Summary
Эта работа представляет протокол для получения однородных клеточных культур первичных окуломоторных, трохлеевых и спинномозговых моторных нейронов. Эти культуры могут быть использованы для сравнительного анализа морфологических, клеточных, молекулярных и электрофизиологических характеристик глазных и спинальных моторных нейронов.
Abstract
Oculomotor нейронов (CN3s) и trochlear нейронов (CN4s) проявляют замечательную устойчивость к дегенеративным двигательных нейронов заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS) по сравнению с спинномозговой двигательных нейронов (SMNs). Способность изолировать и культуры первичной мыши CN3s, CN4s и SMNs обеспечит подход к изучению механизмов, лежащих в основе этой селективной уязвимости. На сегодняшний день в большинстве протоколов используются разнородные клеточные культуры, которые могут спутать интерпретацию экспериментальных исходов. Чтобы свести к минимуму проблемы, связанные со смешанными популяциями, необходимы чистые культуры. Здесь, первый протокол описывает подробно, как эффективно очищать и культивировать CN3s / CN4s наряду с коллегами SMNs из тех же эмбрионов, используя эмбриональный день 11.5 (E11.5) IslMN:GFP трансгенных эмбрионов мыши. Протокол содержит подробную информацию о вскрытии и диссоциации тканей, изоляции клеток на основе FACS и культивировании клеток CN3/CN4 и SMN. Этот протокол добавляет новую систему культуры in vitro CN3/CN4 к существующим протоколам и одновременно обеспечивает для сравнения чистую культуру SMN, соответствующую видам и возрасту. Анализы, посвященные морфологическим, клеточным, молекулярным и электрофизиологическим характеристикам моторных нейронов, осуществимы в этой культурной системе. Этот протокол позволит исследовать механизмы, определяющие развитие моторных нейронов, селективную уязвимость и болезни.
Introduction
Культура первичных моторных нейронов является мощным инструментом, который позволяет изучать развитие нейронов, функции и восприимчивость к экзогенным стрессам. Двигательные культуры нейронов особенно полезны для изучения нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS)1,2, чьи механизмы заболевания не полностью поняты. Интересно, что, несмотря на значительную гибель клеток спинномозговых моторных нейронов (SMNs) в обоих больных ALS и ALS модели мышей, гибель клеток в окуломоторных нейронов (CN3s) и trochlear нейронов (CN4s) являются относительно скудными1,3,4,5,6,7,8,9. Таким образом, сравнительный анализ чистых культур CN3s/CN4s и SMNs может дать важные подсказки о механизмах, лежащих в основе относительной уязвимости. К сожалению, основным препятствием для таких анализов является неспособность выращивать очищенные культуры этих моторных нейронов.
Было описано много протоколов для очистки SMNs от моделей животных. Большинство из этих протоколов использовать градиент плотности центрифугации10,11,12 и / или p75NTR-антителаоснове клеточной сортировки методов13,14,15,16. Центрифугация градиента плотности использует больший размер SMNs по сравнению с другими спинномозговыми клетками, в то время как p75NTR является внеклеточным белком, выраженным исключительно SMNs в спинном мозге. Почти 100% чистые культуры SMN были созданы одним или обоими из этих протоколов11,12,14. Тем не менее, эти протоколы не были успешными в создании CN3/CN4 культур, потому что CN3s/ CN4s не выражают p75NTR, и другие конкретные маркеры CN3/CN4 не были определены. Они также меньше, чем SMNs и, следовательно, труднее изолировать на основе размера. Вместо этого, в пробирке исследования CN3s или CN4s опирались на разъединенных17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26 , и ломтик27,28 культур, которые состоят из неоднородных типов клеток, и никаких протоколов не существовало для изоляции и культуры первичных CN3s или CN4s.
Здесь описывается протокол для визуализации, изоляции, очищения и культивирования CN3s, CN4s и SMNs с того же эмбрионального дня 11.5 (E11.5) IslMN:GFP трансгенных мышей29 (Рисунок 1, Рисунок 2A). IslMN:GFP специально маркирует моторные нейроны фарнезилатным GFP, который локализуется к клеточной мембране. Этот протокол позволяет видов и возрастных сравнения нескольких типов моторных нейронов для того, чтобы выяснить патологические механизмы в двигательных нейронов болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с использованием лабораторных животных проводились в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных и с одобрения Комитета по уходу и использованию животных Бостонской детской больницы.
1. Настройка приурочен спаривания до вскрытия
- Для создания пренатальных эмбриональных мышей для сбора моторных нейронов, взвесить каждую самку мыши и создать приурочен спаривания между взрослыми IslMN:GFP трансгенных мышей 11,5 дней до дня изоляции нейронов. Для разработки этого протокола, 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP мышей, в возрасте 2-9 месяцев, были использованы и приурочен спаривания был создан в вечернее время.
- Изучите самок мышей для вагинальных пробок на следующее утро. Рассмотрим дату, когда вилка идентифицируется как эмбриональный день (E) 0,5.
- Взвешивать самок мышей и обследовать на щенков с помощью ультразвука (см. Таблица материалов)между E8.5 и 11. Проверьте наличие признаков успешного спаривания.
- Подтвердите успешное спаривание, обнаруживая увеличение веса у самок мышей (обычно 1,5 г на E9.5, если есть более 5-6 эмбрионов).
- Визуально едкие подтверждения эмбрионов при УЗИ. Эмбрионы легко обнаруживаются с помощью ультразвука после E9.5. Узи проводятся только на женщин, которые набрали вес, потому что они чаще беременны, чем те, которые этого не делают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей женского пола может приобрести вес по причинам, не беременности, так что увеличение веса само по себе не является надежным показателем беременности. Ультразвуковое подтверждение предотвращает ненужные жертвы женщин, которые не беременны, но не имеет решающее значение, если недоступны.
2. Условия вскрытия и подготовка инструментов
- Выполнять все покрытие (кроме кислотной очистки крышки), медийную подготовку, диссоциацию тканей (кроме центрифугации и инкубации), а также культурную работу в ламинарном капоте для обеспечения стерильности носителей и эмбриональных моторных нейронов.
- При внимательном внимании к стерильной технике, проводить вскрытие тканей вне ламинарного капота потока с минимальным риском заражения.
- Стерилизовать одну пластину вскрытия, одну пару микрорассечения ножницы, одна пара большого пальца соусом щипцы, две пары Dumont #5 пинцетом, один микрорассектацирующий нож, и один Мория мини перфорированной ложкой, погружая в 70% этанола до использования.
3. PDL/Ламинин Покрытие Блюд / Обложки
ПРИМЕЧАНИЕ: Культура разъединяла первичные моторные нейроны в 96 скважинах или 24 скважинах, в зависимости от количества клеток, необходимых для применения. Клетки могут быть изображены непосредственно в пластине культуры ткани без использования крышки, если скважины оптически прозрачны и толщины совместимы с изображениями.
- Для приложений, требующих coverslips, подготовить кислоты очищены, стерилизованы, и высушенные воздухом крышки по крайней мере за 2 дня до изоляции нейронов, как ранее описано30. Пакеты обложек могут быть подготовлены таким образом заблаговременно до экспериментов и могут храниться до 6 месяцев без влияния на экспериментальное качество.
- Подготовьте рабочий раствор 20 мкг/мл поли Д-лизин (PDL) в фосфатном буферном сольном (PBS) за 2 дня до изоляции нейронов.
- Aliquot PDL (1 мг/мл) заранее и хранить при -20 градусов по Цельсию в качестве биржевого раствора.
- Обложка поверхности каждого coverslip или хорошо пластины культуры ткани с достаточным pdL решение рабочего решения (например, 100 л на хорошо на 96 хорошо пластин или 500 Л л в хорошо на 24 хорошо пластин с или без крышки). Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
- На следующий день промойте 3x стерилизуемой водой.
- Печать пластин с парафина пленки и хранить промывают PDL покрытием пластин на 4 кв КС на срок до 1 месяца, если они высушены полностью после окончательного мытья.
- Подготовьте рабочий раствор с 10 л ламинина (1,1 х 1,2 мг/мл) в 1,2 мл PBS.
- Запасы ламинина Aliquot (1,1-1,2 мг/мл) заранее и хранятся при -80 градусах Цельсия.
- Обложка поверхности каждого coverslip или хорошо с достаточным раствором ламинина, чтобы равномерно покрыть поверхность. Инкубировать, по крайней мере 2 ч при 37 градусах Цельсия до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины с покрытием PDL/laminin и крышки могут храниться до 1 недели при 37 градусах Цельсия, но свежепокрытый ламинин предпочтительнее. Удалите ламинин непосредственно передпокрытием 30. Ламинин не должен высыхать. Если пластины должны храниться более нескольких часов, они должны быть завернуты в парафиновую пленку.
4. Подготовка рассечения, Мотор Нейрон культуры СМИ, и диссоциации решения
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации в скобках указывают на конечную концентрацию каждого реагента.
- Подготовьте среду вскрытия.
- Оттепель тепло-инактивированной сыворотки лошади на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию, подготовить 1 мл aliquots, и хранить при температуре -20 градусов по Цельсию. Оттепель aliquots на RT непосредственно перед использованием.
- Хранить B27-добавка (50x) в 1 мл aliquots при -20 c. Оттепель aliquots на RT непосредственно перед использованием. Избегайте циклов замораживания/оттепели.
- Храните добавку глутамина (100x) при 4-C или -20 градусов по Цельсию. Разделите на 0,5 мл aliquots при хранении при -20 градусах Цельсия.
- Храните пенициллин-стрептомицин (10 000 U/mL) в 1 мл аликвот при -20 градусах Цельсия. Оттепель aliquots на RT непосредственно перед использованием.
- Чтобы сделать вскрытие среды, смешайте 9,4 мл Hibernate E с 200 л лошадисы сыворотки (2%), 200 л 50x B27 дополнения (1x), 100 л 100x глутамина дополнение (1x) (например, GlutaMAX), и 100 л из 10 000 U/mL пенициллина-стрептомицина (100 U/mL). Используйте эту среду для сбора расчлененных тканей и окончательной приостановки разъединенных клеток.
- Добавьте 500 юл вскрытия средних и индивидуальных микроцентрифуговых трубок 1,7 мл для сбора тканей за день до изоляции нейронов. Подготовьте одну трубку для каждого типа ткани, которые будут собраны (например, положительный контроль, отрицательный контроль, CN3/CN4, SMN) и хранить при 4 градусах Цельсия до использования.
- Комбинат 49 мл Hibernate E низкой флуоресценции средств с 1 мл B27 дополнения (1x) и заполнить 24 хорошо пластины с этой среде (2 мл / хорошо) за день до изоляции нейронов. Используйте это блюдо для сбора эмбрионов мыши. Храните при 4 градусах по Цельсию перед использованием.
- Подготовьте среднюю культуру моторных нейронов.
- Приготовьте 250 аликвот 25 мМ 2-меркаптоэтанола в среде L15 Лейбовица. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
- Создайте 5 аликвот 100 мкг/мл растворов BDNF, CNTF и GDNF, разбавленных в стерилизованной воде. Храните при -80 градусах Цельсия и оттаивайте аликвоты на RT непосредственно перед использованием.
- Приготовьте 10 мМ раствор азначитина, добавив 64 л диметилсульксида (ДМСО) до 5 мг (1,0670 мкм) форсколина и вихря, чтобы полностью раствориться. Затем добавьте стерилизованные воды (1,003 мл) в раствор DMSO и вихрь хорошо. Храните 12 аликотов в 10 мм форсколин при -20 градусов по Цельсию и оттепель aliquots на RT непосредственно перед использованием.
- Приготовьте 12 аликотов 100 мМ изобутилметилксантина (IBMX), разбавленного в DMSO. Храните при -20 градусов по Цельсию и оттепель aliquots на RT непосредственно перед использованием.
- Чтобы сделать моторного нейрона культуры среды, смешать 9,4 мл нейробазальной среды с 200 зл и сыворотки лошади (2%), 200 Зл 50x B27 дополнения (1x), 100 л 100x глутамина дополнения (1x 100 л из 10 000 U/m: пенициллин-стрептомицин (100 U/mL), и 20 мЛ 2-мМ 2-меркаптоэтанола (50 мкм), предпочтительно непосредственно перед использованием. Этот шаг может быть выполнен до 1 дня до изоляции нейронов.
- Непосредственно перед использованием, добавить 1 л каждый из 100 мкг /мЛ BDNF (10 нг/мл), CNTF (10 нг/мл), и GDNF (10 нг/мл) и 10 л 10 мМ форсколин (10 мкм) и 10 мЛ 10 мМ IBMX (100 мм. Разогрейте среднюю до 37 градусов по Цельсию.
- Подготовьте решения для диссоциации.
- Приготовьте пасаинный раствор (20 U/mL papain и 0.005% DNase) и раствор ингибитора альбумина-овомукойда (1 мг/мл ингибитора овомукойда, 1 мг/мл альбумина и 0,005% DNase) в соответствии с инструкциями производителя.
- Приготовьте 500 аликвот оврок каждого из ингибитора овомукойда и папинских растворов и храните при -80 градусов по Цельсию. Оттепель aliquots при 37 градусах По Цельсию непосредственно перед использованием.
5. Вентральный средний мозг и рассечение спинного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги, за исключением шагов 5.1.1-5.1.3 и 5.1.5-5.1.6 под стереомикроскопом вскрытия флуоресценции. Общее время вскрытия за эксперимент, как правило, составляет 3,5 ч, в зависимости от уровня знаний в технике вскрытия и количества моторных нейронов, необходимых для каждого эксперимента.
- Вентральный вскрытие среднего мозга
- Эвтаназия беременной мыши примерно 11,5 дней послеоплодизации углекислым газом и вывихом шейки матки.
- Спрей живота тщательно с этанолом и удалить матку с помощью стерильных микрорассечения ножницы и большой палец заправки щипцы. Вымойте матку кратко в стерильных PBS, а затем передать вскрытие пластины заполнены прехлированные стерильные PBS.
- Удалить IslMN:GFP-положительныеэмбрионы тщательно из матки с помощью стерильных микрорассечения ножницы, большой палец заправки щипцы, и Дюмон #5 пинцетом в ледяной стерильной PBS под ярким светом микроскопа. Используя стерильную мини-перфорированную ложку Мории, перенесите каждый эмбрион в отдельный колодец 24 скважины, наполненной прехлатой Хибернат-E низкой флуоресценцией, дополненной 1x B27. Держите 24 хорошо пластины на льду.
- Перенесите один эмбрион в стерильную пластину для вскрытия и полностью покройте его сбалансированным соляным раствором Хэнка (HBSS).
- Убедитесь, что действия вскрытия выполняются под флуоресцееновый изотиоцианат (FITC) под светоподсветку микроскопа. С помощью пинцета, удалить хвост и лицо эмбриона, не повреждая средний мозг(рисунок 2Ba). Поместите эмбрион склонны с конечностями, оседлал под и хвост указывая на передней части микроскопа, к диссектору (показано звездочкой, Рисунок 2Bb).
- Используя пинцет, разрежь крышу четвертого желудочка для того, чтобы создать небольшое отверстие. Используйте это отверстие, чтобы зацепить пинцетом в пространство, созданное между четвертым желудочком и его крышей. Рассекать вдоль пресальной поверхности эмбриона rostral к коре и боковой к напольной пластине и моторной колонке(Рисунок 2Ca,b). Откройте расчлененную ткань в открытой книге образом, чтобы выявить GFP-положительные cn3 и CN4 ядра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой кусок ткани из брюшного среднего мозга, содержащий мезенхим, CN3, и CN4 теперь будут подвергаться. - Тщательно отделить брюшной средний мозг от эмбриона и удалить менингеальной ткани с помощью пинцета и микрорассечения нож. Вскрыть двусторонние GFP-положительные ядра CN3 и CN4 от напольной пластины и других GFP-отрицательных окружающих тканей с помощью пинцета и микрорассечения нож (Рисунок 2D). Увеличьте количество GFP-положительных моторных нейронов в вырезанной ткани, но не прикасаясь или повреждая их.
- Если коллекция отдельных ядер CN3 и CN4 желательно, вырезать вдоль средней линии этих двух ядер (желтая пунктирная линия на рисунке 2D). Используя пипетку P1000, соберите расчлененные брюшной ткани среднего мозга с минимальным HBSS и поместите его в помеченную микроцентрифугную трубку 1,7 мл, наполненную вскрытием среды (см. шаг 4.1.5). Хранить на льду до разобщенности.
- Продолжить объединение брюшных средних мозгов из дополнительных эмбрионов в той же трубке до тех пор, пока общее число не будет соответствовать экспериментальному требованию (обратитесь к шагу 8 для идеальных номеров клеток).
ПРИМЕЧАНИЕ: Объединенной коллекции по крайней мере 10 брюшной midbrains, приносящей примерно 1 х 104 CN3/CN4 моторных нейронов рекомендуется, потому что ткани подвержены стрессу во время диссоциации и сортировки.
- Вскрытие вентрального спинного мозга
- Держите эмбрион подверженным с головой, обращенной к передней части микроскопа, к диссектору. Держите эмбрион с одной парой пинцета и вставьте кончик другой пары пинцета в неоткрытую каудальную часть четвертого желудочка.
- Открыть остальную часть заднего мозга и спинного мозга спинной по всей розрокодальной степени эмбриона. Открыть путем резки спинной ткани, начиная с четвертого желудочка и работает в направлении центрального канала каудального спинного мозга с помощью щипцы в качестве ножниц (Рисунок 2Ca,b). Позаботьтесь, чтобы избежать прикосновения или повреждения брюшного спинного мозга во время этой процедуры.
- Держите эмбрион с одной парой пинцета и ущипнуть лоскут предыпченной ткани с каждой стороны с другой парой пинцета (Рисунок 2Ea,b).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезанные спинные ткани содержат спинную кожу, мезенхим, спинные корневые ганглии (DRGs), спинной задний мозг и спинной мозг. Удалите как можно больше этих тканей, как это возможно, не повреждая ядра SMN, потому что они являются клеевыми и могут ловушки SMNs во время фильтрации или вызвать засорение во время сортировки FACS. - Удалите брюшной спинной мозг с помощью микрорассечения нож, чтобы проколоть непосредственно под GFP-положительный SMN. Поднимите брюшной спинной мозг с пилоподобными движениями с обеих сторон(рисунок 2Fa,b). Вырезать плавающий брюшной спинной мозг поперечно непосредственно над C1, где первый GFP-положительный передний рог проектов(Рисунок 2G). Кроме того, вырезать поперечно на верхней границе нижней конечности(Рисунок 2G). Удалить шейки (C1)-поясничный (L2-L3) часть брюшного спинного мозга после этой процедуры.
- Поместите брюшной спинной мозг спинной стороны вверх и удерживайте, нажав GFP-отрицательную ткань между GFP-положительных столбцов SMN с одной парой пинцета. Удалите оставшиеся прилагается мезенхим, DRGs, и спинной спинной мозг, обрезка обеих сторон GFP-положительный SMN колонки с микродиссекционным ножом(Рисунок 2H). Позаботьтесь, чтобы максимизировать GFP-положительных моторных нейронов, не повреждая их.
- Используя пипетку P1000, соберите расчлененные брюшной ткани спинного мозга с минимальным HBSS и поместите в SMN-маркированных 1,7 мл микроцентрифугной трубки заполнены вскрытия среды. Хранить на льду до разобщенности. Продолжить объединение брюшных спинных мозгов от дополнительных эмбрионов в той же трубке, пока общее число не отвечает экспериментальным требованиям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор по крайней мере три брюшных спинных мозга дает примерно 2,1 х 104 SMN рекомендуется, потому что ткани подвержены стрессу во время диссоциации и сортировки. - Сбор лицевых моторных нейронов и конечностей IslMN:GFP мыши эмбрионов, как GFP-положительный и GFP-отрицательный контроль для флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS), соответственно. Конечности являются GFP-отрицательным, потому что GFP-положительные аксоны SMNs еще не распространились на конечности в этом эмбриональном возрасте.
6. Диссоциация тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время диссоциации обычно составляет 1,5 л за эксперимент.
- Теплый папаин и альбумин-овомукойдингингинг раствор aliquots до 37 кс 30 мин до диссоциации.
- Кратко вращать вниз микрорасчлененных тканей на низкой скорости.
- Используя пипетку P100, тщательно удалите как можно больше Hibernate E, не усыпивая ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте удалить все остаточные Hibernate E после этого шага, чтобы избежать снижения эффективности педофил диссоциации в следующем шаге. - Добавьте соответствующий объем папинского раствора(таблица 1) к каждой из микроцентрифуговых труб 1,7 мл, содержащих микрорасчлененные образцы тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий объем папаина для диссоциации был определен для того, чтобы максимизировать эффективную диссоциацию при минимизации нагрузки на клетки. - Аккуратно тритур 8x с пипеткой P200. Выполните все шаги тритурации осторожно, чтобы сохранить жизнеспособность моторных нейронов.
- Инкубировать трубки, содержащие ткани в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию, агитируя пальцем, щелкающим 10x каждые 10 минут. Мягко triturate каждой подвески 8x с пипеткой P200 после инкубации. Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 мин.
- Для обеспечения эффективности овомукойдного ингибирования на следующем этапе, используйте пипетку P1000, чтобы удалить и выбросить как можно больше супернатантов, как это возможно, не усыпйдя тканей.
- Resuspend гранулы в соответствующем объеме альбумин-овомукойдинг ингибитор решение (Таблица 1) мягко triturating 8x с пипеткой P200.
- Подождите 2 минуты, чтобы все оставшиеся куски неотделимых тканей, чтобы осесть на дно трубки.
- Соберите как можно больше супернатантов, не вызывая несоссоизуемые ткани с помощью пипетки P200. Перенесите супернатант в свежие микроцентрифугные трубки мощностью 1,7 мл.
- Если некоторые куски ткани остаются неосмежеченными после шага 6.10, повторите шаги 6.8-6.10 для неиссоциированных тканей, которые остаются в исходных микроцентрифуговых трубках 1,7 мл, чтобы максимизировать конечную доходность диссоциированных клеток, снижая при этом нагрузку на клетки диссоциированных ранее, содержащихся в супернатанте шага 6.10.
- Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 мин. Тщательно удалить и отбросить супернатант с помощью пипетки P1000.
- Приостановите гранулы в соответствующем объеме вскрытия среды (Таблица 1) путем pipetting 8x с помощью пипетки P1000. Соответствующий объем окончательной подвески был определен таким образом, чтобы плотность клеток не превышала 107 ячеек/мл, которые могут блокировать поток цитометрии, но и так, чтобы клетки не были чрезмерно разбавлены, что приводит к замедлению скорости сортировки.
- Фильтр суспензий через 70 мкм ячейки ситечко для устранения любых больших сгустков или непереваренной ткани. Перенесите подвески в 5 мл круглых нижних пробирки полистирола и хранить на льду до тех пор, пока требуется.
7. Флуоресцентная сортировка клеток (FACS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован с помощью сортировки FACS, оснащенной фиолетовым лазером мощностью 15 МВт 405 Нм, голубым лазером мощностью 100 МВт 488 нм, оранжевым лазером мощностью 75 Мвт 594 нм и красным лазером мощностью 40 Мвт 640 нм. Клетки были отсортированы как оболочка жидкости в стерильных PBS в асептических условиях через сопло 100 мкм. Чтобы свести к минимуму клеточный стресс, скорость потока была установлена на пробное давление 1 кв3, таким образом, что максимум 1000-4000 событий в секунду были приобретены. Общее время FACS обычно составляет 1,2 ч за эксперимент.
- Настройка напряжения для переднего и бокового рассеяния, чтобы популяция клеток была правильно визуализирована. Настройка соответствующего напряжения для сортировки ячеек является сложной и требует опытного оператора FACS.
- Чтобы различать различные популяции клеток, участок ячейки на основе размера, определяемого областью переднего рассеяния (FSC-A) по сравнению с внутренней сложностью, определяемой областью бокового рассеяния (SSC-A). Нарисуйте ворота вокруг живых клеток, как указано на рисунке 3Аа и Рисунок Ба, чтобы исключить мусор и мертвые клетки. Группируйте ячейки в закрытом регионе как население 1 (P1).
- Чтобы исключить ячейки сгустки и дублеты, участок P1 ячейки следующий на основе боковой ширины рассеяния (SSC-W) против SSC-A. Ворота населения одиночных ячеек, как население 2 (P2)(Рисунок 3Ab и Рисунок Bb).
- Участок P2 ячейки на основе вперед разброс ширины (FSC-W) по сравнению с FSC-A и ворота населения одиночных ячеек, как население 3 (P3) (Рисунок 3Ac и рисунок до н.э.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование двух последовательных ворот в 7.3 и 7.4 исключает сгустки и дублеты (высокий FSC-W и высокий FSC-A). - Клетки Gate P3 на основе GFP против аллофикоцианина (APC). Канал APC обнаруживает автофлюоресценцию. Гатинг на этом канале позволяет избежать захвата автофлуоресцентных клеток. Используйте GFP-отрицательные ячейки для регулировки напряжения для флуоресцентных каналов FITC/GFP. Идеально, стробы положения для этих населенностью клетки вокруг 102. Выберите пороги ворот для GFP-положительной популяции 4 (P4) индивидуально для каждого типа моторного нейрона(рисунок 3Ad и Рисунок Bd).
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите gFP ворота гораздо выше для SMNs, чем для CN3s / CN4s для того, чтобы получить чистую культуру(Рисунок 3Объявление и Рисунок Bd). Более низкие ворота GFP для культур SMN водят к загрязнению культур глией и non-моторными нейронами. Это, вероятно, потому, что есть низкоуровневый GFP выражение в некоторых глия и немоторных нейронов из-за вытекающей промоутер. Процент GFP-положительных ячеек по сравнению с общими ячейками обычно составляет 0,5–1,5% для CN3s/CN4s и 1,5–2,5% для SMN. Если вскрытие было успешным, эти цифры могут быть использованы в качестве эталона для определения соответствующего положения для GFP-положительных ворот(рисунок 3Ae и Рисунок Бе). - Выполняйте FACS в соответствии с протоколом производителя. Соберите P4 клетки в свежие 1,7 мл микроцентрифуговых труб, наполненных 500 злицами среды культуры моторных нейронов. Хранить на льду до покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя клетки могут быть отсортированы непосредственно в скважины, это приводит к неравномерному количеству клеток на скважину. Сортировать клетки в 1,75 мл микроцентрифуговых труб, а затем пластины вручную для того, чтобы достичь более равномерного распространения покрытия.
8. Культура очищенных первичных моторных нейронов
- Разбавленные FACS-изолированные CN3/CN4 и SMN подвески со средней культурой моторных нейронов прегреты до 37 градусов по Цельсию до плотности 5 х 103 и 1 х 104 клетки/мл, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один эмбрион E11.5 дает примерно 1 х 103 CN3/CN4 и 7 x 103 SMN. Тем не менее, эти урожаи в значительной степени зависят от чистоты расчлененных тканей, тщательности диссоциации клеток и соответствующего порогового значения ворот GFP во время FACS. - Передача 96 хорошо пластин ы предварительно с PDL и ламинин из 37 КК культуры инкубатора на ламинарный капот потока и аспират ламинин из каждого колодца. Используйте пластины и крышки сразу же без мытья.
- Добавьте 200 qL разбавленных CN3/CN4 и SMN суспензий в каждую скважину 96 скважин с покрытием PDL/laminin. Конечная плотность клеток должна быть 1 х 103 и 2 х 103 клетки / хорошо для CN3/CN4 и SMN, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная плотность покрытия SMNs в 96 скважинных пластинах (2 х 103 клетки/хорошо) в два раза больше, чем CN3s/CN4s (1 х 103 клетки/хорошо) для того, чтобы получить аналогичные окончательные номера и плотность моторных нейронов на 2 и 9 дней in vitro (DIV) (4'6 х 102 и 2 х 10в хорошо, соответственно). - Культурные нейроны в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
- Кормите нейроны каждые 5 дней, удаляя половину старых носителей (100 л) и заменяя тем же объемом среды культуры свежих моторных нейронов. Убедитесь, что нейронные процессы становятся видимыми на 1 DIV и становятся толще и длиннее на 14 DIV(рисунок 4). Нейронные клетки органов становятся увеличенными и, как правило, агрегируются в долгосрочных культурах, особенно для SMNs(рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все средние и решения изменения, оставив половину первоначального среднего объема, чтобы избежать отсоединения культурных клеток. Это включает в себя фиксацию и иммуноцитохимию (ICC) шаги. Если все носители будут удалены, независимо от того, как мягко, большинство клеток будет отсоединиться и смыть.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель этого протокола состояла в том, чтобы высоко очистить и культуры как первичных CN3s /CN4s и SMNs долгосрочной, чтобы позволить сравнительный анализ механизмов, лежащих в основе двигательных расстройств нейронов (см. Рисунок 1 и Рисунок 2 для обзора).
После того, как нейроны были успешно изолированы и выращены в культуре, почти чистые первичные CN3/CN4 и SMN культур были получены(Рисунок 5A,B) и поддерживается по крайней мере 14 DIV (Рисунок 4 и Рисунок 6). Чистота CN3/CN4 и SMN культур на 2 DIV были 93,5 и 2,2% и 86,7 и 4,7%, соответственно, при оценке МЦК с помощью маркера моторных нейронов Islet1 и нейрональный маркер TUJ1(Рисунок 5B). Тем не менее, эти высокие чистоты в значительной степени зависит от возраста эмбрионов и на установление соответствующих порогов для GFP ворота во время FACS (Рисунок 3). Рассечение эмбрионов при Е10,5 сложнее, чем рассечение на E11.5 из-за повышенной мягкости и клея тканей, что приводит к снижению урожайности моторных нейронов. Тем не менее, чистота E10.5 CN3s/CN4s/CN4s и SMNs была сопоставима с чистотами для эмбрионов E11.5 (92,8% и 82,2% при 2 DIV, соответственно; данные, полученные в ходе одного эксперимента). Чистота CN3s/CN4s и SMNs резко снизилась, когда e13.5 эмбрионов были использованы, даже если только самый высокий GFP-положительных населения было собрано (20,7% и 7,4% на 2 DIV, соответственно; данные, полученные в результате одного эксперимента), вероятно, из-за выражения GFP в немоторных нейронов (Рисунок 7). Эта же тенденция была справедливой и для культур E12.5, хотя она была гораздо менее драматичной. Таким образом, эмбрионы на E12.5 или старше не подходят для использования в очистке моторных нейронов с помощью этого протокола.
Чистые культуры моторных нейронов ценны для понимания изолированных моделей роста, поведения и уязвимостей моторных нейронов. Этот пример демонстрирует, как эти культуры могут быть использованы для проверки реакции моторных нейронов на химическую обработку. Чтобы определить, если первичные CN3s/CN4s и SMNs показывают дифференциальные реакции на эндоплазмические ремикулумы (ER) стрессоры, первичные монокультуры CN3s/CN4s и SMNs были получены с помощью этого протокола и обработаны с различной концентрацией ER стрессора, циклопиазонной кислоты (CPA). Нейроны лечились cpA (5, 10, 15, 20, 25, или 30 мкм) или управления транспортным средством (DMSO) на 2 DIV и фиксированной 3 дней спустя для МТП для оценки коэффициентов выживания(рисунок 8A). Количество жизнеспособных нейронов в каждом образце было подсчитано и коэффициенты выживаемости были рассчитаны как количество жизнеспособных клеток в обработанных наркотиками скважинах, разделенных на количество жизнеспособных клеток в скважинах, обработанных ДМСО. Монокультуры CN3/CN4 были значительно более устойчивы к лечению CPA (10–25 км) по сравнению с монокультурами SMN(рисунок 9 и рисунок 8В)31.
В заключение, этот протокол позволяет для генерации высоко очищенных первичных мышей эмбриональных CN3/CN4 и SMN культур, которые обеспечивают мощную и надежную систему для исследования нейронного поведения.
Рисунок 1: Схема подготовки эмбриональных моторных нейронов мыши. Схема иллюстрирует шаги, связанные с изоляцией и культурой эмбриональных моторных нейронов мыши и приблизительное время в часах или днях для каждого шага. Порядок процедуры вскрытия для CN3/CN4 и для SMN помечены последовательно от 1 до 4. Аббревиативы: CN3/CN4 - окуломоторный нейрон/трохлеарный нейрон; SMN - спинальный моторный нейрон; FACS - сортировка клеток, активированная флуоресценцией; ч й час; d й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Рассечение брюшного среднего мозга и шейки матки (C1)-поясничный (L2-L3) часть брюшного спинного мозга. (A) Боковой (а) и псовой(b) вид GFP-положительных моторных нейронов в E11.5 IslMN:GFP трансгенного эмбриона мыши под флюоресцеин изотиоцианат (FITC) освещения. Для того, чтобы сделать эмбрион прозрачным, была подготовлена целая гора E11.5 эмбриона, как уже говорилосьранее. Впоследствии эмбрион был проанализирован с помощью иммунофлуоресцентности маркировки с анти-GFP окрашивания (зеленый). Изображения были сняты под конфопальный микроскоп. Шкала баров - 200 мкм (боковой вид) и 400 мкм (дорсальный вид). Аббревиаты: S - выше; Я низший; V и вентрал; D и дорсальный. (B-H) Рассечение шаги выделены на изображениях E11.5 брюшной среднего мозга и брюшной ткани спинного мозга, принятые с оборудованной камерой под ярким светом (Bb) или FITC освещения с помощью стереомикроскопа рассечения флуоресценции. Шкала баров - 200 мкм (D) и 1 мм (АКК, Экх). (B)() Удаление лица и хвоста эмбриона путем резки вдоль красных линий. (б)Эмбрион, расположенный для вскрытия. Позиционирование передней части микроскопа указывается звездочкой. (C) Резка вдоль твердой красной линии для того, чтобы разрезать крышу четвертого желудочка(a)боковой вид и (b)вид на сон. Использование этого отверстия, чтобы разрезать вдоль поверхности эмбриона в дорсаль к мозгу (траектория, указанная пунктирной красной стрелкой). Это подвергает ткани, содержащие мезенхимы, CN3, и CN4, которые могут быть подняты из черепа. Для вскрытия SMN, вставка щипцы в том же отверстие между четвертым желудочком и его крышей, а затем резки к каудальной стороне эмбриона (траектория, указанная пунктирной желтой стрелкой). (D) Заключительный вид брюшной midbrain, содержащий двусторонние GFP-положительные CN3 и CN4 ядра. Края ткани выделены красным прямоугольником. Резка вдоль желтой пунктирной линии для сбора cn3 и CN4 ядер отдельно, при желании. (E) После открытия остальной части заднего мозга и спинного мозга, хлопая спинной ткани ущипнул выше красных линий с обеих сторон с пинцетом() до, и (b) после. (F) Двустороннее удаление избыточной ткани брюшной брюшной мозг в спинной мозг вдоль красной линии (а) до, и (b) после. (G) Резка брюшного спинного мозга в двух местах, указанных красными линиями. На ростральной стороне, резка плавающей брюшной спинной мозг поперечно выше C1, где первый GFP-положительный передний рог проектов. Резка каудаального конца спинного мозга поперечно на верхней границе нижней конечности. Как только эти сокращения сделаны, шейки матки (C1) через поясничный (L2-L3) часть брюшного спинного мозга могут быть расчленены прочь. (H) Заключительный вид брюшного спинного мозга, содержащего GFP-положительные столбцы SMN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель рода участков брюшной среднего мозга (A) и брюшной спинной мозг (B). (Аа и Ба) Передняя область рассеяния (FSC-A) против области бокового рассеяния (SSC-A) отсортированы участок до исключения мусора и мертвых клеток. (Ab, Bb, Ac, bc) Сортированные участки для исключения клеточных сгустков(b)и дублетов(c)на основе ширины (SSC-W) против SSC-A и Forward Scatter Width (FSC-W) против FSC-A, соответственно. (Объявление и Bd) Сортированные участки, чтобы изолировать IslMN:GFP -положительные моторные нейроны. Для того, чтобы получить чистую культуру, GFP ворота должны быть установлены выше для SMNs(Bd), чем для CN3s/CN4s (Объявление). (Ae и Be) Проценты ячеек, закрытых для сбора сортировкой FACS. %Родитель представляет процент клеток в текущей закрытой популяции по отношению к числу ячеек в предыдущей популяции закрытых ячеек, в то время как %Total представляет процент закрытых ячеек по отношению к общему количеству ячеек. Ожидаемые проценты GFP-положительных ячеек по сравнению с общими ячейками (в коробке красным цветом) составляют 0,5-1,5% для CN3/CN4 и 1,5-2,5% для SMN. Если вскрытие было выполнено успешно, эти проценты могут быть использованы в качестве эталона для создания GFP-положительных ворот в (Объявление и Bd). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Фазовые контрастные изображения первичных монокультур CN3/CN4 и SMN на 2, 7 и 14 DIV. Представитель дифференциальных интерференционных контрастных изображений первичных культур CN3/CN4 и SMN были захвачены на 2, 7 и 14 DIV с перевернутым флуоресценционным микроскопом с использованием соответствующего программного обеспечения для приобретения и обработки изображений и 40x целей. Нейронные процессы становились толще и длиннее на 14 DIV. Размеры тела нейрональных клеток стали увеличенными и, как правило, агрегируются в долгосрочных культурах, особенно для SMNs. Обе культуры могут быть сохранены по крайней мере 14 DIV. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Характеристики изолированных культур мыши E11.5 CN3/CN4 и SMN. (A) Представитель иммуноцитохимии изображения E11.5 мыши CN3s/CN4s (вверху) и SMNs (внизу) культивируется для 2 DIV. Иммунофлуоресценция маркировки с нейрональным маркером TUJ1 (зеленый) и двигательный нейрон маркер Islet1 (красный) выполняется для анализа нейронов и ядер были противопоставлены DAPI (синий). Почти все культивированные клетки были моторные нейроны (TUJ1,Islet1)). Изображения были получены с помощью перевернутого флуоресценции с использованием соответствующего программного обеспечения для приобретения и обработки изображений и 20-x целей. Образцы были отображаются и обработаны для достижения максимальной интенсивности сигнала без насыщенных пикселей. Вэтихные работы и обработка изображений в следующих цифрах выполнялись в этих условиях, если не указано иное. Шкала бар 100 мкм. (B) чистоты E11.5 мыши CN3/CN4 и SMN культур на 2 DIV. Чистота культур CN3/CN4 и SMN составила 93,5 и 2,2% и 86,7 и 4,7%, соответственно. Мертвые нейрональные тела клеток были оценены путем скрининга на пикнотическую ядерную морфологию и отек мембраны. Нейронные процессы были классифицированы как вырождающиеся процессы, когда наблюдались признаки бисерокасается и отеков. Клетки, не относящиеся ни к гибели клеток,ни к вырождающимся процессам, считались жизнеспособными немоторными нейронами (TUJ1 , Islet1-) или жизнеспособными моторными нейронами (TUJ1,Islet1)33. Чистоты моторных нейронных культур были рассчитаны как количество жизнеспособных моторных нейронов, разделенных на общее количество жизнеспособных немоторных нейронов плюс жизнеспособные моторные нейроны. Значения представляют собой среднее значение SEM трех отдельных экспериментов. Не является значительным (р. Подсчет ячеек осуществлялся вручную под 20-x увеличением. Аббревиаты: SEM - стандартная ошибка среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Представитель иммуноцитохимии первичных монокультур CN3/CN4 и SMN на 2, 7 и 14 DIV. Первичные культуры CN3/CN4 и SMN были проанализированы на 2, 7, 14 DIV по иммунофлуоресцентной маркировке с TUJ1 (зеленый), а ядра были противопоставлены DAPI (синий). Нейронные процессы становятся толще и длиннее на 14 DIV. Размеры тела нейрональных клеток стали увеличены и, как правило, агрегируются в долгосрочных культурах, особенно для SMNs. Обе культуры CN3/CN4 и SMN могут поддерживаться по меньшей мере 14 DIV. Изображения были захвачены под 10-x увеличением. Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Характеристика E13.5 мыши CN3/CN4 и SMN изолированных культур. E13.5 CN3/CN4 и SMN были изолированы и культивированы с помощью этого протокола и проанализированы на 2 DIV с помощью иммунофлуоресценции маркировки с TUJ1 (зеленый) и Islet1 (красный), и ядра были противопятнаны DAPI (синий). Многие немоторные нейронные клетки(TUJ1 , Islet1- )присутствовали (стрелки), что привело к резкому снижению как CN3/CN4, так и чистоты SMN, с уменьшением более выраженного в культурах SMN. Изображения были захвачены под 20-x увеличением. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Представитель применения первичной культуры моторных нейронов, демонстрирующих, что CN3s/CN4s избирательно устойчивы к стрессу ER, индуцированному CPA. (A) Экспериментальный план: первичные CN3/CN4 и SMN монокультуры были обработаны CPA или управления транспортным средством (DMSO) на 2 DIV и клеточной viabilities были оценены с помощью иммуноцитохимии анализа после 3 дней лечения. Этот план был изменен из опубликованной работы31. (B) Количественная ссоотношение выживаемости CN3s/CN4s и SMNs, обработанных с помощью 5-30 ММ CPA в течение 3 дней из 2 DIV. Нейроны были проанализированы с помощью иммунофлуоресцентной маркировки клеток с TUJ1, а ядра были противопоставлены DAPI. Коэффициенты выживаемости были рассчитаны как количество жизнеспособных клеток (см. Рисунок 5B легенда) в обработанных наркотиками скважин, разделенных на количество жизнеспособных клеток в скважинах, содержащих только транспортное средство (DMSO). Подсчет ячеек осуществлялся вручную под 20-x увеличением. Значения представляют собой среднее значение SEM из четырех отдельных экспериментов. Злт; 0,05; р Злт; 0,005 по тесту студента т. Эта цифра была изменена с ранее опубликованной работы31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Представитель иммуноцитохимии первичных монокультур CN3/CN4 и SMN после 3-дневного воздействия на повышение концентрации CPA, начиная с 2 DIV. Нейроны были проанализированы иммунофлуоресцентной маркировки клеток с TUJ1 (зеленый) и ядра были противопоставлены DAPI (синий). Первичные CN3s/CN4s были более устойчивы к лечению CPA, чем первичные SMNs. Изображения были захвачены под 10-x увеличением. Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Количество средних мозгов (X) | Папаин | Альбумин-овомукойд | Хибернит E | |||||||||
| 10 х 20 евро | 200 зл. | 100 л | 600 л | |||||||||
| 20 злт; Х 30 | 300 л | 150 л | 700 л | |||||||||
| 30 злт; Х 40 | 400 л | 200 зл. | 800 л | |||||||||
| Количество спинных мозгов (Y) | Папаин | Альбумин-овомукойд | Хибернит E | |||||||||
| 3 й Y 5 | 200 зл. | 100 л | 500 л | |||||||||
| 5 злт; Y 10 | 400 л | 200 зл. | 800 л | |||||||||
| 10 злт; Y 15 | 600 л | 300 л | 1200 л | |||||||||
Таблица 1: Соответствующие тома папаина, альбумина-овомукойда и окончательной приостановки, используемые в шагах диссоциации. Соответствующие тома папаина и альбумина-овомукойда, которые будут использоваться с различными числами брюшной ткани среднего и брюшного спинного мозга, были изменены по указанию производителя после нескольких раундов оптимизации. Поскольку ткани подвержены стрессу во время диссоциации и сортировки, рекомендуется объединенная коллекция из более чем 10 брюшных средних мозгов и более трех брюшных спинных мозга. Объем папаина определялся с учетом баланса между эффективной диссоциацией и стрессом этой процедуры. Объем раствора ингибитора альбумина-овомукойда в два раза меньше, чем у папаина. Соответствующий объем окончательной подвески Hibernate E был определен таким образом, что плотность клеток не превышает 107 клеток/мл, но клетки не становятся чрезмерно разбавленными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исторически, в пробирке исследования CN3 и / или CN4 моторных нейронов опирались на неоднородные культуры, такие как разобщенные17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, и ломтик27,28 культур, потому что эти клетки не могут быть отделены от окружающих клеток на основе размера, и конкретные маркеры для этих клеток не сообщалось. Настоящий протокол представляет собой комплексный метод изоляции и культуры первичных E11.5 murine CN3s/CN4s, а также SMNs из одних и тех же эмбрионов и подтверждает высокую чистоту культур. Создавая чистые культуры SMN и CN3/CN4 из одних и тех же эмбрионов мыши, протокол позволяет проводить контролируемые сравнения поведения in vitro CN3s/CN4s против SMNs, изолированных от дикого типа, а также эмбрионов-мутантов.
Чистые культуры CN3s/CN4s и SMNs, генерируемые этим протоколом, позволяют проводить сравнительные исследования морфологических, клеточных, молекулярных и электрофизиологических характеристик этих моторных нейронов. В теории, поскольку другие популяции черепных моторных нейронов могут быть визуализированы и вскрыты из этого IslMN:GFP трансгенной линии мыши (в том числе abducens, мотор тройничных, лица, и гипоглоскаль), этот протокол может быть расширен для их изоляции и культуры, а также при условии, что FACS GFP Ворота корректируются надлежащим образом. Наконец, FACS-сортированных моторных нейронов, полученных из этого протокола могут быть подвергнуты геномных (например, анализ транспозазии для Транспозазасы-Доступный хроматин с использованием секвенирования, или ATAC-seq) и / или транскриптомические(например, РНК последовательности31) анализы для изучения нормальной разработки и селективной уязвимости конкретных двигательных нейротипов.
Есть несколько шагов в этом протоколе, которые имеют решающее значение для максимального числа чистых, здоровых моторных нейронов в изолированной системе культуры. Во время вскрытия, GFP-отрицательные ткани (например, мезенхим и DRGs) должны быть максимально удалены без повреждения моторных нейронов, потому что эти ткани являются клеями и может ловушки SMNs во время фильтрации или вызвать засорение во время сортировки FACS. Во время диссоциации тканей следует использовать минимальный необходимый объем папаина, и клетки следует обращать мягко с минимальным, но достаточным трикуляцией. Папаин был использован для шага диссоциации тканей в этом протоколе, потому что предварительные данные показали, что он менее разрушительным, чем трипсин как CN3/CN4 и SMN. Коэффициенты выживаемости на основе покрытых номеров CN3s/CN4s и SMNs на 2 DIV увеличились с 39,5% до 52,7% и с 52,3% до 58,4%, соответственно, когда вместо трипсина (0,25%, 4 инкубации). Хотя эти цифры являются производными от одного эксперимента, проведенного до полной оптимизации, дополнительные отчеты также показывают, что трипсин является неоптимальным для извлечения клеток из тканей нервной системы12,34,35,36. Во время FACS не следует использовать флуоресцентные жизненно важные красители (пропидий йодид и кальцийн-синий) и небольшие сортировочная сопла (например, 70 мкм), поскольку они вредны для выживания моторных нейронов. Использование больших сортировочных сопла (100 мкм или больше) настоятельно рекомендуется, потому что смерть клеток SMN значительно возрастает при использовании сопла 70 мкм. Установка соответствующих пороговых значений для GFP-позитивных клеток в FACS является критическим шагом для получения чистых культур. Культуры моторных нейронов дополняются форсколином, IBMX и факторами роста (BDNF, CNTF и GDNF). Форсколин и IBMX, как сообщается, дополнительно способствовать sMN выживания37,38. Предварительные данные, полученные в настоящее время, свидетельствуют о том, что форсколин и IBMX также дополнительно повышают выживаемость CN3/CN4. Коэффициент выживаемости, основанный на покрытых числах CN3s/CN4s на 2 DIV, увеличился с 17,5% до 26,9%, 31,9% и 37,0%, когда были добавлены IBMX, форсколин и IBMX-форсколин соответственно (цифры основаны на одном эксперименте, проведенном до полной оптимизации условий клеточной культуры). Лучше всего выполнять все средние изменения и явки культивированных клеток, оставляя половину первоначального объема, чтобы избежать отсоединения культивированных клеток. Наконец, он также идеально подходит для сокращения времени, затрачиваемого между вскрытием и покрытием моторных нейронов (например, путем сокращения времени вскрытия с помощью нескольких диссекторов) для повышения жизнеспособности культур.
Существует четыре основные потенциальные проблемы, которые могут возникнуть при следовании этому протоколу. Во-первых, низкая урожайность моторных нейронов после FACS. Потенциальные причины низких урожаев включают использование молодых эмбрионов (например, E10.5), которые имеют меньше моторных нейронов, недостаточное удаление клеевых GFP-отрицательных тканей во время рассечения (например, мезенхим и DRGs), которые могут ловушки моторных нейронов и привести к их удалению во время фильтрации, недостаточное papainization/trituration во время диссоциации, и / Второй потенциальной проблемой является низкая чистота культур моторных нейронов, которая, скорее всего, возникает в результате использования более старых эмбрионов (например, E12.5) и/или от установки GFP-положительных ворот слишком низко во время FACS. В-третьих, низкое количество прикрепленных моторных нейронов в культуре может наблюдаться из-за ненадлежащей сортировки FACS и/или неадекватного PDL/ламинина покрытия пластин/покрываллип. В-четвертых, моторные нейроны могут показать низкую жизнеспособность в культуре. Потенциальные причины низкой жизнеспособности включают грубое и/или длительное вскрытие, чрезмерное papainization/trituration во время диссоциации, ненадлежащее обращение с клетками по всему протоколу (например, грубое пайпетирование клеток, неспособность разместить клетки на льду, неспособность предварительно гохрую PBS и HBSS), а также/или чрезмерное время между эвтанизацией беременных мышей и завершением облицовки клеток. Использование реагентов, которые не являются свежими и/или ненадлежащими концентрациями, также может нарушить экспериментальные результаты.
Существует три основных ограничения этого протокола. IslMN:GFP трансгенных мышей и FACS сортировки являются довольно дорогими. Они, однако, имеют решающее значение для этого протокола, поскольку в настоящее время нет альтернативного метода, способного генерировать высокоочищенные CN3s/CN4s в более экономичным образом. Существует небольшое окно e10.5-E12.5 возраст для эмбриональных мышей, и трудно подтвердить, что надлежащим образом возрастных эмбрионов присутствуют, особенно если ультразвуковой аппарат не доступен. Если требуется только чистые SMNs, они могут быть получены из E12.5-15.0 эмбрионов мыши, используя такие методы, как градиент центрифугация10,11,12 и / или p75NTR-антитела основе клеточной сортировки методы13,14,15,16. Наконец, анализы на основе белка, которые требуют большого количества исходного материала, неосуществимы из этих культур из-за небольшой урожайности моторных нейронов (особенно CN3s/CN4s). Стволовые клетки полученных моторных нейронов31,39, которые могут быть созданы безгранично, теоретически может быть заменен для этой цели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Брижит Петтманн (Biogen, Cambridge, MA, США) за обучение методам вскрытия SMN; Дана Фарбер Институт рака Поток цитометрии фонда, иммунологии Отдел потока цитометрии фонда Гарвардской медицинской школы, Джослин Диабет центр потока Цитометрия Core, Бригам и женская больница Поток Цитометрия Core, и Бостон Детская больница Поток Цитометрии научно-исследовательский центр для FACS изоляции первичных моторных нейронов; А.А. Ньюджент, А.П. Тенни, А.С. Ли, Э.Х. Нгуен, М.Ф. Роуз, дополнительные члены лаборатории Энгл и члены консорциума Project ALS для технической помощи и вдумчивого обсуждения. Это исследование было поддержано проектом ALS. Кроме того, R.F. финансировалась Японским фондом сердца/Байером Якухиным Исследовательским грантом за рубежом и грантом NIH Training в области генетики T32 GM007748; JJ была поддержана NIH/ NEI учебной программы в молекулярных баз глазных заболеваний (5T32EY007145-16) через Schepens глаз научно-исследовательский институт и развития неврологии Учебная программа Постдокторской стипендий (5T32NS007473-19) через Бостонскую детскую больницу; M.C.W была поддержана NEI (5K08EY027850) и Детским больничным офтальмологией (Премия открытия факультета); и E.C.E. является Говард Хьюз медицинский институт следователь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
