Summary
Ce protocole décrit comment imiter la transition de laitage au soudement in vitro à l'aide d'organoïdes intestinaux foetaux tardifs de souris cultivés pendant 30 jours.
Abstract
À la fin de la période de tétée, de nombreuses espèces de mammifères subissent des changements majeurs dans l'épithélium intestinal qui sont associés à la capacité de digérer les aliments solides. Ce processus est appelé transition de laiture au sœur et entraîne le remplacement de l'épithélium néonatal par l'épithélium adulte qui va de pair avec des ajustements métaboliques et morphologiques. Ces changements complexes de développement sont le résultat d'un programme génétique qui est intrinsèque aux cellules épithéliales intestinales mais peut, dans une certaine mesure, être modulé par des facteurs extrinsèques. La culture prolongée des cellules épithéliales intestinales primaires de souris de la période foetale en retard, récapitule la transition de lait-à-s'engraissement in vitro. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la culture intestinale d'organoïde de souris la mieux adaptée pour modéliser ce processus in vitro. Nous décrivons plusieurs essais utiles conçus pour surveiller le changement des fonctions intestinales liées à la transition de lait-à-scier au fil du temps. En outre, nous incluons un exemple d'un facteur extrinsèque qui est capable d'affecter la transition de lait-au-sœur in vivo, comme une représentation de la modulation du moment de la transition de lait à la sœur in vitro. Cette approche in vitro peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires de la transition de laitage au sœur ainsi que les modulateurs de ce processus. Fait important, en ce qui concerne l'éthique animale dans la recherche, le remplacement des modèles in vivo par ce modèle in vitro contribue au raffinement des expériences animales et peut-être à une réduction de l'utilisation des animaux pour étudier les processus de maturation intestinale.
Introduction
Chez de nombreuses espèces de mammifères, y compris les souris et les hommes, l'intestin néonatal a plusieurs caractéristiques qui sont distinctes de l'épithélium intestinal pleinement mature. Ces caractéristiques facilitent les entéroocytes néonatals pour digérer et absorber le lait, qui contient des matières grasses élevées et faibles en glucides, avec le lactose comme principal hydrate de carbone. La bordure de brosse des cellules épithéliales intestinales néonatales expriment la disaccharidase lactase-phlorizin hydrolase (Lct)1 pour digérer le lactose de disaccharide de lait. Après la période de titrage, les entéroocytes s'adaptent pour digérer les aliments solides qui sont riches en glucides complexes et faibles en gras. Ceci se manifeste par un commutateur dans l'expression de disaccharidase de bordure de brosse de la lactase à sucrase-isomaltase (Sis) et trehalase (Treh), qui peut digérer les hydrates de carbone plus complexes présents dans la nourriture solide2. Un autre commutateur métabolique est lié à la faible concentration d'arginine dans le lait. Pour prévoir le besoin de l'arginine, les entéroocytes néonatals expriment l'enzyme limitante de taux dans la biosynthèse d'arginine, synthase d'argininosuccinate-1 (Ass1), pour synthétiser l'arginine3. En revanche, les entéroocytes adultes expriment l'arginase 2 (Arg2), une enzyme capable de cataboliser l'arginine qui est abondante dans les aliments solides. En outre, l'épithélium intestinal néonatal exprime le récepteur néonatal de Fc pour des immunoglobulines (FcRn), qui traite l'absorption de l'IgG maternel du lait dans la circulation/circulation sanguine4. L'expression de FcRn diminue considérablement pendant la transition de laitage au sœur5. Chez la souris, la maturation des cellules de Paneth se produit postnatalement, coïncident avec la formation et la maturation des cryptes, et se caractérise par l'expression de peptides antimicrobiens lysosome (Lyz) et de fensins6.
Tous ces changements font partie de la transition de laiture au sœur, un processus qui se produit progressivement après la naissance à un mois d'âge chez la souris, lorsque l'épithélium intestinal atteint son état adulte mature. La transition de la succion au sœur est intrinsèquement réglementée et réglée sur le plan du développement dans le tube intestinal. Le facteur de transcription B lymphocyte-induit la protéine de maturation-1 (Blimp-1) joue un rôle clé dans ce processus intrinsèque de maturation7. Le Blimp-1 est fortement exprimé dans l'épithélium néonatal, tandis que son expression diminue et est perdue pendant la transition de laiture au sœur et peut donc servir de marqueur fiable de l'épithélium intestinal néonatal. En dépit d'être un processus intrinsèque, la transition de laitage au sœur peut être modulée par des facteurs externes. Par exemple, l'analogue synthétique du cortisol, la dexaméthasone, est connu pour accélérer la maturation intestinale in vivo8,9.
Les modèles in vitro actuels utilisés pour étudier la maturation épithéliale intestinale, y compris la transition de laiture au sœur, utilisent des lignées cellulaires épithéliales adultes et/ou des organoïdes adultes qui portent des caractéristiques de l'épithélium intestinal adulte. Nous avons récemment démontré que les cellules épithéliales intestinales primaires isolées de l'intestin foetal tardif mûrissent et récapitulent la transition de lait-à-sœur en cultivant in vitro comme organoïdes10. Nous avons en outre montré que ce processus de maturation intestinale in vitro se produit au même rythme qu'in vivo. Enfin, nous avons utilisé la dexaméthasone pour accélérer le processus de maturation de la même manière décrite pour les études in vivo.
Ici, nous énoncons un protocole précis pour l'isolement et la culture des organoïdes intestinaux foetaux tardifs de souris. Nous décrivons la manière préférée de recueillir des échantillons pour la culture et les méthodes prolongées d'organoïde pour surveiller la transition de lait-à-s'enseignant in vitro. Ce protocole peut être utilisé pour des études in vitro de maturation épithéliale intestinale et de modulateurs de ce processus et entraîne un débit plus élevé, une qualité accrue et une valeur translationnelle des données et une réduction de l'utilisation des animaux.
Protocol
Cette étude a été menée conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire établies par le Comité éthique pour l'expérimentation animale de l'Université d'Amsterdam, en pleine conformité avec la législation nationale sur la recherche animale conformément à la directive européenne 2010/63/UE pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques (ALC312).
1. Isolement des petits organoïdes intestinaux fœtaux
- Sacrifiez les fœtus E18-E20 par décapitation avec des ciseaux chirurgicaux, selon les règlements éthiques approuvés.
- Immédiatement après l'euthanasie, couper soigneusement le bas-ventre du fœtus avec des ciseaux intestinaux et enlever l'intestin entier.
REMARQUE : L'isolement doit être effectué avec des intestins entre E18 et E20 de la gestation afin d'atteindre la transition de lait-au-sœur appropriée et la maturation in vitro. - À l'adresse de deux petits forceps, étirer l'intestin. En utilisant l'estomac et l'appendice comme guides, découper la partie proximale et distale de l'intestin grêle.
REMARQUE: Si la dissection est faite avec soin, il est possible d'isoler le côlon ainsi. Découpez-le à l'aide de l'appendice comme guide (Figure 1). - Faire l'intestin ouvert longitudinalement: fixer l'intestin à l'aide d'une lame de rasoir placé dans le sens de la longueur et tirer l'intestin par des forceps coulissantes (un bras des forceps de chaque côté de la lame de rasoir) le long de la lame de rasoir. Par la suite, couper l'intestin ouvert en morceaux de 1 cm.
- Préparer deux tubes de 50 ml avec 10 ml de salin à phosphate froid (PBS). Transférer la partie proximale et distale de l'intestin grêle (et du côlon, le cas échéant) séparément dans les tubes. Gardez les tubes sur la glace tout en disséquant les intestins d'autres souris. Recueillir toutes les parties intestinales d'une portée ensemble dans le même tube.
REMARQUE : Une portée a habituellement 6-10 foetus. Les intestins de tous les fœtus doivent être combinés. Cette quantité devrait être suffisante pour produire 4-8 puits avec des organoïdes, dans une plaque de 48 puits, par partie intestinale. - Procédez avec l'isolement organoïde comme précédemment décrit11. En bref, laver les morceaux intestinaux avec du PBS glacé, incuber avec 2 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) pendant 30 minutes à 4 oC, dissocier les cryptes du tissu en lavant durement les morceaux avec du PBS froid glacé à 10 % de sérum fœtal de veau (FCS), filtrer à l'aide d'une passoire à cellules de 70 m et d'une centrifugeuse pour recueillir les cryptes à 150 x g pour 5 min à 4 oC.
- Assiette 4 à 8 puits avec des cryptes en gel de matrice extracellulaire, selon la taille des granulés, dans une plaque chaude de 48 puits. Utilisez 20 L de cryptes suspendues dans un gel de matrice extracellulaire par puits. Laisser le gel de matrice extracellulaire se solidifier dans un incubateur de 37 oC pendant 10 min.
REMARQUE : Considérant que seulement 40% à 50% des cryptes isolées forment des organoïdes, viser une densité de 250 à 300 organoïdes par puits. D'abord ajouter moins de gel de matrice extracellulaire que nécessaire. Regardez sous le microscope après avoir plaqué le premier puits pour analyser si la densité des cryptes isolées est idéale. Si nécessaire, ajouter plus de gel de matrice extracellulaire. - Entre-temps, préparez le milieu ENR : 14 mL d'acide F-12 (DMEM/F12) de Advanced Dulbecco(DMEM/F12) 1:1 (complété par 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 1x, L-glutamine 0,01 M et 0,2U/mL de pénicilline/streptomycine), 4 mL de support conditionné par Noggin, 2 mL de support conditionné par Les Rpondin, 400 oL de supplément B27 1x, 200 l de supplément N2 1x, 50 oL de 1,25 mM n-Acetylcysteine, 20 oL de 0,05 g/mL Facteur de croissance épidermique (EGF).
REMARQUE : Lors de la culture des organoïdes du côlon, complétez avec 50% de wnt conditionné les médias. - Ajouter 250 l de milieu ENR par puits.
2. La culture d'organoïdes fœtaux
- Changer le milieu des cultures 3 fois par semaine. La maturation des organoïdes est réalisée après 1 mois de culture.
- Au jour 3 après chaque passage, comptez le nombre de sphéroïdes et d'organoïdes à l'aide d'un microscope optique. Quantifier au moins 3 puits par condition et tous les organoïdes présents dans chaque puits.
REMARQUE : Le nombre de sphéroïdes diminue avec le temps, tandis que le nombre d'organoïdes augmente (figure 2). - Passer les organoïdes une fois par semaine par dissociation mécanique comme décrit ci-dessous.
- Retirer le milieu et ajouter 1 ml de DMEM avancé/F12 1:1 à froid. Recueillir tous les gels de matrice extracellulaire avec des organoïdes dans un tube de 15 ml. Utilisez une pointe de 200 l sur une pointe de filtre de 1000 l et une pipette de haut en bas 20 fois pour perturber les organoïdes.
- Centrifugeuse à 150 x g pendant 5 min à 4 oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 20 L de gel de matrice extracellulaire par puits. Habituellement, les organoïdes foetaux peuvent être étendus dans un rapport de 1:2.
- Laisser le gel de matrice extracellulaire se solidifier pendant 5-10 min. Ajouter 250 'L de milieu ENR par puits.
3. Analyse de maturation au niveau de l'ARN et des protéines
- Analyser la culture tous les 3 jours après chaque passage, pendant une période de 1 mois (c.-à-d. le temps pendant lequel la maturation complète est réalisée) (Figure 3).
REMARQUE : La culture organoïde fœtale est dynamique (film 1) et pour éviter toute variation de la régénération normale des organoïdes après une interruption mécanique, il est nécessaire de toujours prélever des échantillons le jour suivant le passage. -
Isolement de l'ARN
- Recueillir 3 puits d'organoïdes à l'aide de 200 l de tampon de lyse d'ARN pour chaque puits complété par 2 l de mercaptoéthanol. Après avoir ajouté le tampon de lyse d'ARN MD-mercaptoéthanol au puits, assurez-vous que tout gel de matrice extracellulaire avec des organoïdes est transféré dans un tube de 1,5 mL sans RNase.
- Vortex vigoureusement et conserver à -80 oC pendant pas plus d'un mois. Isolez l'ARN à l'aide de kits de colonnede de silice disponibles dans le commerce.
- Pour augmenter la qualité de l'ARN, après le lavage des étapes ajouter 500 L de 80% EtOH et mélanger délicatement en inversant la colonne. Centrifugeuse pendant 2 min à 11 000 x g pour sécher complètement la colonne.
REMARQUE: Assurez-vous de laver l'intérieur du couvercle du tube avec le 80% EtOH en faisant glisser le tube à l'envers trois à cinq fois pour se débarrasser de toutes les traces de guanidine thiocyanate. - Pour augmenter le rendement de l'ARN, attendre 1-2 min après l'application de l'eau sans RNase avant la centrifugeuse. Re-elute ARN en appliquant le premier flux à travers éluder à la colonne une deuxième fois.
REMARQUE : La qualité de l'ARN isolé est suffisante pour être utilisée dans l'analyse de l'expression à l'échelle du génome. Vérifiez si le numéro d'intégrité de l'ARN est supérieur à 8.
-
Isolement des protéines
- Recueillir 5 puits d'organoïdes à l'aide de 250 l de solution de récupération des cellules glacées dans un tube de 15 ml. Incuber au moins 30 minutes sur de la glace pour dissoudre le gel de matrice extracellulaire (ce qui réduira la contribution des protéines du gel de matrice extracellulaire).
- Laver avec du PBS glacé. Ajouter 250 l de tampon de lyse cellulaire et conserver à -80 oC.
REMARQUE : Après la sonication, des échantillons peuvent être utilisés pour détecter l'activité enzymatique ou pour les blots occidentaux.
-
Immunomarquage
- Recueillir 2 puits d'organoïdes à l'aide de 250 l de solution de récupération des cellules glacées dans un tube de 15 ml. Incuber au moins 30 minutes sur de la glace pour dissoudre le gel de matrice extracellulaire (ce qui réduira le fond de coloration). Laver avec du PBS glacé.
- Fixer les organoïdes à l'aide de 500 oL de 4 % de paraformaldegyde (PFA) pendant 1 h à 4 oC. Laver avec du PBS glacé. Procéder à l'immunofluorescence des organoïdes entiers ou à l'intégration de paraffine, selon les protocoles publiés12.
REMARQUE : Utilisez une pipette Pasteur en plastique pour manipuler les organoïdes. Cela permettra d'éviter des perturbations de sa structure.
4. Effet du facteur extrinsèque (dexaméthasone à titre d'exemple) sur le processus de maturation des organoïdes
- Le premier jour de la culture, ajouter 0,01M dexaméthasone aux organoïdes. Incuber les organoïdes avec dexaméthasone pendant tout le mois de culture en ajoutant de nouvelles dexaméthasone chaque fois que le milieu est changé.
- Analyse de l'expression génique
- Isolez l'ARN tel que décrit ci-dessus. Synthétiser, en même temps, l'ADNc de tous les échantillons à comparer (traités et non traités). Procédez avec la méthode qRTPCR préférée.
- Utilisez GeNorm pour identifier les deux gènes de référence les plus stables chaque fois qu'un nouveau traitement est utilisé sur les organoïdes fœtaux. Utilisez la moyenne géométrique des deux gènes de référence choisis pour les calculs d'expression relative.
REMARQUE : Suggestions de gènes de référence à tester pour les organoïdes foetaux de souris : Cyclophilin, Gapdh, 'actin, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib et Tbp. - Pour étudier comment un certain facteur extrinsèque affecte la maturation fœtale postnatale de souris, tous les gènes suivants devraient être évalués.
- Vérifiez si les marqueurs fœtaux lactase (Lct), argininosuccinate synthase 1 (Ass1), B lymphocyte-induit e maturation protéine 1 (Blimp-1) et récepteur néonatal Fc (FcRn) diminution de l'expression au cours des deux premières semaines de la culture et sont absents pour le temps de culture restant (Figure 4C). Analyser si ce modèle est modifié.
- Vérifiez si les marqueurs adultes sucrase-isomaltase (Sis), arginase 2 (Arg2), trehalase (Treh) et lysozyme (Lyz) augmentation de l'expression après deux semaines de culture (Figure 4D). Analyser si ce modèle est modifié par le facteur externe.
REMARQUE : La dexaméthasone est un facteur externe qui peut accélérer la maturation des organoïdes fœtaux et peut être utilisé comme un contrôle positif dans toutes les expériences visant à tester d'autres facteurs extrinsèques.
- Analyse de l'activité enzymatique
- Isoler les protéines telles que décrites ci-dessus. Détecter l'activité des disaccharidases intestinales selon les protocoles publiés par Dahlqvist et Messer13,14.
- Préparer 0,625 M de pH 6.0 mal-tampon maléfique (conserver pendant 3 mois à 4 oC). À l'aide de ce tampon, préparer 0,05 M de lactose (ajouter du p-hydroxymercuribenzoate de sodium comme stabilisateur pour inhiber l'activité lysosomal de p-galactosidase); 0,05 M de maltose; 0,05 M de saccharose et 0,05 M de tréhalose.
REMARQUE : Toutes ces solutions peuvent être conservées pendant 5 jours à 4 oC. Restez sur la glace pendant la préparation de l'assidu. - Préparer les normes d'test en diluant la solution de glucose de 5,56 M avec de l'eau ultrapure pour obtenir des solutions avec les concentrations suivantes : 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 M et 0,025 M.
REMARQUE : solution stable pendant au moins 3 mois à 4 oC. - Incuber dans une assiette de 96 puits pendant 60 min à 37 oC :
- 30 l de lysate organoïde avec 30 l de lactose
- 30 l de lysate organoïde avec 30 l de saccharose
- 30 l de lysate organoïde dix fois dilué avec 30 l de maltose
- 30 l de lysate organoïde cinq fois dilué avec 30 l de trehalase
- 30 L de lysate organoïde non dilué avec 30 l d'acide mâle, comme fond d'échantillon
- 30 L de chaque norme de glucose
- 30 l d'eau ultrapure, aussi vide
- 30 L de contrôle positif (optimiser la dilution; le tissu intestinal foetal lysé peut être utilisé comme contrôle de l'activité de la lactase tandis que le tissu intestinal adulte lysé peut être utilisé comme contrôle pour le sucrase, le maltase et le trehalase)
REMARQUE : La dilution des échantillons doit être faite avec le tampon de lyse cellulaire. Conservez les échantillons et la plaque sur la glace pendant la préparation de l'analyse. - Pour déterminer la quantité de glucose produite par les enzymes présentes dans le lysate organoïde après l'incubation avec leurs substrats respectifs, ajouter rapidement 200 OL de solution de couleur PGO et mesurer l'absorption à 450 nm toutes les 5 min pendant 30 min à 37 oC.
REMARQUE : Faites frais la solution couleur PGO. Utilisez 10 U/mL glucose-oxidase, 2 U/mL peroxidase et 7,88 mmol/L o-dianisidine in 0.5mol/L Tris-HCl buffer at pH 7.0. La solution doit être à température ambiante lorsqu'elle est ajoutée à la plaque. - Calculer l'activité selon la norme de glucose et corriger la quantité totale de protéines (déterminée par l'indice d'acide bicinchoninique (BCA)). L'activité enzymatique doit être exprimée sous forme de glucose M/g de protéines-1 (figure 5B).
REMARQUE : Mesurez l'activité de l'arginase à l'aide d'un kit d'exemple d'activité d'arginase disponible dans le commerce.
Representative Results
Culture prolongée des cellules épithéliales intestinales fœtales
Le protocole pour imiter la transition de laitage au soudement in vitro dépend de la manipulation correcte des organoïdes foetaux pendant la culture prolongée. L'intestin proximal et distal isolé des fœtus de souris E18-E20 est séparé tel que présenté dans (Figure 1). Lors de l'isolement, les cellules épithéliales sont enseves dans des dômes de gel de matrice extracellulaire (Figure 2). Il faut généralement quatre passages et environ 28-30 jours de culture pour les organoïdes foetaux à maturité à l'état adulte. Pendant ce temps, les cellules à divers stades de maturation peuvent être recueillies (Figure 3).
Analyse en aval représentative de la transition de laitage au soudage in vitro
Pour confirmer que les organoïdes fœtaux isolés sont distinctement proximal ou distal, comparez le niveau d'expression des marqueurs proximal un membre de la famille de domaine coupé 2 (Onecut2) et gatA protéine de liaison 4 (Gata4) et marqueurs distal Sénimoles protéine liante d'acide gras 6 (Fabp6) et Guanylate Cyclase Activator 2A (Guca2a) entre les deux cultures proximales et distale organoïdoid (Figure 4A B). La transition de la succion au sœur in vitro peut être surveillée par deux ensembles de gènes : les marqueurs fœtaux (figure 4C) et les marqueurs adultes (figure 4D). Les marqueurs fœtaux devraient diminuer graduellement au cours de la culture, tandis que l'expression des marqueurs adultes devrait augmenter graduellement (figure 4C,D).
Utilisation du facteur extrinsèque comme modificateur de la transition de succion au soudage in vitro
Dans ce protocole, dexamethasone un glucocorticoïde synthétique, a été utilisé comme un exemple de facteur extrinsèque capable de modifier la transition de lait à s'enseiment in vitro. Les données représentatives de la figure 5 suggèrent que les effets des facteurs extrinsèques doivent être déterminés par de multiples essais, car ils ne devraient pas nécessairement être génomiques. Par exemple, dans le cas de sucrase-isomaltase, l'ARN et l'expression protéique sont induits par la dexaméthasone (figure 5A) alors que l'expression tréhalase n'est modifiée qu'au niveau des protéines. (Figure 5B).
Figure 1 : Isolement de l'intestin grêle fœtal de souris. (A) Photographie de l'intestin fœtal disséqué et étiré, y compris l'estomac, l'intestin grêle proximal et distal, l'appendice et le côlon. La ligne noire indique où l'intestin doit être coupé pour diviser l'intestin grêle proximal et distal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images microscopiques représentatives de la culture organoïde fœtale proximale et distale au jour 3, jour 17 et jour 28 de la culture. Toutes les images ont été obtenues au jour 3 après le passage et montrent la diminution du nombre d'heures supplémentaires sphéroïdes. Barre d'échelle : 500 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1 : Vidéo représentative montrant la dynamique de la culture organoïde fœtale, du jour 4 à 6 de la culture. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Figure 3 : Représentation schématique de la collection d'organoïdes pour l'analyse de la maturation intestinale au fil du temps. Les cultures organoïdes fœtales proximales et distales devraient être cultivées pendant un mois et passages chaque semaine. Les échantillons pour l'analyse de maturation doivent être collectés 3 jours après l'isolement et tous les 3 jours après chaque passage. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : QRTPCRs représentatifdes des marqueurs de maturation d'intestin dans les organoïdes foetaux proximals et distal. (A) Les marqueurs proximal Onecut2 et Gata4 sont principalement exprimés dans la culture organoïde proximale tandis que (B) marqueurs distal Fabp6 et Guca2a sont principalement exprimés dans la culture organoïde distale. (C) Marqueurs fœtaux Lct, Ass1, Blimp-1 et FcRn diminution et (D) marqueurs adultes Sis, Arg2, Treh et Lyz augmenter au fil du temps dans les deux cultures organoïdes proximale et distale. Les barres d'erreur représentent SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : La dexaméthasone de facteur externe peut moduler la maturation des organoïdes foetaux. (A) L'expression génique du marqueur fœtal Blimp-1 est diminuée au jour 12 de la culture chez les organoïdes traités à la dexaméthasone par rapport aux organoïdes témoins, tandis que l'expression génique (B) et l'activité enzymatique (C) du marqueur adulte sucrase-isomaltase (Sis) sont augmentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Ce protocole décrit la culture des organoïdes intestinaux foetaux tardifs pendant un temps prolongé pour imiter la transition de laitage au sœur in vitro. Le processus de maturation est égal au rythme in vivo et est achevé après un mois de culture. L'analyse en aval de cette culture à l'aide de techniques quantitatives d'ARN et de protéines est détaillée.
Dans ce protocole, des cellules intestinales primaires provenant d'embryons de souris E18-E20 sont utilisées. Le stade de développement des cellules primaires de souris utilisées pour générer des organoïdes pour ce protocole est particulièrement important. L'utilisation d'un stade de développement plus précoce se traduira par la génération de sphéroïdes intestinaux qui maintiennent leur expression spécifique du gène fœtal sur une période prolongée avec une transition limitée aux organoïdes adultes15,16. Seuls les sphéroïdes de stade foetal tardif sont capables de transiter vers les organoïdes adultes in vitro10. Pour maximiser la fenêtre d'opportunité en ce qui concerne l'impact des facteurs extrinsèques sur la maturation intestinale, les intestins du stade fœtal tardif sont recommandés et non les intestins des chiots nés qui ont été exposés aux microbes et au lait maternel. On rapporte que certains métabolites bactériens et composants du lait peuvent agir comme modificateurs du processus de maturation17.
Pour obtenir des quantités suffisantes de cellules pour maintenir la culture pendant un mois pour étudier toute la maturation de la naissance jusqu'à l'âge adulte, tout en recueillant les échantillons pour les analyses en aval, les intestins de 6-8 embryons devraient être utilisés comme matériau de départ. Il est préférable d'utiliser des embryons du même stade de développement pour générer la culture. Nous ne recommandons pas de mettre en commun différentes portées, car de légères différences dans le stade de développement peuvent influencer l'expression des gènes de maturation.
Le protocole décrit ici explique la génération d'organoïdes de l'intestin grêle proximal et distal pour maintenir des dispositifs développementaux de différents segments de l'intestin. Comme alternative, l'intestin entier peut être employé pour étudier la maturation globale en ce qui concerne l'expression d'augmentation/diminution des marqueurs spécifiques. Dans ce dernier cas, moins d'embryons pourraient être utilisés pour isoler les cellules intestinales pour commencer la culture.
Ce protocole est développé à l'aide de cultures organoïdes tridimensionnelles. Comme les organoïdes subissent une croissance dynamique de la culture, il est important de prélever des échantillons pour des analyses en aval en même temps après le passage. Dans ce protocole, nous avons sélectionné le jour 3 après le passage, car il représente le temps moyen entre deux fractionnements au cours de laquelle les organoïdes contiennent des bourgeons robustes et peu ou pas de mort cellulaire. Un autre point de temps après le passage peut être utilisé, mais il doit être cohérent pendant toute l'expérience. Nous ne recommandons pas la croissance des organoïdes pendant plus de 7 jours après un passage, car l'augmentation des cellules de mort dans le lumen organoïde peut affecter les résultats.
Dans nos expériences, nous avons utilisé la dexaméthasone comme un exemple d'un facteur extrinsèque qui est montré et mieux étudié dans la littérature pour accélérer la maturation intestinale in vivo9,18. Dexamethasone exerce ses effets par des voies génomiques et non génomiques. Par exemple, au niveau de la régulation génomique, on peut observer une augmentation précoce des niveaux d'ARNm Sis. Sur un niveau non-génomique, nous observons des changements dans l'activité des enzymes digestives telles que le trehalase. Les deux sont en conformité avec les aspects spécifiques décrits de la dexaméthasone sur l'activation du gène sucrase et l'effet d'activation non génomique sur les enzymes de bordure de brosse intestinale observées in vivo19. Le fait que les facteurs extrinsèques, comme les glucocorticoïdes synthétiques, peuvent moduler certains aspects de la transition de lait age par le sœur dans la culture organoïde, de la même façon que celle décrite in vivo, établit davantage les organoïdes intestinaux foetaux de souris comme modèle pour l'étude de différents types de modulateurs de maturation intestinale.
Même si la maturation morphologique de l'épithélium intestinal humain est complétée in utero au stade gestationnel de 22 semaines, la fonction de barrière intestinale mûrit jusqu'à l'enfance dans une relation étroite avec le type d'alimentation, le développement du microbiote et réponse immunitaire. En raison de la disponibilité limitée des tissus humains à ces stades de développement, la valeur translationnelle du modèle murine in vitro réside dans la possibilité d'écrans à haut débit de facteurs capables de moduler la maturation intestinale, un processus conservé parmi les mammifères de lait.
Fait important, en ce qui concerne l'éthique animale dans la recherche, ce modèle peut contribuer au perfectionnement des expériences animales puisqu'il n'inclut pas les interventions effectuées sur les animaux. Le nombre d'animaux peut être encore réduit en redessinant les questions de recherche à un ou deux moments de culture qui permettront de tester plusieurs composants au sein d'une même culture.
Disclosures
="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.
-->Les auteurs ne déclarent rien à divulguer.
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
| BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
| Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
| Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
| EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
| Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
| Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
| Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
| Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
| Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
| Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
| Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
| Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
| Millipore water | N.A. | ||
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
| n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Noggin-conditioned media | Homemade | ||
| o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
| PBS | Homemade | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
| PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
| p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
| Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
| Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Henning, S. J. Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism. American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).
- Krasinski, S. D., et al. Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats. American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).
- Hurwitz, R., Kretchmer, N. Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine. American Journal of Physiology. 251 (1), 103-110 (1986).
- Rath, T., et al. The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG. Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).
- Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine. Digestive Diseases and Sciences. 42 (5), 1062-1069 (1997).
- Bry, L., et al. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10335-10339 (1994).
- Muncan, V., et al. Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium. Nauret Communications. 2, 452 (2011).
- Beaulieu, J. F., Calvert, R. Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture. Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82 (1), 91-95 (1985).
- Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids. American Journal of Physiology. 264 (2), 306-311 (1993).
- Navis, M., et al. Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning. EMBO Reports. 20 (2), (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
- Dahlqvist, A. Assay of intestinal disaccharidases. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 44 (2), 169-172 (1984).
- Messer, M., Dahlqvist, A. A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochemistry. 14 (3), 376-392 (1966).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5 (2), 421-432 (2013).
- Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).
- Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine. Pediatric Research. 49 (6), 782-788 (2001).
- Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture. Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).
