Summary
Dit protocol is voor de onbevooroordeelde detectie van weefsel-geassocieerde bacteriën in patiënten biopsieën door 16s rRNA in situ hybridisatie en confocale microscopie.
Abstract
Visualisatie van de interactie van bacteriën met gastheer mucosale oppervlakken en weefsels kan waardevol inzicht geven in mechanismen van pathogenese. Terwijl visualisatie van bacteriële pathogenen in diermodellen van infectie kan vertrouwen op bacteriële stammen die zijn ontwikkeld om fluorescerende eiwitten zoals GFP te uiten, vereist visualisatie van bacteriën binnen het slijmvlies van biopsieën of weefsel dat is verkregen van menselijke patiënten een onbevooroordeelde methode. Hier beschrijven we een efficiënte methode voor de detectie van weefsel-geassocieerde bacteriën in menselijke biopsie secties. Deze methode maakt gebruik van fluorescerende in-situ hybridisatie (vissen) met een fluorescerend gelabelde universele oligonucleotide sonde voor 16S rRNA voor het labelen van weefselgeassocieerde bacteriën binnen blaas biopsie secties verkregen van patiënten die lijden aan recidiverende urineweginfectie. Door het gebruik van een universele 16S rRNA-sonde kunnen bacteriën worden opgespoord zonder voorafgaande kennis van soorten, geslachten of biochemische kenmerken, zoals lipopolysaccharide (LPS), die nodig zijn voor detectie door immunofluorescentie-experimenten. We beschrijven een compleet protocol voor 16S rRNA vis van biopsie fixatie tot Imaging door confocale microscopie. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik in bijna elk type weefsel en vertegenwoordigt een krachtig hulpmiddel voor de onpartijdige visualisatie van klinisch relevante bacteriële hostinteracties in het patiëntenweefsel. Bovendien kan dit protocol, met behulp van soorten of genera-specifieke sondes, worden aangepast voor de detectie van specifieke bacteriële pathogenen binnen het patiëntenweefsel.
Introduction
De urinewegen, bestaande uit de urethra, blaas, urineleiders en nieren wordt voortdurend blootgesteld aan bacteriën die bestaan uit de urine-microbiome evenals binnenvallende uropathogenen, zoals uropathogene E. coli (UPEC), uit het maagdarmkanaal 1,2. Een laagje gehydrateerd slijm dat bestaat uit glycosaminoglycanen en een ondoorlatende plaque van geglycosyleerde uroplakin-eiwitten, uitgedrukt op het oppervlak van de oppervlakkige cellen, vormt een barrière die het blaas epitheel routinematig beschermt tegen invasie door aanhangers bacteriën3,4. Tijdens urineweginfectie (UTI), deze barrières worden verstoord of vernietigd, vergemakkelijken van gehechtheid aan en invasie van het blaas epitheel door uropathogene bacteriën5,6. Werk in Murine modellen is gebleken dat veel uropathogene bacteriën, met inbegrip van UPEC, Klebsiella pneumoniae, en enterococcus faecalis replicatieve intracellulaire Gemeenschappen (ibc's) kunnen vormen binnen het cytoplasma van oppervlakkige cellen en stilstellende intracellulaire reservoirs (qirs) binnen overgangs epitheelcellen7,8,9. Hoewel UPEC is geïdentificeerd binnen de schuur epitheelcellen van humane UTI patiënten, was de interactie van uropathogenen met het blaas slijmvlies bij de mens niet eerder gevisualiseerd10.
We hebben een gemeenschappelijke techniek, fluorescentie in situ hybridisatie (Fish), aangepast om bacteriën te detecteren binnen het slijmvlies van blaas biopsieën die zijn verkregen bij postmenopauzale patiënten die Cystoscopie ondergaan met electrofulguratie van trigonitis (ceft) voor de gevorderde beheer van met antibiotica refractaire recidiverende UTI11. Met behulp van een universele sonde voor 16S rRNA, konden we objectief detecteren bacteriesoorten in verband met de blaas mucosa van terugkerende UTI patiënten en bepalen hun positie binnen de blaaswand12. De universele 16S rRNA nucleotide-sonde was eerder ontworpen om te richten op een geconcongeerde regio van de bacteriële 16S rRNA13, die overeenkomt met posities 388-355 van de E. coli 16S rRNA. De 16s rRNA en Scramble probe sequenties zijn eerder gevalideerd en gepubliceerd voor gebruik in de muis gastro-intestinale tractus14,15. De sequenties en eigenschappen van de sondes worden beschreven in tabel 1. Het is essentieel om twee opeenvolgende secties in dit protocol te gebruiken, een voor de 16S rRNA-sonde en één voor de Scramble Probe, om onderscheid te kunnen maken tussen het ware en het achtergrond signaal als het blaas epitheel, collageen en elastine vertonen autofluorescentie16 . In dit protocol zijn de 16S rRNA en Scramble probes ontworpen met fluorescerende Alexa Fluor 488 labels op zowel de 3 ' en 5 ' Termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) ester koppelingen om het fluorescerende signaal te verhogen.
Hoewel dit protocol werd ontwikkeld voor gebruik op menselijke blaas biopsie secties, het kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik op paraffine-ingesloten secties van elk weefsel waar bacteriën worden verondersteld om te verblijven. In tegenstelling tot immunohistochemie-experimenten die gericht zijn op specifieke antigenen (bijv. lipopolysaccharide) op het bacteriële oppervlak, vereist deze methode geen voorafgaande kennis van antigenen uitgedrukt door de weefselgeassocieerde bacteriën10,17 . Gebruik van de universele 16S rRNA-sonde maakt een objectieve detectie van alle bacteriesoorten in het monster mogelijk, maar staat niet toe dat hun identiteit wordt bepaald. Om te bepalen van de identificatie van gedetecteerde bacteriën, soorten of genus-specifieke 16S of 23S rRNA sondes moeten worden gebruikt. Dit protocol zal ook niet detecteren schimmel pathogenen, zoals Candida albicans, geassocieerd met gastheer weefsel. Voor de detectie van schimmel pathogenen, 28S of 18S rRNA sondes moeten worden gebruikt18.
Protocol
Het studie protocol werd goedgekeurd door en volgde de richtlijnen van de institutionele bioveiligheid en chemische veiligheids comités van UT Dallas en UT Southwestern Medical Center. Het gebruik van biopsieën van menselijke proefpersonen in dit protocol werd goedgekeurd door en volgde de richtlijnen van de institutionele Review boards van de UT Dallas en het UT Southwestern Medical Center. Alle personen die betrokken zijn bij de verzameling en verwerking van biopsie hebben huidige Human subject Protection (HSP) en HIPPA training.
1. weefsel voorbereiding voor fixatie en paraffine insluiten
Opmerking: Biopsies werden afgenomen van instroterende vrouwen die Cystoscopie ondergingen met elektro-fulguratie van trigonitis voor het gevorderde beheer van recidiverende urineweginfectie (rUTI). rUTI wordt in een periode van 12 maanden gedefinieerd als 3 UTIs. Biopsie collectie werd uitgevoerd in de operatiekamer terwijl de patiënt onder anesthesie was na het verkrijgen van geïnformeerde patiënt toestemming per UTSW IRB protocol STU 082010-016. Alle monsters werden gecodeerd en de-identificeerde voordat experimenten.
- Verkrijg een Cold-Cup (~ 1 mm3) biopsie van de blaas trigone met urologische Tang via flexibele cystoscoop en plaats onmiddellijk in een steriele 2 ml cryovial met 1,5 ml 4% v/v Paraformaldehyde (PFA) bereid in 1x steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
Opmerking: 4% PFA in 1x PBS kan van tevoren worden gemaakt en bij-20 °c worden bewaard totdat het nodig is. - Bevestig biopsie voor 6 uur bij kamertemperatuur of voor 16-24 uur bij 4 °C.
Opmerking: De fixatie duur moet worden berekend op basis van de grootte van het weefselmonster en overmatige fixatie moet worden vermeden. Het is niet aangeraden Glutaaraldehyde als fixatief te gebruiken, omdat het een automatische fluorescentie introduceert. - In een gesteriliseerde kap of bioveiligheidskast, verwijder fixatief door pipetteren en vervangen door 1,5 mL steriele 1x PBS. Houd de monsters bij 4 °C 's nachts of voer onmiddellijk weefsel verwerking en paraffine insluiten19.
- Gebruik een gesteriliseerde microtoom op sectie weefsel blokken met een dikte van 5 μm en hecht paraffine weefsel secties aan opgeladen glazen Microscoop dia's. Er zijn minimaal twee dia's per biopsie vereist voor het 16S rRNA FISH-protocol.
Opmerking: Het biopsie weefsel moet worden Kruis sectioneel gerangschikt ten opzichte van het snijvlak om ervoor te zorgen visualisatie van urotheliale lagen in alle secties. Ook moet worden opgemerkt dat de sectie dikte moet worden geoptimaliseerd voor bacteriële Gemeenschap detectie. Dunnere secties of bemonstering van meerdere seriële secties kan nodig zijn in het geval van infecties waarbij weefsel Resident bacteriën zijn zeer schaars (bijvoorbeeld, < 1 weefsel-Resident bacterie per 1.000 zoogdiercellen).
2. fluorescentie in situ-hybridisatie met universele 16S rRNA-sondes
Opmerking: Er zijn twee dia's per biopsie vereist. Er is één dia nodig voor de universele 16S rRNA-sonde en één dia voor een stuur sonde met een gecodeerde volgorde. Dit is belangrijk voor het onderscheiden van het ware signaal van het achtergrond signaal tijdens microscopie omdat het blaas epitheel automatisch fluorescerend is in meerdere kanalen. Naast de Scramble probe kan het blokkeren met 0,1% Sudan Black B voorafgaand aan de montage de achtergrond auto fluorescentie die inherent is aan het weefsel20verminderen.
- Bereiding van reagentia en afzuig afzuigkap
- Reinig een lege rook afzuigkap (of een passend ingerichte bioveiligheidskast) met 70% ethanol.
- Bereid de hybridisatie buffer uit 0,9 M natriumchloride (NaCl), 20 mM tris-HCl (pH 7,2), 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) in 10 mL steriel gefilterd water.
Opmerking: Steriel gefilterd water kan worden bereid door geautoclaveerd gedestilleerd water door te geven via een filter van 0,22 μM. De hybridisatie buffer kan bij kamertemperatuur worden bewaard, maar het VIB kan van oplossing neerslaan. Als SDS precipiteert, Verwarm de oplossing in een waterbad van 50 °C vóór gebruik. - Bereid ten minste 100 mL van 95% en 90% ethanol in steriel gefilterd water in gewassen, geautoclaveerd flessen.
- Los fluorescentend gelabelde gelyofiliseerde sondes op in 10 mM tris-HCl (pH 8,0) en 1 mM-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)-buffer (TE), bereid in een filter gesteriliseerd Nuclease vrij water tot een eindconcentratie van 100 μM. Bereid een verdunning van 1 μM in TE buffer voor gebruik in dit protocol. Bewaar zowel 100 μM geconcentreerde kolf en 1 μM voorraad gereconstitueerde sondes bij-20 °C beschermd tegen licht.
Opmerking: Geen fluorescentend gelabelde sondes in water oplossen. Buffering is vereist om hydrolyse van de NHS-Ester binding te voorkomen die de de aan de nucleotide-sonde conjugeren. - Reinig vijf coplin potten met 70% ethanol, laat drogen, label als volgt: xylenen I, xylenen II, 95% EtOH, 90% EtOH, DDH2O, en vul met 100 ml van de juiste oplossing. Dit helpt verwarring in latere stappen te voorkomen.
- Weefsel de-paraffinisatie en rehydratatie
- Plaats in de afzuigkap twee dia's per biopsie in een verticaal schuif rek.
- Plaats een verticaal schuif rek in de xylenen I coplin jar (bevattende 100 ml xylenen) gedurende 10 min.
- Verwijder het schuif rek van xylenen I en DEP de onderkant op een papieren handdoek om overtollige xylenen te verwijderen. Plaats de coplin jar van xylenen II gedurende 10 min.
Opmerking: Werk nooit met xylenen buiten een gecertificeerde rook afzuigkap. - Rehydraat gedeparaffiniseerde weefsel secties in opeenvolgende ethanol spoelingen (95% en 90%) voor 10 min elk in de respectievelijk gelabelde Coplin potten.
Opmerking: Tijdens deze fase is een warme hybridisatie buffer tot 50-56 °C in een waterbad - Verwijder de Slide rack van de 90% ethanol Wash, DEP de bodem op papieren handdoeken om overtollige ethanol te verwijderen en plaats in de ddH2o coplin jar met 100 ml filter-gesteriliseerde DDH2o gedurende 10 min.
- Tijdens het wachten op de ddH2O Wash verdunt u de voelers tot 10 nm in hybridisatie buffer om de kleurings oplossing te creëren. Bereid 150 μL kleurings oplossing per dia voor.
Opmerking: Bescherm de kleur oplossing tegen licht door de buizen in aluminiumfolie te wikkelen en in een lade op te slaan. Overweeg bij het werken met fluorescently gelabelde sondes op de Benchtop het uitschakelen van overhead lampen wanneer dat mogelijk is. Sondes verdund in hybridisatie buffer mogen niet opnieuw worden gebruikt.
- Hybridisatie en tegen kleuring
- Bereid een bevochtigend kamer voor elke sonde door het plaatsen van geweekte, verkruimelde Kimwipe en steriel water naar het reservoir van een P1000 Tip doos. Plaats de cartridge voor de tip-houder op de Top-dit is waar de dia's zullen zitten.
Opmerking: Het is belangrijk om een bevochtigende kamer te gebruiken om te voorkomen dat de biopsie secties uitdrogen tijdens hybridisatie. Er dient te worden opgemerkt dat in de handel verkrijgbare luchtbevochtiger kamers ontworpen zijn om een stabiele, vochtige atmosfeer te behouden. De hier beschreven techniek regelt de luchtvochtigheid echter voldoende tegen aanzienlijk minder kosten. - Verwijder de dia's uit het schuif rooster en plaats deze op een nieuwe papieren handdoek (aan de zijkant van de tissue). Gebruik een Kimwipe om de glijbaan te drogen. Wees voorzichtig om alleen zachtjes te deppen in de buurt (niet aan) de biopsie sectie om water weg te geven. Trek met behulp van een hydrofobe pen een rand rond de biopsie sectie en plaats het schuif weefsel zijde omhoog in de bevochtigend kamer.
Opmerking: Werk snel zodat de weefsels niet uitdrogen voor hybridisatie. - Plaats de bevochtigend kamer in een incubator die is ingesteld op 50 °C. Pipetteer 50-150 μL van de kleurings oplossing direct bovenop het weefsel, zodat de rechthoek die door de hydrofobe rand rond het weefsel wordt gemaakt, wordt gevuld. Wees voorzichtig om niet te veel oplossing toe te voegen om de hydrofobische grens te overstromen. Sluit het vak voorzichtig.
- Inincuberen 's nachts (~ 16 h) bij 50 °C in het donker. Als de incubator een venster heeft, bedek deze dan met aluminiumfolie om een donkere omgeving te creëren.
Opmerking: Voor een betrouwbaar signaal is een hybridisatie temperatuur onder de smelttemperatuur van de VISSONDE vereist. 50 °C is de optimale temperatuur voor de universele 16S rRNA sonde, maar is mogelijk niet optimaal voor andere sondes. - Bereid de volgende ochtend ten minste 500 mL Wasbuffer uit 0,9 M NaCl, 20 mM tris-HCl (pH 7,2) in ddH2O en filtreer in een steriele fles met een vacuüm fles-top filter. Warm tot 50-56 °C in een waterbad.
- Verwijder de glaasjes uit de bevochtigend kamers en trek de overgebleven hybridisatieoplossing met een Kimwipe voorzichtig weg. Plaats de dia's in een verticaal kleurrek.
- Plaats het kleurenrek in een ondoorzichtige Coplin-pot met 100 mL voorverwarmde Wasbuffer gedurende 10 minuten. Als de Coplin-potten niet dekkend zijn (bijvoorbeeld glas), plaats ze dan in het donker tijdens incubatie stappen — misschien onder een doos of in een lade.
- Herhaal de Wash stap tweemaal met verse wasbuffer in nieuwe Coplin potten.
- Bereid tijdens de wasstappen de tegen vlek door een 100 μg/mL stamoplossing van Hoechst 33342 1:1000 in de wasbuffer te verdunen. Voeg aan dezelfde buis Alexa-555 tarwekiemen agglutinines (WGA) toe aan een uiteindelijke concentratie van 5μg/mL en Alexa-555 Phalloidin tot een eindconcentratie van 33 nM. Bewaren in het donker tot het klaar is voor gebruik.
Opmerking: Hoechst, Alexa-555 WGA, en Alexa-555 Phalloidin label DNA, mucin/uroplakins, en actin, respectievelijk en kunnen op lange termijn in het donker worden opgeslagen volgens de instructies van de fabrikant. Fluorescerende labels die worden gebruikt voor sondes en tegen vlekken kunnen worden aangepast voor de filter sets die beschikbaar zijn voor de te gebruiken Microscoop. - Verwijder de dia's van de laatste Wash en trek de overtollige reinigings buffer voorzichtig weg met een Kimwipe. Plaats het weefsel zijde op een papieren handdoek en voeg 50-150 μL contra vlek direct bovenop het weefsel toe, zodat de hydrofobische rand gevuld is, maar niet overstroomt. Bedek maximaal vier dia's met een cryobox-top en incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de zijkanten terug in het kleurenrek en spoel twee keer meer in Coplin potten met verse wasbuffer, gedurende 10 min elk.
- Droog de glaasjes na de laatste wasbeurt grondig af en plaats de tissue zijde op een papieren handdoek onder een cryobox-top. Knijp één druppel bevestigings media direct bovenop het weefsel. Plaats een passend afdekblad voorzichtig (zal afhangen van de grootte van de biopsie) bovenop. Druk voorzichtig alle bubbels uit omdat ze de beeldvorming verstoren en laat de afdekkap dia's 's nachts in het donker genezen.
- De volgende dag, verzegelen de randen van de afdek mantel op de glijbaan met een lichte vacht van blanke nagellak. Laat 10 minuten drogen in het donker en bewaar vervolgens in het donker bij 4 °C voor confocale microscopie.
- Bereid een bevochtigend kamer voor elke sonde door het plaatsen van geweekte, verkruimelde Kimwipe en steriel water naar het reservoir van een P1000 Tip doos. Plaats de cartridge voor de tip-houder op de Top-dit is waar de dia's zullen zitten.
3. visualisatie van 16S rRNA vis door confocale microscopie
Opmerking: Voor dit protocol worden de beste resultaten behaald met een laserscannende confocale Microscoop met 63x en 100x doelstellingen. Juiste filter sets voor visualisatie van Hoechst, Alexa-488 en Alexa-555 fluorescentie zijn vereist. Standaard fluorescerende microscopie kan echter worden gebruikt als een confocale Microscoop niet beschikbaar is. Dit protocol is voor een laser scanning confocale Microscoop.
- Schakel de confocale Microscoop en de computer software in verband met de Microscoop per fabrikant instructies.
- Laad de glijbaan en visualiseer met de 10x doelstelling in het blauwe (DAPI/Hoechst) kanaal. Focus voorzichtig totdat de kernen zichtbaar zijn.
- Eenmaal gefocust, verander het doel naar een hoge vergroting (63x of 100x). Voeg olie toe bovenop de Afdekstrook. Herconcentreer u op de nieuwe doelstelling en zorg ervoor dat de objectief lens in contact komt met olie terwijl u zich concentreert.
Opmerking: Gebruik alleen fijne scherpstelling bij hoge vergroting (63x of 100x). Olie mag alleen worden gebruikt voor een olie doelstelling. - Evalueer snel elke dia door het oogstuk in het groene (eGFP/Alexa-488) kanaal om te bepalen welke dia's vis-positief zijn en welke vis negatief zijn.
Opmerking: Het is het beste als deze initiële beoordeling/scoring wordt gedaan verblind door een afzonderlijke persoon om experimentele bias te verminderen. - Om de gekleurde biopsieën te beelden, beginnen met een vis positieve dia en overschakelen naar de computer visualisatie modus. Selecteer de 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555) kanalen. Stel de pinhole in met behulp van het langste golflengte kanaal, in dit geval 555. Zoek het juiste brandpuntsvlak voor visualisatie van gelabelde bacteriën in het 488-kanaal. Zonder het brandvlak te veranderen, stelt u de versterking, het Laser vermogen en de offset voor elk kanaal zodanig in dat het signaal niet verzadigd is en dat de achtergrond niet te zeer wordt gecorrigeerd. Verkrijg de afbeelding in alle drie de kanalen.
Opmerking: Gebruik dezelfde instellingen voor het 488-kanaal om elke dia in een experiment te kunnen afbeelen. Het Laser vermogen kan aanpassing vereisen in de 405-en 555-kanalen als het optimale brandpuntsvlak voor bacteriële visualisatie tussen velden verandert. - Herhaal deze extra velden tot u afbeeldingen van het gehele epitheeloppervlak verkrijgt.
Opmerking: Het kan zijn dat u het brandvlak enigszins moet wijzigen om gelabelde bacteriën in verschillende velden te visualiseren, maar verander nooit de versterking, het Laser vermogen of de offset voor het 488-kanaal tussen velden. Bij het werken op een confocale Microscoop kan het informatief zijn om een Z-stack vast te leggen, zodat de driedimensionale lokalisatie van de bacteriën in het weefsel kan worden geanalyseerd. - Verwerken van beelden en kwantificeren gelabelde bacteriën binnen of geassocieerd met het weefsel met behulp van ImageJ of soortgelijke software. Minimale verwerking van de beelden wordt aanbevolen (bijv. splitsen/samenvoegen van kanalen en omzetten in beeldbestanden), hoewel achtergrondcorrectie kan worden uitgevoerd indien nodig. Alle correcties of andere wijzigingen moeten consistent blijven tussen de afbeeldingen.
Representative Results
Het protocol is geoptimaliseerd voor de onbevooroordeelde detectie van bacteriën in verband met het blaas slijmvlies in paraffine-ingesloten blaas biopsie secties. Figuur 1 toont representatieve confocale micro foto's van een experiment met behulp van dit protocol op secties van blaas biopsieën verkregen van vrouwen met recidiverende urineweginfectie. Twee seriële secties werden gehybridiseerd met ofwel de universele 16S rRNA (bovenste panelen) of Scramble (onderste panelen) sondes. Beelden uit dezelfde regio van het weefsel werden genomen en bacteriën (groen) zijn duidelijk zichtbaar in het weefsel gehybridiseerd met de 16S rRNA sondes en niet met de Scramble probe. Figuur 2 geeft een vals positief resultaat. Signaal dat overeenkomt met autofluorescerende collageen of elastine wordt gedetecteerd in de 405 en 488 kanalen in zowel de 16S rRNA en Scramble probe-hybridiseerde biopsie secties benadrukken het belang van altijd het gebruik van een scramble probe Control.
| Sonde | Volgorde | Tm | De | Koppeling |
| Universeel 16S rRNA | 5 '-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3 ' |
54,9 | Alexa-488 (5 ' en 3 ') | NHS-Ester |
| Scramble | 5 '-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3 ' |
NA | Alexa-488 (5 ' en 3 ') | NHS-Ester |
Tabel 1: vissen sonde sequenties en kenmerken. TM geeft smelttemperatuur aan en NHS is een afkorting voor N-hydroxysuccinimide.
Figuur 1: representatieve confocale micro foto's van vis van universele 16s rRNA en Scramble probe in een menselijke blaas biopsie. Actin en mucin zijn gelabeld in het rood, cellulaire kernen zijn gelabeld in blauw, en bacteriën in het groen. Weefsel-geassocieerde bacteriën worden alleen gedetecteerd met de 16SrRNA-sonde en niet de Scramble. Beelden genomen bij 63x vergroting. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve confocale micro grafieken van vals-positieve groene autofluorescentie in een humane blaas biopsie. Actin en mucine zijn gelabeld in het rood, cellulaire kernen zijn gelabeld in blauw, en bacteriën en auto-fluorescerende componenten van de extracellulaire matrix (bijvoorbeeld collageen en elastine) zijn groen. Groene fluorescentie wordt waargenomen met zowel de 16S rRNA en Scramble probes die duiden op een vals-positief resultaat. Beelden worden genomen bij 63x vergroting. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor de detectie van weefsel-geassocieerde bacteriën in menselijke blaas biopsieën door 16s rRNA FLSH. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor biopsieën uit andere weefsels, zoals het maagdarmkanaal of de huid, en kan worden uitgebreid tot weefsels die zijn geoogst uit verschillende model organismen van zoogdieren. Het hier beschreven protocol kan ook worden aangepast voor het gebruik van meervoudige fixatie (bv. formaline, ethanol, methacarn) en weefsel bereidingstechnieken (bijv. paraffine of hars ingebed, en cryopreserved weefsels). De dubbel gelabelde universele 16S rRNA sonde zorgt voor de onbevooroordeelde detectie van alle bacteriesoorten aanwezig in weefsel en kan waardevol inzicht geven in hoe pathogenen en de microbiota ruimtelijk omgaan met mucosale oppervlakken bij ziekte en gezonde Staten. Met behulp van bronnen zoals probeBase, PhylOPDb of de PROBE_DESIGN tool van het ARB softwarepakket voor de selectie of het ontwerp van soorten of genera-specifieke 16S of 23S rRNA sondes, kan dit protocol worden aangepast voor de detectie van specifieke bacteriesoorten of-geslachten binnen weefsel15,21,22. Een belangrijke toekomstige richting voor deze methode is multiplexing met behulp van soorten-of genera-specifieke sondes gelabeld met verschillende, discrete fluor Foren voor de evaluatie van microbiële diversiteit binnen de blaas mucosa.
De primaire beperking van deze methode voor gebruik op menselijke specimens is de beschikbaarheid van biopsied weefsel. Goedkeuring van de institutionele beoordelings Raad en geïnformeerde toestemming van de patiënt zijn vereist voor het verkrijgen van biopsieën en directe samenwerking met de clinicus die de procedure uitvoert is noodzakelijk voor een optimale monsterafname en toegang tot patiënt metagegevens. De CEFT-procedure zelf vernietigt het blaas epitheel, zodat we biopsie van deze gebieden konden rechtvaardigen vóór de procedure. Voor dit protocol is een rook afzuigkap of een passend ingerichte bioveiligheidskast vereist vanwege het gebruik van toxische xylenen in de deparaffinisatie stap en de noodzaak om gedurende de hele procedure een steriele omgeving te behouden. Voor dit protocol is een fluorescerende Microscoop, bij voorkeur confocale, met een 63x of een 100x objectief en geschikte filter sets voor visualisatie van Hoechst, Alexa-555 en Alexa-488 vereist. De representatieve resultaten afgebeeld in Figuur 1 werden gefotografeerd met behulp van een laser scanning confocale Microscoop. Vergelijkbare microscopen voor laserscannen moeten vergelijkbare afbeeldingen produceren. Dit protocol is beperkt door zijn vermogen om alleen weefsel-geassocieerde bacteriën te detecteren en niet, bijvoorbeeld, schimmels. Sondes specifiek de schimmel 18S of 28S rRNA moet worden gebruikt om schimmel pathogenen in weefsel18te identificeren.
Kritische stappen naar dit protocol omvatten het handhaven van een steriele omgeving gedurende de hele procedure en ervoor te zorgen dat het weefsel niet uitdroogt tussen hybridisatie en kleurings stappen. Als het weefsel uitdroogt tijdens de procedure, kan het signaal worden gedempt of kan het weefsel van de glijbaan vallen tijdens een wasstap. Het is ook essentieel om altijd twee seriële secties voor dit protocol te gebruiken — een voor de 16S rRNA probe en één voor de Scramble probe. Zonder deze controle kan het zeer moeilijk zijn om valse positieven te onderscheiden en kunnen de verkregen gegevens niet nuttig of informatief zijn. Als dit protocol wordt aangepast voor gebruik met een andere sonde dan de Universal 16S rRNA-sonde, moet worden gezorgd voor het selecteren van een geschikte hybridisatie temperatuur, ongeveer 5 °C lager dan de voorspelde smelttemperatuur van de sonde. Om de signaalintensiteit te behouden, mag het weefsel gedurende langere tijd niet aan licht worden blootgesteld nadat de sonde is toegevoegd en mag het niet overbelicht worden tijdens de microscopie. Ten slotte moeten tijdens de microscopie dezelfde instellingen voor het kanaal overeenkomend met de de, geconjugeerd aan de viskleuren, consistent worden gehouden tussen de experimentele (16s rRNA sonde) en de controle (Scramble probe) glaasjes. Het visualiseren van de ruimtelijke relatie van bacteriën binnen mucosale oppervlakken van patiënten afgeleide weefsels is essentieel voor het begrijpen en ontwikkelen van klinisch relevante hypotheses over de gastheer-pathogeen interacties onderliggende infectieziekte.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Kim Orth en Marcela de Souza Santos graag bedanken voor protocol advies en Amanda Arute voor technische ondersteuning. Dit werk werd deels gesteund door de Cecil H. en IDA Green Chair in Systems biologie Science in het bezit van K.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 μm syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
References
- Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
- Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
- Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
- Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
- Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
- Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
- Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
- De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
- Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
- Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
- Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
- Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).
