Summary

Utilizzo degli embrioni di pesce zebra Tg(Vtg1:mcherry) per testare gli effetti estrogenici dei composti interferenti endocrini

Published: August 08, 2020
doi:

Summary

Presente qui è un protocollo dettagliato per l’uso di embrioni di pesce zebra Tg(vtg1: mCherry) per il rilevamento di effetti estrogenici. Il protocollo riguarda la propagazione del pesce e il trattamento degli embrioni e sottolinea il rilevamento, la documentazione e la valutazione dei segnali fluorescenti indotti da composti interferenti endocrini (EDC).

Abstract

Ci sono molti composti interferenti endocrini (EDC) nell’ambiente, soprattutto sostanze estrogeniche. L’individuazione di queste sostanze è difficile a causa della loro diversità chimica; pertanto, vengono utilizzati metodi sempre più di rilevamento degli effetti, come gli organismi biomonitor/bioindicatori sensibili all’effetto estrogenico. Questi organismi di biomonitoraggio includono diversi modelli di pesce. Questo protocollo riguarda l’uso del pesce zebra Tg(vtg1: mCherry) linea transgenica come organismo di biomonitoraggio, compresa la propagazione dei pesci e il trattamento degli embrioni, con particolare attenzione al rilevamento, alla documentazione e alla valutazione dei segnali fluorescenti indotti dall’EDC. L’obiettivo del lavoro è la dimostrazione dell’uso degli embrioni di linea transgenica Tg(vtg1: mCherry) per rilevare gli effetti estrogenici. Questo lavoro documenta l’uso di embrioni transgenici di pesce zebra Tg(vtg1: mCherry) per il rilevamento di effetti estrogenici testando due sostanze estrogeniche, . Il protocollo descritto è solo una base per la progettazione di saggi; il metodo di test può essere variato in base agli endpoint di test e ai campioni. Inoltre, può essere combinato con altri metodi di analisi, facilitando così l’uso futuro della linea transgenica.

Introduction

C’è un numero significativo di composti interferenti endocrini (EDC) che sono tra le sostanze più pericolose nel nostro ambiente. Questi sono principalmente composti estrogenici che contaminano l’acqua dalle risorse naturali. La diversità chimica delle sostanze appartenenti al gruppo rende difficile la verifica della loro presenza, in quanto sono necessari diversi metodi analitici per la loro rilevazione. Sulla base della loro struttura chimica è molto difficile determinare se una sostanza è effettivamente in grado di agire come un estrogeno. Inoltre, queste sostanze non sono mai presenti in forma pura nell’ambiente, quindi i loro effetti possono essere influenzati da altri composti, troppo1. Questo problema può essere risolto con metodi di rilevamento degli effetti, come l’uso di organismi biomonitor/bioindicator che mostrano effetti estrogenici2,3,4,5.

Recentemente, una varietà di linea cellulare6 e sistemi di test a base di lievito2,3 sono stati sviluppati per rilevare gli effetti estrogenici. Tuttavia, questi sono generalmente solo in grado di rilevare il legame della sostanza al recettore estrogeno2,3. Inoltre, non sono in grado di modellare processi fisiologici complessi nell’organismo o di rilevare fasi ormone-sensibili delle fasi della vita; così, spesso portano a risultati falsi.

È noto che alcuni geni reagiscono in modo sensibile agli estrogeni negli organismi viventi7. La rilevazione di prodotti genici mediante metodi di biologia molecolare è possibile anche a livello di proteina o mRNA8,9, ma di solito comporta il sacrificio animale. Le leggi sulla protezione degli animali sono diventate più severe e vi è una crescente domanda di sistemi di prova alternativi che riducano al minimo il numero e la sofferenza degli animali utilizzati negli esperimenti o nella sostituzione del modello animale con un altro sistema modello10. Con la scoperta delle proteine fluorescenti e la creazione di linee di biomarcatori, le tecnologie transgeniche forniscono una buona alternativa11. Con queste linee, l’attivazione di un gene estrogeno-sensibile può essere testata in vivo.

Tra i vertebrati, il potenziale dei pesci nella valutazione del rischio ambientale è eccezionale. Offrono molti vantaggi rispetto ai modelli di mammiferi: essendo organismi acquatici, sono in grado di assorbire gli inquinanti attraverso tutto il loro corpo, produrre un gran numero di prole, e alcune delle loro specie sono caratterizzate da tempi di breve generazione. Il loro sistema endocrino e i processi fisiologici mostrano grandi somiglianze con altri vertebrati e anche con i mammiferi, compresi gli esseri umani12.

Diversi geni per il rilevamento degli effetti estrogenici nei pesci sono noti anche. I più importanti sono i recettori degli estrogeni aromatasi-b, choriogenin-H, e vitellogenina (vtg)7,13. Recentemente, sono state create diverse linee di biosensori che producono estrogeni anche da modelli di pesce utilizzati in laboratorio, come dal pesce zebra (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Il vantaggio principale del pesce zebra nella creazione di linee biosensori è il corpo trasparente degli embrioni e delle larve, perché il segnale fluorescente del reporter può quindi essere facilmente studiato in vivo senza sacrificare l’animale10. Oltre alla protezione degli animali, è anche una caratteristica preziosa in quanto consente di studiare la reazione dello stesso individuo in diversi momenti del trattamento18.

Questi esperimenti utilizzano una vitellogenina reporter transgenico zebrafish line15. Il costrutto transgene utilizzato per lo sviluppo di Tg(vtg1:mCherry) ha un lungo (3,4 kbp) promotore di vitellogenina-1 naturale. Il recettore degli estrogeni (ER) è una proteina potenziatore attivata dai ligando che è un rappresentante della superfamiglia di recettori steroide/nucleare. ER si lega a sequenze specifiche di DNA chiamate elementi di risposta degli estrogeni (ERE) con alta affinità e trasattiva l’espressione genica in risposta a estradiolo e altre sostanze estrogeniche, quindi più ERE nel promotore provoca una risposta più forte19. Ci sono 17 siti ERE nella regione promotrice del costrutto transgene Tg(vtg1:mCherry) e si prevede che imitano l’espressione del gene nativo vtg15. C’è un’espressione continua del segnale fluorescente nelle femmine sessualmente maturate. Tuttavia, nei maschi e nell’embrione l’espressione nel fegato è visibile solo dopo il trattamento con sostanze estrogeniche (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: segnale fluorescente rosso nel fegato del pesce zebra adulto transgenico mcherry e 5 embrioni dpf, dopo l’induzione di 17-estradiolo (E2). Nella femmina e nel maschio trattata con E2 (tempo di esposizione E2:48 ore) la forte fluorescenza del fegato è visibile anche attraverso la pelle pigmentata. Nessun segnale fluorescente è visibile nel maschio non trattato (A). Dopo l’induzione di E2 (50 g/L tempo di esposizione: 0-120 hpf), si può osservare anche un segnale fluorescente rosso nel fegato di 5 embrioni dpf, che non è visibile negli embrioni di controllo (B). Mentre il segnale fluorescente è continuamente presente nelle femmine adulte, principalmente i maschi e gli embrioni della linea sono adatti per rilevare gli effetti estrogenici. (BF: campo luminoso, mCherry: visualizzazione filtro fluorescente rosso, singole immagini semplici, barra della scala A: 5mm, barra della scala B: 250 m) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Simile alla vitellogena endogena, il reporter mCherry è espresso solo nel fegato. Poiché la vitellogenina viene prodotta solo in presenza di estrogeni, non c’è segnale fluorescente nei controlli. Poiché l’espressione è solo nel fegato, la valutazione dei risultati è molto più facile15.

La sensibilità e l’usabilità degli embrioni di questa linea sono state studiate su varie miscele composte estrogeniche e anche su campioni ambientali15,20e nella maggior parte dei casi sono state documentate relazioni dose-risposta (Figura 2). Tuttavia, nel caso di sostanze altamente tossiche, principalmente epatossiche (ad esempio, zearalenone), solo un segnale fluorescente molto debole può essere visibile nel fegato degli embrioni trattati e il segnale fluorescente massimo causato dall’interno di una gamma di concentrazione molto piccola, il che rende difficile stabilire relazioni effetto dose20.

Figure 2
Figura 2: Diagramma dose-risposta (A) e immagini fluorescenti (mCherry) del fegato (B) esposte a 17-ethynilestradiol (EE2), in 5 dpf vtg1:mCherry larve. I risultati sono espressi come densità integrata generata dalla forza del segnale e dalle dimensioni dell’area interessata (SEM, n – 60). 100% si riferisce al massimo osservato. L’intensità del segnale fluorescente è aumentata gradualmente con la concentrazione. Barra di scala 250 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ci sono diverse sostanze estrogeniche presenti nell’ambiente, ad esempio 17-estradiolo (concentrazione ambientale: 0,1–5,1 ng/L)21, 17-ethynylestradiol (concentrazione ambientale: 0,16–0,22 ,zearalenone (concentrazione ambientale: 0,095–0,22 g/L)23, bisfenolo-A (concentrazione ambientale: 0,45–17,2 mg/L)24. Durante il test di queste sostanze in forma puramente attiva con l’aiuto di embrioni transgenici mCherry, le concentrazioni di effetti più basse osservate (LOEC) per il rilevamento dei segni fluorescenti erano 100 ng/L per 17-estradiol, 1 ng/L per il trattamento 17-ethynilestradiol, 100 ng/L per zearalenone e 1 mg/L per il trattamento bisfenolo-A (96–120 hpf), che è molto vicino o all’interno della gamma di concentrazioni ambientali delle sostanze15. La linea transgenica Tg(vtg1:mCherry) può aiutare a rilevare l’estrogenità nei campioni di acque reflue dopo l’esposizione diretta. La linea è sensibile come il test estrogeno lievito comunemente usato, l’estrogeno lievito bioluminiscente (BLYES) assay15. Con l’aiuto di questa linea, gli effetti protettivi di beta-ciclodextrins contro la tossicità indotta da zearalenone sono stati confermati utilizzando miscele chimiche20.

In un recente rapporto, l’uso in vivo della linea transgenica è stato dimostrato con l’aiuto di due metaboliti estrogenici zearalenone (EA) ,25e zearalenolo . La linea di base del protocollo è appropriata per studiare gli effetti estrogenici di diversi composti o campioni ambientali sugli embrioni Tg(vtg1:mCherry).

Protocol

Il Protocollo sugli animali è stato approvato ai sensi della legge ungherese sul benessere degli animali e tutti gli studi sono stati completati prima che gli individui trattati avrebbero raggiunto la fase di alimentazione libera. 1. Raccolta e trattamento dell’embrione Mantenere il tg(vtg1:mCherry) il pesce zebra a 25,5 x 0,5 gradi centigradi, pH 7 x 0,2, la conduttività tra 525 x 50 s/m, il livello di ossigeno 80% di saturazione e 14 h di luce e 10 h ciclo scuro. <…

Representative Results

Nell’esperimento presentato in questo manoscritto, gli effetti di due sostanze estrogeniche sono stati testati a cinque concentrazioni a partire dalla fecondazione per 5 giorni sugli embrioni di pesce zebra Tg(vtg1:mCherry). Abbiamo studiato se i segnali fluorescenti apparissero nel fegato dei pesci alla fine del tempo di esposizione a causa delle sostanze e se ci fossero differenze nell’estrogenicità delle due sostanze. I risultati sono stati valutati sulla base delle immagini fluorescenti e dei valori di dens…

Discussion

L’uso di biomonitor/bioindicatori per effetti estrogenici si è diffuso in studi tossicologici. I modelli in vivo svolgono un ruolo eccezionale, perché a differenza dei test in vitro, non solo forniscono informazioni sulla risposta di una cellula o di un recettore, ma consentono anche lo studio di processi complessi nell’organismo. Diverse linee transgeniche per lo studio degli effetti estrogenici sono state prodotte da pesci zebra, uno dei quali Tg(vtg1:mCherry) è stato utilizzato per questi studi. Il metodo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dall’Ufficio nazionale per la ricerca, lo sviluppo e l’innovazione (NKFIH) del Fondo nazionale per la ricerca, lo sviluppo e l’innovazione (NKFIA); Accordo di sovvenzione: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 co-finanziato dall’Unione Europea, e il programma di eccellenza tematica NKFIH-831-10/2019 dell’Università Szent Istvàn, assegnato dal Ministero per l’Innovazione e la Tecnologia.

Materials

24 well tissue culture plate Jet Biofil TCP011024
Calcium-chloride (CaCl2) Reanal Laborvegyszer Ltd. 16383-0-27-39
GraphPad Prism 6.01 software GraphPad Software Inc.
ImageJ software National Institutes of Health, USA Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/
Leica Application Suite X calibrated software Leica Microsystems GmbH. We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests
Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera Leica Microsystems GmbH. We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests
Magnesium-sulphate (MgSO4) Reanal Laborvegyszer Ltd. 20342-0-27-38
mCherry filter Leica Microsystems GmbH.
Mehyl-cellulose Sigma Aldrich Ltd. 274429
Microloader pipette tip Eppendorf GmbH. 5242956003
Pasteur pipette VWR International LLC. 612-1684
Petri-dish Jet Biofil TCD000060
Potassium-chloride (KCl) Reanal Laborvegyszer Ltd. 18050-0-01-33
Sodium-chloride (NaCl) Reanal Laborvegyszer Ltd. 24640-0-01-38
Tricane-methanesulfonate (MS-222) Sigma Aldrich Ltd. E10521

References

  1. Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
  2. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
  3. Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
  4. Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
  5. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
  6. Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
  7. Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen – a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
  8. Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
  9. Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
  10. Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments – A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
  11. Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
  12. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
  13. Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
  14. Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
  15. Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
  16. Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
  17. Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
  18. Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
  19. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  20. Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
  21. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
  22. Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
  23. Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
  24. Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
  25. Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins’ 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
  26. Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species – an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
  29. Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
  30. Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
  31. Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
  32. Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
  33. Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).

Play Video

Cite This Article
Csenki, Z., Horváth, Á., Bock, I., Garai, E., Kerekes, F., Vásárhelyi, E., Kovács, B., Urbányi, B., Mueller, F., Bakos, K. Using Tg(Vtg1:mcherry) Zebrafish Embryos to Test the Estrogenic Effects of Endocrine Disrupting Compounds. J. Vis. Exp. (162), e60462, doi:10.3791/60462 (2020).

View Video