14 DIV. La taille des cellules neuronales s'est élargie et a eu tendance à s'agréger dans les cultures à long terme, en particulier pour les SMN. Les cultures CN3/CN4 et SMN peuvent être maintenues au moins 14 DIV. Les images ont été capturées sous grossissement 10x. Barre d'échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Caractérisation des cultures isolées CN3/CN4 et SMN de souris E13.5. E13.5 CN3/CN4 et SMN ont été isolés et cultivés à l'aide de ce protocole et analysés à 2 DIV par étiquetage immunofluorescence avec TUJ1 (vert) et Islet1 (rouge), et les noyaux ont été contrecarrés avec DAPI (bleu). Beaucoup de cellules neuronales non motrices (TUJ1,Islet1-) étaient présentes (flèches) résultant en une diminution drastique de la pureté CN3/CN4 et SMN, avec la diminution plus prononcée dans les cultures SMN. Des images ont été capturées sous le grossissement 20x. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Application représentative de la culture des neurones moteurs primaires démontrant que les CN3/CN4 sont sélectivement résistants au stress aux urgences induit par l'APC. (A) Aperçu expérimental : les monocultures primaires CN3/CN4 et SMN ont été traitées avec CPA ou contrôle de véhicule (DMSO) à 2 DIV et les viabilities cellulaires ont été évaluées par l'analyse immunocytochemistry après 3 jours de traitement. Ce plan a été modifié à partir de l'ouvrage publié31. (B) Quantification des rapports de survie des CN3/CN4 et des SNN traités avec un CPA de 5 à 30 M pendant 3 jours à partir de 2 DIV. Les neurones ont été analysés par étiquetage immunofluorescent des cellules avec TUJ1, et les noyaux ont été contre-tachés avec DAPI. Les ratios de survie ont été calculés comme le nombre de cellules viables (voir la légende de la figure 5B) dans les puits traités par des médicaments divisés par le nombre de cellules viables dans les puits contenant un véhicule seul (DMSO). Le comptage cellulaire a été effectué manuellement sous le grossissement 20x. Les valeurs représentent la moyenne de quatre expériences distinctes. lt; 0,05; p lt; 0.005 par l'étudiant's t test. Ce chiffre a été modifié à partir de l'ouvrage publié précédemment31. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9 : Immunocytochimie représentative des monocultures cN3/CN4 et SMN primaires après une exposition de 3 jours à des concentrations croissantes de CPA à partir de 2 DIV. Les neurones ont été analysés par l'étiquetage immunofluorescent des cellules avec TUJ1 (vert) et les noyaux ont été contre-tachés avec DAPI (bleu). Les CN3/CN4 primaires étaient plus résistants au traitement de CPA que les SMN primaires. Les images ont été capturées sous grossissement 10x. Barre d'échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nombre de midbrains (X) | Papaïne | Albumin-ovomucoid | Hibernate E | |||||||||
| 10 x X 20 | 200 l | 100 l | 600 l | |||||||||
| 20 lt; X 30 | 300 l | 150 l | 700 l | |||||||||
| 30 lt; X 40 | 400 l | 200 l | 800 l | |||||||||
| Nombre de moelleépinière (Y) | Papaïne | Albumin-ovomucoid | Hibernate E | |||||||||
| 3 et Y 5 | 200 l | 100 l | 500 l | |||||||||
| 5 lt; Y 10 | 400 l | 200 l | 800 l | |||||||||
| 10 lt; Y 15 | 600 l | 300 l | 1200 l | |||||||||
Tableau 1 : Volumes appropriés de papaïne, d'albumine-ovomucoid et de suspension finale utilisés dans les étapes de dissociation. Les volumes appropriés de papaïne et d'albumine-ovomucoid à utiliser avec divers nombres de tissus ventral du cerveau moyen et de la moelle épinière ventrale ont été modifiés à partir des instructions du fabricant après plusieurs cycles d'optimisation. Puisque les tissus sont sujets au stress pendant la dissociation et le tri, une collection mise en commun de plus de 10 midbrains ventral et plus de trois moelles épinières ventrales est recommandée. Le volume de papain a été déterminé en considérant l'équilibre entre la dissociation efficace et le stress de cette procédure. Le volume de la solution d'inhibiteur d'albumin-ovomucoid est la moitié de celui de la papaïne. Le volume approprié de suspension finale Hibernate E a été déterminé de telle sorte que la densité cellulaire ne dépasse pas 107 cellules/mL, mais les cellules ne deviennent pas excessivement diluées.
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Discussion
Historiquement, les études in vitro des neurones moteurs CN3 et/ou CN4 se sont appuyées sur des cultures hétérogènes telles que les17,18,19,20,21, explanter17,22,23,24,25,26, ettranche27,28 cultures, parce que ces cellules ne peuvent pas être distinguées de les cellules environnantes basées sur la taille, et les marqueurs spécifiques pour ces cellules n'ont pas été rapportés. Le protocole actuel est une méthode complète pour l'isolement et la culture des CN3s/CN4 murines primaires E11.5, et des SMN des mêmes embryons et confirment la haute pureté des cultures. En générant des cultures Pures SMN et CN3/CN4 à partir des mêmes embryons de souris, le protocole permet des comparaisons contrôlées des comportements in vitro des CN3/CN4 par rapport aux NSM isolés à partir de types sauvages ainsi que d'embryons mutants.
Les cultures pures des CN3/CN4 et des SNN générées par ce protocole permettent des études comparatives des caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques de ces neurones moteurs. En théorie, parce que d'autres populations de neurones moteurs crâniens peuvent être visualisées et disséquées à partir de cette ligne transgénique IslMN:GFP souris (y compris les abducens, trigeminal moteur, facial, et hypoglossal), ce protocole pourrait être élargi pour leur isolement et la culture ainsi, à condition que les portes GFP GFP sont ajustés de manière appropriée. Enfin, les neurones moteurs triés par le FACS dérivés de ce protocole peuvent être soumis à des analyses génomiques (p. ex., Analyse de la chromatinane accessible à la transposase à l'aide de séquençage, ou ATAC-seq) et/ou transcriptomique (p. ex., séquence d'ARN31)pour étudier le développement normal et la vulnérabilité sélective de sous-types spécifiques de neurones moteurs dans les troubles neurodégénératifs31.
Il y a plusieurs étapes dans ce protocole qui sont essentielles pour maximiser le nombre de neurones moteurs purs et sains dans le système de culture isolé. Pendant la dissection, les tissus GFP-négatifs (par exemple, le mésenchyme et les DRG) devraient être enlevés au maximum sans endommager les neurones moteurs, parce que ces tissus sont adhésifs et peuvent piéger les SMN pendant le filtrage ou causer l'engorgement pendant le tri FACS. Pendant la dissociation de tissu, le volume essentiel minimal de papain devrait être employé, et les cellules doivent être traitées doucement avec la trituration minimale mais suffisante. Le papain a été employé pour l'étape de dissociation de tissu dans ce protocole, parce que les données préliminaires ont indiqué qu'il est moins destructeur que la trypsine à la fois CN3/CN4 et SMN. Les ratios de survie basés sur les nombres plaqués de CN3/CN4 et de SNN à 2 DIV ont augmenté de 39,5% à 52,7% et de 52,3% à 58,4%, respectivement, lorsque la papaïne a été utilisée au lieu de la trypsine (0,25%, 4 min d'incubation). Bien que ces nombres soient dérivés d'une seule expérience effectuée avant l'optimisation complète, les rapports additionnels suggèrent également que la trypsine est sous-optimale pour l'extraction cellulaire des tissus du système nerveux12,34,35,36. Pendant le FACS, les colorants vitaux fluorescents (procidium iodure et bleu calcéin) et les petites buses de tri (p. ex., 70 m) ne devraient pas être utilisés, car ils sont nocifs pour la survie des neurones moteurs. L'utilisation de grandes buses de tri (100 m ou plus) est fortement recommandée, car la mort cellulaire de SMN augmente considérablement lorsqu'une buse de 70 m est utilisée. L'établissement des seuils de gating appropriés pour les cellules GFP-positives dans les FACS est une étape critique afin d'obtenir des cultures pures. Les cultures de neurones moteurs sont complétées par la forskoline, l'IBMX et les facteurs de croissance (BDNF, CNTF et GDNF). Forskolin et IBMX ont été signalés à promouvoir additif sMN survie37,38. Les données préliminaires des études actuelles suggèrent que la forskoline et IBMX augmentent également de façon additive la survie du CN3/CN4. Le ratio de survie basé sur les nombres plaqués de CN3s/CN4 à 2 DIV est passé de 17,5 % à 26,9 %, 31,9 % et 37,0 % lorsque IBMX, forskolin et IBMX-forskolin ont été ajoutés, respectivement (les nombres sont basés sur une seule expérience effectuée avant l'optimisation complète des conditions de culture cellulaire). Il est préférable d'effectuer tous les changements moyens et les lavages des cellules cultivées en laissant la moitié du volume d'origine pour éviter de détacher les cellules cultivées. Enfin, il est également idéal de réduire le temps passé entre la dissection et le placage des neurones moteurs (par exemple, en réduisant le temps de dissection en utilisant plusieurs dissectors) pour améliorer la viabilité des cultures.
Il y a quatre problèmes potentiels majeurs qui peuvent survenir en suivant ce protocole. Le premier est le faible rendement des neurones moteurs après LE FACS. Les causes potentielles de faibles rendements comprennent l'utilisation de jeunes embryons (p. ex. E10.5), qui ont moins de neurones moteurs, l'élimination insuffisante des tissus adhésifs GFP-négatifs pendant la dissection (p. ex. le mésenchyme et les DRG), qui peuvent piéger les neurones moteurs et conduire à leur élimination pendant la filtration, la papinisation/trituration insuffisante pendant la dissociation, et/ou la mise en place de la barrière positive de GFP pendant la mise en place de la Le deuxième problème potentiel est la faible pureté des cultures des neurones moteurs, qui découle très probablement de l'utilisation d'embryons plus âgés (p. ex., E12.5) et/ou de la mise de la porte positive au GFP trop bas pendant le FACS. Troisièmement, un faible nombre de neurones moteurs attachés en culture peut être observé en raison d'un tri FACS inapproprié et/ou d'un revêtement inadéquat de PDL/laminin des plaques/couvertures. Quatrièmement, les neurones moteurs peuvent montrer une faible viabilité dans la culture. Les causes potentielles de faible viabilité comprennent la dissection rugueuse et/ou prolongée, la papainisation/trituration excessive pendant la dissociation, la manipulation inappropriée des cellules tout au long du protocole (p. ex., tuyauterie approximative des cellules, défaut de placer les cellules sur la glace, l'échec au PBS et au HBSS avant le refroidissement), et/ou le temps excessif entre l'euthanasie des souris enceintes et le placage final des cellules. L'utilisation de réactifs qui ne sont pas frais et/ou des concentrations inappropriées peut également nuire aux résultats expérimentaux.
Il y a trois grandes limites à ce protocole. Les souris transgéniques IslMN:GFP et le tri FACS sont tous deux assez chers. Ils sont cependant cruciaux pour ce protocole car il n'existe actuellement aucune méthode alternative capable de générer des CN3/CN4 hautement purifiés d'une manière plus économique. Il y a une petite fenêtre d'âge E10.5-E12.5 pour les souris embryonnaires, et il est difficile de confirmer que des embryons correctement vieillis sont présents, surtout si une machine d'ultrason n'est pas disponible. Si seulement des SMN purs sont nécessaires, ils peuvent être dérivés d'embryons de souris E12.5-15.0 en utilisant des méthodes telles que la centrifugation de gradient10,11,12 et/ou p75NTR-anticorps à base de techniques de panoramique de tri cellulaire13,14,15,16. Enfin, les essais à base de protéines qui nécessitent une grande quantité de matériel de départ ne sont pas réalisables à partir de ces cultures en raison du faible rendement des neurones moteurs (en particulier les CN3/CN4). Les neurones moteurs dérivés des cellules souches31,39, qui peuvent être générés sans limite, pourraient en théorie être substitués à cet effet.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) pour l'enseignement des techniques de dissection SMN; le Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, le Immunology Division Flow Cytometry Facility de la Harvard Medical School, le Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core, et Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, d'autres membres du laboratoire Engle et des membres du consortium Project ALS pour une assistance technique et une discussion réfléchie. Cette étude a été appuyée par le projet SLA. En outre, R.F. a été financé par la Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad et la subvention de formation des NIH en génétique T32 GM007748; J.J. a reçu l'appui du programme de formation DES NIH/NEI sur les bases moléculaires des maladies oculaires (5T32EY007145-16) par l'entremise du Schepens Eye Research Institute et du Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) par l'hôpital pour enfants de Boston; M.C.W a reçu le soutien de NEI (5K08EY027850) et de la Children's Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); et E.C.E. est un chercheur de l'Institut médical Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
