Isolement et culture des neurones oculomoteurs, trochlear et moteurs rachidiens de l'islmnprénatal :GFP Souris transgéniques

Ryosuke Fujiki; Joun  Y. Lee; Julie  A. Jurgens; Mary  C. Whitman; Elizabeth C. Engle

doi:10.3791/60440

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Article de méthode

Isolement et culture des neurones oculomoteurs, trochlear et moteurs rachidiens de l'isl^mnprénatal :GFP Souris transgéniques

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DOI :

10.3791/60440

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12 novembre 2019

Ryosuke Fujiki¹^,²^,³^,⁴^,⁹ , Joun Y. Lee¹^,²^,¹⁰ , Julie A. Jurgens¹^,²^,³^,⁷ , Mary C. Whitman²^,⁵^,⁶ , Elizabeth C. Engle¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸

¹Department of Neurology, Boston Children's Hospital, ²FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, ³Department of Neurology, Harvard Medical School, ⁴Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, ⁵Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, ⁶Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, ⁷Broad Institute of M.I.T. and Harvard, ⁸Howard Hughes Medical Institute, ⁹Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, ¹⁰Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce travail présente un protocole pour produire des cultures cellulaires homogènes des neurones moteurs oculomoteurs, trochléaires et spinaux primaires. Ces cultures peuvent être utilisées pour des analyses comparatives des caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques des neurones moteurs oculaires et spinaux.

Résumé

Les neurones oculomoteurs (CN3) et les neurones trochléaires (CN4) présentent une résistance remarquable aux maladies dégénératives des neurones moteurs comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) par rapport aux neurones moteurs rachidiens (SMN). La capacité d'isoler et de culture rattacher les CN3, les CN4 et les NSM primaires fournirait une approche des mécanismes d'étude sous-jacents à cette vulnérabilité sélective. À ce jour, la plupart des protocoles utilisent des cultures cellulaires hétérogènes, ce qui peut confondre l'interprétation des résultats expérimentaux. Pour minimiser les problèmes associés aux populations de cellules mixtes, les cultures pures sont indispensables. Ici, le premier protocole décrit en détail comment purifier et cultiver efficacement les CN3/CN4 aux côtés des homologues SMN des mêmes embryons en utilisant le jour embryonnaire 11.5 (E11.5) Isl^MN:GFP embryons de souris transgéniques. Le protocole fournit des détails sur la dissection et la dissociation des tissus, l'isolement cellulaire à base de FACS et la culture in vitro de cellules des noyaux CN3/CN4 et SMN. Ce protocole ajoute un nouveau système de culture in vitro CN3/CN4 aux protocoles existants et fournit simultanément une culture SMN pure et équivalente à l'âge pour la comparaison. Des analyses axées sur les caractéristiques morphologiques, cellulaires, moléculaires et électrophysiologiques des neurones moteurs sont réalisables dans ce système de culture. Ce protocole permettra de rechercher les mécanismes qui définissent le développement des neurones moteurs, la vulnérabilité sélective et la maladie.

Introduction

La culture des neurones moteurs primaires est un outil puissant qui permet l'étude du développement neuronal, de la fonction et de la susceptibilité aux facteurs de stress exogènes. Les cultures de neurones moteurs sont particulièrement utiles pour l'étude des maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA)¹^,², dont les mécanismes de la maladie sont incomplètement compris. Fait intéressant, malgré la mort cellulaire significative des neurones moteurs rachidiens (SMN) chez les patients atteints de SLA et les souris modèles de SLA, la mort cellulaire dans les neurones oculomoteurs....