Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het gebruik van hoge frequentie echografie om luminale diameter, puls vermeerderingssnelheid, distensibiliteit en radiale belasting op een muis model van abdominale aorta aneurysma te meten.
Abstract
Een abdominale aorta-aneurysma (AAA) wordt gedefinieerd als een gelokaliseerde verwijding van de abdominale aorta die de maximale intraluminale diameter (MILD) overschrijdt met 1,5 keer van zijn oorspronkelijke grootte. Klinische en experimentele studies hebben aangetoond dat kleine aneurysma's kunnen scheuren, terwijl een subpopulatie van grote aneurysma's stabiel kan blijven. Zo kan kennis van de structurele eigenschappen van de vaatwand, naast de meting van de intraluminale diameter van de aorta, belangrijke informatie verschaffen om de stabiliteit van de AAA te beoordelen. Aorta versteviging is onlangs naar voren gekomen als een betrouwbaar instrument om vroege veranderingen in de vaatwand te bepalen. Pulsvermeerderingssnelheid (PPV) samen met de distensibility en radiale belasting zijn zeer nuttige echografie-gebaseerde methoden die relevant zijn voor de beoordeling van aortastijfheid. Het primaire doel van dit protocol is om een uitgebreide techniek voor het gebruik van echografie systeem om beelden te verwerven en analyseren van de structurele en functionele eigenschappen van de aorta zoals bepaald door MILD, PPV, distensibility en radiale stam.
Introduction
Een abdominale aorta-aneurysma (AAA) vertegenwoordigt een significante hart-en vaatziekten gekenmerkt door een permanente gelokaliseerde verwijding van de aorta overschrijding van de oorspronkelijke diameter van het vat met 1,5 keer1. AAA behoort tot de top 13 oorzaken van sterfte in de Verenigde Staten2. De progressie van AAA wordt toegeschreven aan de degeneratie van de aortawand en elastine fragmentatie, wat uiteindelijk leidt tot aortabreuk. Deze veranderingen in de aortawand kunnen optreden zonder een significante toename van de maximale intraluminale diameter (MILD), wat erop wijst dat MILD alleen niet voldoende is om de ernst van de ziekte te voorspellen3. Daarom moeten aanvullende factoren worden geïdentificeerd om de eerste veranderingen in de aortawand te detecteren, wat de opties voor vroegtijdige behandeling kan leiden. Het algemene doel van dit protocol is om een praktische handleiding te bieden voor het beoordelen van aortafunctionele eigenschappen met behulp van echografie zoals gekenmerkt door metingen van de pulsvermeerderingssnelheid (PPV), distensibility en radiale belasting.
Een goed gekarakteriseerd experimenteel model om AAA te bestuderen, voor het eerst beschreven door Daugherty en collega's, omvat onderhuidse infusie van angiotensine II (AngII) via osmotische pompen in Apoe-/- muizen4. Nauwkeurige meting van MILD met behulp van echografie is instrumenteel geweest bij het karakteriseren van AAA in dit muismodel5. Hoewel histologische veranderingen tijdens de ontwikkeling van AAA uitgebreid zijn bestudeerd, zijn veranderingen in de functionele eigenschappen van de vaatwand zoals aortastijfheid niet goed gekarakteriseerd. Dit protocol benadrukt het gebruik van hoogfrequente echografie in combinatie met de geavanceerde analyses als krachtige instrumenten voor het bestuderen van de temporele progressie van AAA. Met name deze benaderingen stellen ons in staat om de functionele eigenschappen van de vaatwand te beoordelen, gemeten door PPV, distensibility en radiale belasting.
Recente klinische studies bij proefpersonen met AAA, evenals in het door murine elastase geïnduceerde AAA-model, wijzen op een positieve correlatie tussen aortastijfheid en aortadiameter6,7. PPV, een indicator van aortastijfheid, wordt aanvaard als een uitstekende meting voor het kwantificeren van veranderingen in stijfheid in vaatwand6,8. PPV wordt berekend door de transittijd van de pulsgolfvorm te meten op twee plaatsen langs de vasculatuur, waardoor een regionale beoordeling van aortastijfheid wordt gegeven. We hebben onlangs aangetoond dat verhoogde aortastijfheid zoals gemeten door PPV, en op cellulair niveau zoals bepaald met behulp van atoomkracht microscopie, positief correleert met aneurysma ontwikkeling9. Verder suggereert de literatuur dat aortastijfheid kan voorafgaan aan aneurysmale dilatatie en dus nuttige informatie kan geven over regionale intrinsieke eigenschappen van de vaatwand tijdens de ontwikkeling van AAA10. Op dezelfde manier zijn distensibility- en stammetingen de kwantificeringsinstrumenten om eerdere veranderingen in arteriële fitness te meten. Gezonde slagaders zijn flexibel en elastisch, terwijl met verhoogde stijfheid en minder elasticiteit, distensibility en spanning wordt verminderd. Hier bieden we een praktische gids en stap voor stap protocol voor het gebruik van een hoogfrequent echografisch systeem om MILD, PPV, distensibility en radiale belasting bij muizen te meten. Het protocol biedt technische benaderingen die moeten worden gebruikt in combinatie met de basisinformatie die door handleidingen voor specifieke echografie-instrumenten en de bijbehorende video tutorial. Belangrijk is dat in onze handen het beschreven beeldvormingsprotocol reproduceerbare en nauwkeurige gegevens biedt die waardevol lijken in de studie van de ontwikkeling en progressie van experimentele AAA.
Om het nut van echografie verder aan te tonen, bieden we voorbeeldbeelden en metingen uit onze eigen studies gericht op het gebruik van farmacologische benaderingen voor het voorkomen van experimentele AAA11. Specifiek, inkeping signalering is voorgesteld om betrokken te zijn bij meerdere aspecten van vasculaire ontwikkeling en ontsteking12. Met behulp van genhaploinsiënsiciëntie en farmacologische benaderingen hebben we eerder aangetoond dat Notch-remming de ontwikkeling van AAA bij muizen vermindert door infiltratie van macrofagen op de plaats van vasculaire schade13,14,15te voorkomen. Voor het huidige artikel, met behulp van de farmacologische benadering voor Notch remming richten we ons op de relatie tussen aortastijfheid en factoren met betrekking tot AAA. Deze studies illustreren dat Notch remming vermindert aortastijfheid, dat is een maatregel van AAA progressie11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor de behandeling van muizen en echografie werd goedgekeurd door de Universiteit van Missouri Institutional Animal Care and Use Committee (dier protocol nummer 8799) en werd uitgevoerd volgens AAALAC International.
1. Uitrustingsopstelling en voorbereiding van muizen
- Installatie van apparatuur
- Zet het ultrasone instrument, ultrasone gelwarmer en het verwarmingskussen aan.
- Open het echografieprogramma en voer de studienaam en beschrijvende informatie voor elke muis in.
- Selecteer de toepassing als Algemene beeldvorming.
- Kies de juiste transducer voor buikbeeldvorming(figuur 1B,C). In dit experiment wordt MS400-transducer gebruikt.
- Zorg ervoor dat anesthesie isoflurane en zuurstofniveaus voldoende zijn voor elke experimentele sessie.
- Reinig het echografieplatform voor echografie.
- Muisvoorbereiding
- Plaats de muiskooi bovenop een verwarmingskussen (36,5 tot 38,5 °C).
- Houd de muis voorzichtig bij zijn staartbasis en plaats in de met zuurstof gevulde isofluranekamer.
- Direct de isoflurane en zuurstofstroom naar de inductiekamer.
- Zet de isoflurane vaporizer aan en stel het isofluraneniveau in op 1-2% vol/vol. Zet de zuurstoftankdruk in op 1-2 L/min.
- Na ~ 2 min, bevestig de voldoende diepte van anesthesie door de afwezigheid van ontwenningsreflexen bij het knijpen van het voetpad van de muis.
- Schakel vervolgens de toevoertak van de inductiekamer uit en zet de tak in die naar de anesthesieneuskegel is gericht.
- Breng de muis van de inductiekamer naar de echografie fase en plaats de anesthesie kegel over de neus van het dier.
- Kantel het beeldverwerkingsplatform van dieren rond 10° naar de rechterbenedenhoek voor een optimaal scannen(figuur 1B).
- Zet een druppel steriele oogheelkundige oplossing in beide ogen van muizen om te voorkomen dat drogen onder anesthesie.
- Plaats de muis in de supinepositie met zijn neus ingebracht in de anesthesiekegel.
- Breng de elektrodegel aan op alle vier de poten met behulp van een wattenstaafje en plak de poten op de koperen leads op het beeldplatform voor elektrocardiogramvoorelektrocardiogram(figuur 1C).
- Gebruik tondeuse om haar te scheren op de imaging site en breng vervolgens ontharingscrème aan om de resterende vacht te verwijderen. Laat voor minder dan 1 min.
- Veeg voorzichtig de crème en het haar af met een vochtige papieren handdoek.
- Controleer de ademhaling en zorg ervoor dat de hartslag wordt gehandhaafd tussen 450-550 slagen/min. Als onder dit niveau, verminder de isoflurane stroom en wacht tot de hartslag herstelt.
- Breng voorverwarmde ultrasone gel (37 °C) aan op de voorbereide huidplaats en bevestig de transducer aan de houder en lager totdat deze de gel raakt (figuur 1C).
2. Echografie van de abdominale aorta
- Plaats de transducer horizontaal (d.w.z. loodrecht op de middellijn van de muis).
- Maak de ultrasone gel glad en verwijder bellen met behulp van de houten stok van een wattenstaafje.
- Laat de transducer zakken en plaats 0,5 - 1 cm onder het middenrif na het aanraken van de gel. Nu beginnen met de beelden te observeren.
- Visualiseer de abdominale aorta in de korte asweergave(figuur 1C).
OPMERKING: B-modus is de standaard en meest effectieve modus om anatomisch lokaliseren van de aorta en de positie van de transducer. De abdominale aorta wordt geïdentificeerd door de aanwezigheid van pulsatiemetbehulp van kleur Doppler en power Doppler modi in de korte as (dat wil zeggen, de omtrek dwarsdoorsnede van de aorta). Pas de micromanipulators op het dierenstadium en de transducer aan om de doorsnede van de aorta naar het midden van het beeld te brengen. - Draai de transducer 90° met de klok mee en pas de x-assige micromanipulatorknop langzaam aan om de aorta in lange asweergave (lengtedeel van de aorta) te visualiseren.
OPMERKING: In veel gevallen kunnen gastro-intestinale gassen het beeld verstoren, of de aorta kan niet onder de optimale hoek zijn om een duidelijke lange asweergave mogelijk te maken. Pas de hoek van de transducer langzaam en horizontaal aan totdat een acceptabele lange asweergave is verkregen. Als er problemen aanhouden, verhoog de transducer, controleer op luchtbellen onder de transducer, pas de kantelhoek van het dierenstadium lichtjes aan, pas gels opnieuw aan en herhaal alle stappen opnieuw. - Stel de focuszone en diepte in op het gebied van de aorta met respectievelijk de focuszone en focusdiepte-schakelingen. Pas de time gain compensatie slider handmatig aan om het lumen van de aorta donkerder te maken om een optimaal contrast van de aortawand te bereiken.
- Pas de y-as manipulator aan om de vertakkingen punten van de superieure mesenterische en de juiste nierslagaders te visualiseren. Gebruik de rechter nierslagader als oriëntatiepunt om het beeld van de suprarenalaorta(Figuur 2A)vast te leggen.
- Neem minstens 100 frames van B-modus beelden op de suprarenal aorta.
- Druk op cinestore om de Afbeeldingen van de B-modus op te slaan.
- Druk op de M-modus knop op het instrumententoetsenbord om opname in de M-modus in te schakelen. Rol de cursor bal om de gele indicator lijn te brengen naar een normale aorta secties met duidelijke vaat wand beeld, of naar de secties waar maximale diameter van aneurysma wordt waargenomen.
- Druk op de SV/gate-schakelaar en pas de cursorbal aan om ervoor te zorgen dat de wanden van het schip in de meetbeugel zijn opgenomen. Druk op update om m-modus metingen op te nemen en druk op cinestore vast te leggen (Figuur 2A,B).
OPMERKING: Maximale diameter van het aneurysma mag niet in hetzelfde beeldvormingsvlak zitten als het optimale lange aszicht van de aorta. Pas de x-axis manipulatorknop iets aan voor elke M-modus meting om ervoor te zorgen dat het MILD van elke sectie wordt vastgelegd. - Als u ECG-gated Kilohertz Visualization (EKV)-afbeeldingen wilt verkrijgen, drukt u op de B-modus knop om terug te gaan naar de B-modus opname.
OPMERKING: Als de beelden niet scherp zijn, past u de x-asmanipulator aan om het scherpste beeld van de bovenste wand van het lumen over een sectielengte te bereiken (d.w.z. > 6 mm). - Druk op de knop Fysio-instellingen op het toetsenbord en selecteer Transpiratiegating. Pas de gating Delay en Window handmatig aan om de gegevens alleen op te nemen tijdens de vlakkere delen van de ademhalingsgolf. De opnamesecties worden weergegeven als gekleurde blokken op de tracering van de ademhalingsgolf.
OPMERKING: Zonder de aanpassing van de ademhaling gating, zullen de EKV beelden worden wazig als gevolg van de normale beweging van het dier tijdens de ademhaling. - Druk op de EKV-knop om de EKV-modus in te schakelen. Selecteer in het juiste menu Standaardresolutie en framesnelheid 3000 of hoger. Selecteer Doorgaan met het opnemen van EKV-afbeeldingen. Druk op cinestore om de beelden op te slaan. Gebruik ekv-modus afbeelding om metingen van de pulsvermeerderingssnelheid (PPV), distensibility en radiale belasting te verkrijgen.
OPMERKING: EKV-opname kan mislukken als er abnormale schommelingen in de ademhaling zijn, het dier te snel reaspirantis, of de instellingen voor framerates te hoog zijn. Stel in dat geval de framerate lager in en wacht tot de ademhaling van het dier stabiliseert. Het instellen van de framerate op 3000 is meestal geschikt voor zowel muizen als ratten.
3. Stappen na beeldvorming
- Veeg voorzichtig de ultrasone gel uit de buikstreek van de muis met een papieren handdoek bevochtigd met warm water.
- Plaats de muis terug in zijn huiskooi op een verwarmingskussen.
- Zet de isoflurane machine uit, maak het dierenbeeldvormingsplatform schoon en transducer met vochtige doekjes.
- Breng de beeldgegevens die tijdens de echografie worden verzameld over naar de harde schijf.
- Zet het echo-instrument uit.
- Nadat de muis herstelt van anesthesie en alert is, verwijder het verwarmingskussen en breng de kooi terug naar het dierenhuisvestingsrek.
4. Analyse van abdominale aortabeelden
- Analyse van M-modus beelden om MILD te meten
- Open het echografieprogramma en voer de studienaam en beschrijvende informatie voor elke muis in.
- Open de ultrasone gegevens in de analysesoftware en open de M-modus afbeelding en pauzeer de hartslag.
- Klik op Metingen.
- Selecteer het vasculaire pakket uit de vervolgkeuzemogelijkheden. Klik op Diepte en trek een lijn over het aortalumen dat zich uitstrekt van binnenwand tot muur(figuur 2C,D).
OPMERKING: Voor consistentie moeten de metingen worden uitgevoerd in de systolische fase van de hartcyclus wanneer de aorta maximaal wordt uitgebreid. Teken drie lijnen over drie verschillende hartslagen om nauwkeurige en gemiddelde metingen van MILD te verkrijgen. In AAA worden de metingen uitgevoerd bij de maximale dilatatie van de aorta. Het is ook raadzaam om de dieren 4-6 uur te vasten voorafgaand aan het verzamelen van beelden om interferentie van de beweeglijkheid van de darm te voorkomen en de helderheid van het beeld te garanderen.
- Analyse voor pulsvermeerderingssnelheid (PPV)
- Open de EKV-afbeelding en pauzeer de hartslag.
- Open een nieuw venster op de analysesoftware (bijvoorbeeld Vevo Vac) door op het naampictogram te klikken.
- Klik op de optie PPV (pijl in figuur 3D). Een klein venster zal verder verschijnen met het beeld van de aorta.
- Teken een rechthoekige doos door op de bovenste vaatwand te klikken en sleep de aanwijzer ongeveer 4 mm die zowel de wanden van de suprarenalaorta bedekt.
LET OP: Houd de lengte van de doos consistent (~ 4 mm) voor alle afbeeldingen. De gebruiker kan het rechthoekige vak aanpassen door te draaien om het vak uit te lijnen en de lijn te selecteren en vervolgens naar een nieuwe positie op het schip te slepen dat wordt geanalyseerd om de meest geschikte en duidelijke buiging van de pulsgolf te verkrijgen. De verticale regels van gegevens uit de rechthoek worden weergegeven en geïdentificeerd als de linker (bovenste afbeelding) en rechts (onderste afbeelding) op de ROI. Voor een betere visualisatie van de buiging van de pulsgolf is het soms nuttig om de tekendoos alleen op de bovenste wand te plaatsen, zoals weergegeven in figuur 3. De software berekent automatisch de PPV (m/s). Het is echter altijd beter om de paarse lijnen handmatig aan te passen om het exacte buigpunt op de pulsgolven in te stellen en PPV zal dienovereenkomstig veranderen. - Selecteer ten slotte de opdracht Accepteren om de PPV-waarden op te slaan. Exporteer de cijfers en de gegevens naar het station voor gegevensopslag.
- Analyse op distensibiliteit en radiale belasting
- Open de EKV-afbeelding en pauzeer de hartslag.
- Klik op het software-icoontje. De software opent een nieuw venster.
- Klik op het spoor nieuwe ROI en teken een rechthoekige doos op de beide wanden van het schip. De software traceert automatisch de boven- en onderwanden van het schip. De gebruiker kan de tracering aanpassen om op de muur uit te lijnen door op groene punten te klikken(figuur 4A,B).
- Accepteer nu het spoor. De software berekent de distensibility (1/Mpa) in de geselecteerde ROI.
- Selecteer voor de radiale belastingmeting de juiste drukoptie in de menubalken linksboven. De beelden voor radiale spanning en tangentiale belasting worden geopend.
- Verkrijg de waarde voor radiale belasting (%) door de cursor op de piek van de curve te verplaatsen. De gegevens exporteren als afbeeldingen of in videoformaat(figuur 4A,B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve M-modus beelden van de normale en aneurysmaal buikaorta van muizen worden weergegeven in figuur 2A en figuur 2B, respectievelijk. De suprarenalabdominale aorta wordt geïdentificeerd door de locatie naast de rechter nierslagader en de superieure mesenteriale slagader (Figuur 2A). Representatieve beelden die worden gebruikt voor de berekening van MILD, bij drie verschillende hartslagen van de systolische hartcyclus, in normale en aneurysmaaorta worden respectievelijk weergegeven in figuur 2C,D. In de situatie waarin een aorta-aneurysma zich heeft ontwikkeld, wordt de luminalediameter bepaald door een loodrechte gele lijn te trekken tussen de twee binnenranden van het lumen op het gebied van maximale dilatatie(figuur 2B). Drie onafhankelijke metingen worden meestal gemiddeld om een nauwkeurige intraluminale diameter te bepalen.
Representatieve EKV-beelden van de abdominale aorta die bij de analyse van PPV worden gebruikt, worden weergegeven in figuur 3. PPV wordt berekend door een rechthoekig vak te tekenen op de armatuurwand van suprarenal aorta(figuur 3E) en aanpassing van de paarse verticale lijnen van gegevens verkregen uit de rechthoekige doos (figuur 3F). De paarse lijnen moeten worden aangepast om het buigpunt van de pulsgolven in te stellen. Representatieve EKV-beelden van de abdominale aorta die geschikt zijn voor analyse van de distensibiliteit en radiale stammen worden weergegeven in figuur 4. Distensibility en radiale spanning worden berekend door het traceren van de luminaalwanden van de suprarenale aorta zoals weergegeven in figuur 4E. De waarde voor distensibility (1/MPa) wordt verkregen door de optie distensibility/elasticiteit te kiezen uit het vervolgkeuzemenu van het vak (rode pijl, figuur 4F). De radiale stam (%) wordt verkregen door de optie radiale belasting(figuur 4G)te kiezen en de cursor naar de top van de radiale stamgrafiek te verplaatsen (figuur 4H).
We hebben de betekenis van PPV in het door AngII geïnduceerde muismodel van AAA gevalideerd en verder het therapeutische potentieel van een Notch-remmer (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-(S)-fenylglycine t-butylester onderzocht; DAPT) over de progressie en stabiliteit van de reeds bestaande AAA. Specifiek, al deze aneurysma studies werden uitgevoerd op 8-10 weken oude Apoe-/- mannelijke muizen na infusie van AngII door gepubliceerde protocollen4,13. Op dag 28 van AngII infusie, muizen werden willekeurig verdeeld in twee groepen en werden toegediend voertuig of DAPT (10 mg/kg) tot offer op dag 5613. Transabdominale echografie toonde een geleidelijke toename van de MILD, PPV, en een afname van dedtensibility en radiale stam in reactie op AngII op dag 28 (Figuur 5A-E). Angii infusie marginaal verhoogd MILD van dag 28 tot 56 en DAPT niet significant veranderen MILD in vergelijking met AngII alleen(Figuur 5A en figuur 5B). PPV steeg echter geleidelijk met AngII-infusie op dag 28 tot dag 56 en DAPT daalde aanzienlijk in de stijging van PPV op dag 56 (figuur 5C). Distensibility en radiale stammen, parameters om de elasticiteit van de vaatwand te beoordelen werden verminderd met AngII-infusie, terwijl DAPT geen significant effect vertoonde (figuur 5D en 5E). Het is belangrijk te beseffen dat PWV sterk correleerde met MILD op dag 28 (R2=0,51, figuur 5F),terwijl op dag 56 de correlatie relatief zwak was (R2=0,22) (figuur 5G). Aortastijfheid in AAA wordt voornamelijk geassocieerd met veranderingen in aortawandarchitectuur. Histologisch, AngII infusie verhoogde collageen afbraak en proteolytische activiteit in de mediale laag van de aorta (Figuur 5H, bovenste rij). DAPT-behandeling minimaliseerde dergelijke veranderingen in de ECM-degradatie(figuur 5H, onderste rij).
Figuur 1: Opstelling van het instrument. (A) Totaalbeeld van de echografie machine samen met inductiekamer voor anesthesie en gel warmer. (B) Close-up weergave van het beeldplatform en het transducersysteem. (C) De weergave van de transducer plaatsing tijdens het vastleggen van korte as beeld van de abdominale aorta. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Analyse van m-modus beelden voor het verkrijgen van maximale intraluminale diameter (MILD). De M-modus beelden van normale aorta (A) en aorta met abdominale aorta aneurysma(B) van muizen worden getoond. (C) en (D), MILD getekend in de systolische fase van de hartcyclus in de suprarenalaorta van normale muizen (C) en muizen met AAA (D). Metingen bij drie verschillende hartslagen worden uitgevoerd zoals afgebeeld en de gemiddelde waarde wordt berekend. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Analyse van EKV-beelden voor het verkrijgen van de pulsvermeerderingssnelheid (PPV). EKV beelden verzameld van normale muis aorta. Analyse wordt gedaan door te klikken op metingen (A) en de software-icoon (B). Er verschijnt een nieuw venster met de pictogrammen aan de rechterkant, zoals weergegeven in C. Nu, klik op PPV(D) en nogmaals, een klein venster zal verschijnen (E). Teken een rechthoekig vak op de bovenste wand van het lumen zoals weergegeven in E en klik op accepteren. De PPV-waarde wordt verkregen zoals aangegeven in F (pijl). De paarse lijnen worden aangepast om het buigpunt van de pulsgolven(G)in te stellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Meting van de distensibiliteit en radiale belasting. EKV beelden verzameld van normale muis aorta. Analyse wordt gedaan door te klikken op metingen (A) en de software-icoon (B). Er verschijnt een nieuw venster met de pictogrammen aan de rechterkant, zoals weergegeven in C. Klik nu op trace nieuwe ROI(D),een nieuw venster zal verschijnen met sporen op de bovenste en de onderste wand van het lumen zoals weergegeven in E en klik op accepteren. De waarde voor distensibility zal worden verkregen in tabel zoals blijkt uit de F. Voor spanning, klik op spanning (G). In het venster wordt de radiale spanningswaarde weergegeven (%, groen gemarkeerd vak), terwijl de cursor op de piek van de radiale stamgrafiek(H)wordt geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: PPV correleert met structurele aortaeigenschappen in de gevestigde AAA. (A) Representatieve transabdominale echografie beelden met de MILD op dag 0, 28, 42 en 56 van de aangegeven experimentele groepen in Apoe-/- muizen. DAPT werd gestart op dag 28. Gestippelde gele lijnen schetsen het lumen. (B) Kwantificering van MILD in de aangegeven groepen (paarse en groene kleur toont AngII + voertuig en AngII + DAPT behandelde muizen respectievelijk (n =16-18). (C, D en E) PPV, distensibility en radiale spanning op verschillende dagen van AngII en DAPT behandelingen (n=8). (F en G), Grafieken met Pearson's correlatie tussen PPV en MILD op dag 28 (F) en dag 56 (G). (H) Representatieve histologische beelden voor collageenkleuring (gekleurd met trichroom en gezien als blauwe vlekken) en proteolytische activiteit door in situ zymografie met of zonder DAPT-behandeling op dag 56. Tukey meerdere vergelijkingen test werd gebruikt voor data-analyse. *P<0,05; ns = niet-significant. Schaal 50 μm in H. Dit cijfer is aangepast van Sharma et al. (2019), Scientifc Reports (SREP-19-16491B)11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Echografie biedt een krachtige techniek voor het bepalen van functionele eigenschappen van de aorta door metingen van PPV, distensibility en radiale belasting. Deze metingen zijn bijzonder leerzaam voor het bestuderen van muismodellen van AAA en de in vivo benadering maakt het mogelijk om longitudinale gegevens te verzamelen die potentieel belangrijk zijn voor het begrijpen van de temporele ontwikkeling van de aortapathologie. Met name metingen van in vivo aortastijfheid worden lokaal bepaald in de abdominale aorta door PPV, distensibility en radiale stam door het analyseren van EKV-gegevens en worden beschouwd als een onafhankelijke risicofactor voor AAA instabiliteit16. De technieken beschreven in deze protocollen zijn relatief rechttoe rechtaan en nemen slechts 8-10 min om beeldsets te verkrijgen van een muis. Alle beelden moeten bij voorkeur worden verzameld door één operator die goed gedefinieerde en consistente oriëntatiepunten gebruikt om reproduceerbare en nauwkeurige gegevens te genereren.
Er zijn potentiële factoren die technische expertise vereisen voor de toepassingen van deze tools. In de eerste plaats weerspiegelt PPV bijvoorbeeld niet alleen de mate van AAA-ontwikkeling in de lokale arteriële wand, omdat het een indirecte maatstaf is voor regionale arteriële stijfheid. Ten tweede kan het moeilijk zijn om PPV nauwkeurig te meten als de intimal wand beschadigd is. Ten derde kan het een uitdaging zijn om scherpe resolutiebeelden te verkrijgen zonder expertise in het bedienen van het instrument. Sommige van deze zorgen zijn aangepakt in recente versies van echografie systemen waar speckle ruis en artefacten worden verminderd, met behoud en verbetering van de verwerving van gegevens voor kleine dierstudies.
De focus van technieken die in het verleden werden gebruikt (Doppler, microangiografie, magnetische resonantiebeeldvorming) om aortastijfheid te bepalen, was beperkt tot tweedimensionale beelden. PPV berekend uit de echografie is in opkomst als een betrouwbare en reproduceerbare methode om aortastijfheid te bepalen en lijkt onafhankelijk te zijn van arteriële druk9,17. Het is belangrijk op te merken dat de heersende definitie van AAA met maximale diameter als standaardindex niet altijd betrouwbaar correleert met klinische waarnemingen. Bijvoorbeeld, kleine aneurysma's kunnen scheuren, terwijl sommige grote aneurysma's hebben de neiging om stabiel te blijven18,19,20. Aorta versteviging is een vroege verandering genereren aortawand stress die aneurysma-groei triggers, en remodelleren10 en is sterk gecorreleerd met Mmp2 en Mmp9 in muis modellen van AAA10. Zo kunnen functionele analyses, naast de diameter van de aorta, belangrijke informatie opleveren om de progressie en stabiliteit van AAA te beoordelen.
Aan de hand van deze protocollen hebben we het therapeutische potentieel onderzocht van een krachtige farmacologische Notch-remmer (2S-N-[(3,5-Difluorophenyl) acetyl]-L-alanyl-2-phenylglycine 1,1-dimethylethylester; DAPT) over de progressie en stabiliteit van reeds bestaande AAA met behulp van een AngII-geïnduceerde muismodel van AAA11. Transabdominale echografie toonde een geleidelijke toename van de MILD, PWV, en een afname van de distensibility en radiale stam in de Apoe-/- muizen in reactie op AngII dan controles op dag 28. Na dag 28 tot en met dag 56(figuur 5) werd geen verdere stijging van mild waargenomen. PPV steeg echter geleidelijk en was aanzienlijk hoger op dag 56 in vergelijking met dag 28. Met de remming van Notch signalering door DAPT, mild muizen was niet significant verschillend van AngII alleen op dag 56. Interessant is dat DAPT een verdere stijging van PPV voorkwam, zodat het aanzienlijk lager was dan AngII op dag 56 (figuur 5C). DAPT-behandeling had geen significant effect op de distensibiliteit of radiale belasting(figuur 5D,E). Interessant is dat PPV sterk correleerde met MILD op dag 28 (R2=0,51), terwijl op dag 56 de correlatie relatief zwak was (R2=0,22; Figuur 5F). Deze veranderingen in de aortastijfheid werden weerspiegeld in de verhoogde collageenafbraak en proteolytische activiteit met AngII en de demping door DAPT (figuur 5H). Deze voorbeeldstudie benadrukt de potentiële waarde van op echo's gebaseerde aortastijfheidsmetingen in het begrijpen van de tijds- en voorspelbaarheid van zowel AAA-progressie als stabiliteit.
Verder lijkt de echografiegebaseerde benadering waardevol bij de beoordeling van de potentiële rol voor farmacologische interventies, met name in fasen die waarschijnlijk onafhankelijk zullen zijn van veranderingen in de intra-luminaldiameter (d.w.z. regressie). Samengevat, gedetailleerd begrip en gebruik van dergelijke technologie zal profiteren bij de evaluatie van de prognose van AAA in een vroeg stadium van de ziekte voor effectieve therapeutische interventies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door R01HL124155 (CPH) en financiering van het Research Institute van de Universiteit van Missouri aan CPH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
| Apoe-/- mice | The Jackon lab |  |
|
| Clippers | WAHL | 1854 | |
| Cotton swab | Q-tips | ||
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
| Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
| Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
| Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
| Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
| Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
| Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
| Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
| Oxygen tank | Air gas | ||
| Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
| Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
| Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
| Vevo Vasc Software | Visualsonics |
References
- Wanhainen, A. How to Define an Abdominal Aortic Aneurysm — Influence on Epidemiology and Clinical Practice. Scandinavian Journal of Surgery. 97, 105-109 (2008).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics—2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137, 67 (2018).
- Xu, J., Shi, G. -P. Vascular wall extracellular matrix proteins and vascular diseases. Biochimica et biophysica acta. 1842, 2106-2119 (2014).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105, 1605-1612 (2000).
- Au - Sawada, H., et al. Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions. Journal of Visualized Experiments. , 59013 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- van Disseldorp, E. M. J., et al. Influence of limited field-of-view on wall stress analysis in abdominal aortic aneurysms. Journal of Biomechanics. 49, 2405-2412 (2016).
- Miyatani, M., et al. Pulse wave velocity for assessment of arterial stiffness among people with spinal cord injury: a pilot study. Journal of Spinal Cord Medicine. 32, 72-78 (2009).
- Sharma, N., et al. Deficiency of IL12p40 (Interleukin 12 p40) Promotes Ang II (Angiotensin II)-Induced Abdominal Aortic Aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39, 212-223 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- Sharma, N., et al. Pharmacological inhibition of Notch signaling regresses pre-established abdominal aortic aneurysm. Scientific Reports. , (2019).
- Bray, S. J. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Hans, C. P., et al. Inhibition of Notch1 signaling reduces abdominal aortic aneurysm in mice by attenuating macrophage-mediated inflammation. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 32, 3012-3023 (2012).
- Cheng, J., Koenig, S. N., Kuivaniemi, H. S., Garg, V., Hans, C. P. Pharmacological inhibitor of notch signaling stabilizes the progression of small abdominal aortic aneurysm in a mouse model. Journal of American Heart Association. 3, 001064 (2014).
- Hans, C. P., et al. Transcriptomics analysis reveals new insights into the roles of Notch1 signaling on macrophage polarization. The Journal of Immunology. 200, (2018).
- Paraskevas, K. I., et al. Evaluation of aortic stiffness (aortic pulse-wave velocity) before and after elective abdominal aortic aneurysm repair procedures: a pilot study. Open Cardiovascular Medicine Journal. 3, 173-175 (2009).
- Fortier, C., Desjardins, M. P., Agharazii, M. Aortic-Brachial Pulse Wave Velocity Ratio: A Measure of Arterial Stiffness Gradient Not Affected by Mean Arterial Pressure. Pulse. 5, 117-124 (2017).
- Golledge, J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nature Reviews Cardiology. 16 (4), 225-242 (2019).
- Choksy, S. A., Wilmink, A. B., Quick, C. R. Ruptured abdominal aortic aneurysm in the Huntingdon district: a 10-year experience. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 81, 27-31 (1999).
- Luo, F., Zhou, X. -L., Li, J. -J., Hui, R. -T. Inflammatory response is associated with aortic dissection. Ageing Research Reviews. 8, 31-35 (2009).
