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Behavior

L'incubazione della paura utilizzando un protocollo esteso di condizionamento della paura per i ratti

Published: August 22, 2020 doi: 10.3791/60537
Automatic Translation
1,6, 2, 2, 3, 3, 4, 2, 2, 2,5
1School of Psychology, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, 2Animal Behavior Laboratory, Fundación Universitaria Konrad Lorenz, 3Department of Psychology, Universidad de Los Andes, 4School of Veterinary Medicine, Animal Health Department, Universidad Nacional de Colombia, 5Department of Psychology, Troy University, 6Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

Summary

Descriviamo un protocollo esteso di condizionamento della paura che produce sovrallenamento e incubazione della paura nei ratti. Questo protocollo prevede una singola sessione di allenamento con 25 accoppiamenti tono-shock (cioè sovrallenamento) e un confronto delle risposte di congelamento condizionate durante i test di contesto e cue 48 h (a breve termine) e 6 settimane (a lungo termine) dopo l'allenamento.

Abstract

La memoria emotiva è stata studiata principalmente con paradigmi di condizionamento della paura. Il condizionamento della paura è una forma di apprendimento attraverso la quale gli individui imparano le relazioni tra eventi avversi e stimoli altrimenti neutri. Le procedure più utilizzate per studiare i ricordi emotivi comportano il condizionamento della paura nei ratti. In questi compiti, lo stimolo incondizionato (US) è un footshock presentato una o più volte in una o più sessioni, e la risposta condizionata (CR) si sta congelando. In una versione di queste procedure, chiamata condizione della paura cued, un tono (stimolo condizionato, CS) è accoppiato con footshocks (US) durante la fase di allenamento. Durante il primo test, gli animali sono esposti allo stesso contesto in cui si è svolta la formazione e le risposte al congelamento vengono testate in assenza di sferzate e toni (cioè un test di contesto). Durante la seconda prova, il congelamento viene misurato quando il contesto viene modificato (ad esempio, manipolando l'odore e le pareti della camera sperimentale) e il tono viene presentato in assenza di footshocks (cioè una prova di cue). La maggior parte delle procedure di condizionamento della paura cued comportano pochi abbinamenti tono-shock (ad esempio, 1-3 prove in una singola sessione). C'è un crescente interesse per le versioni meno comuni che coinvolgono un ampio numero di abbinamenti (cioè il sovrallenamento) legati all'effetto di lunga durata chiamato incubazione della paura (cioè, le risposte alla paura aumentano nel tempo senza un'ulteriore esposizione a eventi avversivi o stimoli condizionati). I compiti estesi di condizionamento della paura sono stati fondamentali per comprendere gli aspetti comportamentali e neurobiologici dell'incubazione della paura, compresa la sua relazione con altri fenomeni psicologici (ad esempio, disturbo da stress post-traumatico). Qui, descriviamo un protocollo esteso di condizionamento della paura che produce sovrallenamento e incubazione della paura nei ratti. Questo protocollo prevede una singola sessione di allenamento con 25 accoppiamenti tono-shock (cioè sovrallenamento) e un confronto delle risposte di congelamento condizionate durante i test di contesto e cue 48 h (a breve termine) e 6 settimane (a lungo termine) dopo l'allenamento.

Introduction

La memoria è un processo psicologico che comprende diverse fasi: acquisizione di informazioni, consolidamento (consente la stabilità delle informazioni acquisite) e recupero (prova per il processo di consolidamento)1. Durante la fase di consolidamento, si verificano la creazione di nuove connessioni sinaptiche e la modifica delle connessioni preesistenti. Ciò suggerisce la necessità di un periodo di tempo durante il quale si verificano eventi molecolari e fisiologici responsabili diquesti cambiamenti 1,2. Questi cambiamenti fisiologici o molecolari variano se gli eventi recuperati sono emotivamente caricati o meno (cioè la memoria emotiva). Per esempio, la ricerca ha dimostrato che il nucleo laterale e il complesso di amigdala basolaterale sono particolarmente rilevanti per la memoriaemotiva 3,4,5.

I fenomeni di memoria emotiva sono stati studiati principalmente con paradigmi di condizionamentodella paura 5,6. Il condizionamento della paura è una forma di apprendimento attraverso la quale gli individui imparano le relazioni tra eventi avversi e stimoli altrimenti neutri7. I paradigmi di condizionamento della paura producono cambiamenti molecolari, cellulari e strutturali nell'amigdala. Inoltre, il condizionamento della paura modifica la connettività dell'ippocampo durante i processi di consolidamento e recupero della memoria emotiva.

Una delle procedure più comunemente utilizzate per studiare i ricordi di paura è il condizionamento classico (Pavloviano) nei ratti. Questa procedura utilizza in genere footshock (US) come stimolo avverso, che viene consegnato una o più volte in una o più sessioni. La risposta condizionata (CR) dei ratti esposti a questa procedura è il congelamento (cioè " immobilità generalizzata causata da una risposta tonica generalizzata della muscolatura scheletrica degli animali ad eccezione dei muscoli utilizzati nella respirazione"7 ). Questa risposta potrebbe essere valutata su due tipi di test: test di contesto e cue. Per il test di contesto, il soggetto subisce un determinato numero di footshock durante la sessione di allenamento e quindi viene rimosso dalla camera sperimentale per un periodo di tempo definito. Durante la prova, il soggetto viene riportato nello stesso contesto in cui si è svolta la formazione e vengono raccolte diverse misure di congelamento in assenza di footshock (ad esempio, durata, percentuale o frequenza degli episodi di congelamento) e confrontate con i livelli di base stabiliti durante la fase di allenamento. Per il secondo tipo di test, cue test, uno stimolo (in genere un tono) viene abbinato alle pedonore durante la fase di allenamento (ad esempio, stimolo condizionale, CS). Una volta completata la formazione, l'animale viene rimosso dal contesto di allenamento per un tempo definito e successivamente collocato in un contesto modificato (ad esempio, una camera sperimentale diversa che ha diverse forme di pareti e odore diverso). Il segnale viene quindi presentato un determinato numero di volte e le risposte di congelamento al segnale vengono misurate e confrontate con i livelli di base raccolti durante l'allenamento. La versione più comune di questo paradigma utilizza accoppiamenti tono-shock da 1 a 3 durante una singola sessione di allenamento, seguiti da test di contesto e cue condotti un certo numero di ore o pochi giorni dopo.

Altre procedure di condizionamento della paura attuate meno frequentemente comportano un numero elevato di accoppiamenti shock-cue (cioè prove), che sono state spesso chiamate procedure disovrallenazione 8. Un crescente interesse per questi compiti è legato ai loro effetti di memoria di lunga durata e aumentati chiamati incubazione della paura (cioè, le risposte di paura condizionate aumentano nel tempo in assenza di ulteriore esposizione a eventi avversi o stimoli condizionati)9,10,11. Un esempio di tali procedure di sovrallenazione comporta una fase di formazione di 100 accoppiamenti tono-shock distribuiti in 10 sessioni, seguiti da test di contesto e cue condotti 48 h e 30 giorni dopo11,12. Per evitare un'estesa diffusione di formazione su diversi giorni, Maren (1998) ha riferito che il sovrallenaggio potrebbe essere stabilito e ottimizzato in una singola sessione con 25 accoppiamenti8. L'effetto di incubazione è evidenziato in livelli significativamente più elevati di paura condizionata nei ratti testati 31 giorni dopo l'allenamento, rispetto ai ratti testati 48 h dopo. I compiti estesi di condizionamento della paura sono stati fondamentali per la comprensione degli aspetti comportamentali e neurobiologici alla base dell'incubazione della paura, compresa la sua relazione con altri fenomeni psicologici (ad esempio, disturbo da stress post-traumatico a esordio ritardato)11,12,13.

Qui, descriviamo un protocollo esteso di condizionamento della paura che induce il sovrallenamento e l'incubazione della paura nei ratti. Diverso da altri paradigmi che richiedono diversi giorni di formazione11, il protocollo corrente è focalizzato su una singola sessione di formazione8. Abbiamo usato 25 abbinamenti tono-shock per produrre risposte di congelamento condizionate più elevate durante i test di contesto e cue condotti 6 settimane dopo l'allenamento, rispetto ai test condotti 48 h dopo.

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Protocol

Il seguente protocollo è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee di Fundaciàn Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL). Sono stati rispettati la dichiarazione universale dei diritti degli animali rilasciata dalla Lega internazionale dei diritti degli animali, Ginevra, Svizzera (1989), e i principi etici di sperimentazione sugli animali emessi dall'ICLAS.

1. Preparazione del soggetto

  1. Selezionare ratti Wistar adulti maschi (n - 12). Ospitarli in gruppi di quattro per gabbia per tre giorni di acclimatazione, prima dell'inizio del protocollo di formazione e test. Fornire ai ratti libero accesso all'acqua durante l'esperimento. Controllare la temperatura ambiente tra i 20 e i 25 gradi centigradi, in un ciclo di 12 h di luce-scuro (luci accese alle 07:00 h).
    NOTA: I ceppi di ratto avevano mostrato prestazioni differenziali durante il condizionamento della paura. Per esempio, Schaap et al. (2013) ha riferito che i ceppi di Wistar e Lewis hanno mostrato durate più lunghe di comportamento di congelamento rispetto ai ratti Fawn Hooded e Brown Norway12. Pertanto, le differenze di dolore e soglia termica dovrebbero essere valutate per regolare l'intensità e la durata degli urti.
  2. Mantenere i ratti all'85% dei loro pesi di alimentazione libera (peso normale tra 350-400 g) dando accesso limitato al cibo alla stessa ora ogni giorno. Pesare i ratti ogni giorno alla stessa ora durante il ciclo della luce. Calcolare il peso dell'annuncio lib (peso del 100%) per tre giorni prima dell'inizio dell'allenamento prolungato di condizionamento della paura.
    NOTA: Gli animali utilizzati nel presente esperimento sono stati testati su ulteriori test strumentali che non sono riportati qui. Per questi ulteriori test era necessaria la privazione alimentare. Si presume che questa variazione procedurale esanda la portata della presente procedura, in quanto suggerisce il potenziale per i test combinati strumentale-paura. Tuttavia, gli studi che utilizzano solo test di condizionamento della paura non richiederanno privazione di cibo.
  3. Assegnare casualmente i soggetti a uno dei seguenti gruppi: test emotivi 6 settimane dopo l'allenamento (n - 6); test emozionale 48 h dopo l'allenamento (n .
  4. Eseguire l'allenamento e i test in ore simili, durante la fase di luce del ciclo di luce scura. Assegnare gli animali alla stessa camera sperimentale e mantenere lo stesso ordine di animali durante l'addestramento e le prove.
    NOTA: un controllo aggiuntivo che potrebbe essere implementato è controbilanciare l'ordine degli animali durante le fasi di addestramento e test. È consigliabile utilizzare questa tecnica quando vengono valutati più gruppi o vengono applicate attività diverse tra gli esperimenti, per ridurre un possibile effetto dell'ordine delle attività sul comportamento.

2. Impostazione dell'apparato e calibrazione degli urti

  1. Pulire tutte le superfici interne della camera sperimentale e del pavimento della griglia in acciaio inossidabile con il 10% di etanolo. Ripetere prima di testare ogni animale.
  2. Collegare l'apparecchiatura a un computer utilizzando un cavo USB e avviare l'apparecchiatura del sistema di rilevamento del congelamento: la CPU, l'armadio di controllo, la luce infrarossa, lo stimolatore/scrambler avversivo e il calibratore di intensità d'urto.
    NOTA: Anche se questo protocollo è stato eseguito utilizzando strumenti disponibili in modo commerciale (Tabella dei Materiali), possono essere utilizzate attrezzature e software di marche diverse. L'apparato è costituito da una camera quadrata acrilica interna (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, chiamata camera sperimentale) incastorata in una scatola di legno ricoperta di plastica formica. Le porte esterne consentono l'isolamento del suono, del rumore o della luce (attenuanti delle porte della scatola). La telecamera si trova lateralmente nella parte interna della porta esterna. La scatola in acrilica interna con griglie metalliche del pavimento (36 aste in acciaio inossidabile, ognuna di 3 mm di diametro e distanziata 8 mm, da centro a centro) consente la consegna footshock. In una delle pareti interne laterali, un altoparlante si trova a 6 cm dal pavimento per presentare uno spunto uditivo.
  3. Collegare le clip rosse e nere del calibratore dell'intensità dell'ammortizzatore (ad esempio, connettori positivi e negativi) a due aste diverse sul pavimento della griglia. Collegare il cavo USB alla porta corrispondente del computer. Assicurarsi di collegare le clip rosse e nere alle barre separate da un'altra barra.
    NOTA: in questa sezione viene descritto il processo di calibrazione dell'intensità dell'urti utilizzando una marca specifica di apparecchiature menzionata nella Tabella dei Materiali. Tuttavia, il processo di calibrazione può essere eseguito utilizzando diverse marche di apparecchiature. Si raccomanda di calibrare l'intensità dell'ammortizzatore in tre settori del piano della griglia per verificare che sia coerente. Inoltre, rimuovere sempre i residui fecali e urinari dal pavimento della griglia per evitare interferenze durante la consegna dello shock.
  4. Avviare il software di calibrazione dell'intensità d'urto (Tabella dei materiali). Scegliere un'intensità di 1,0 mA nell'applicazione facendo clic sulla freccia dell'intervallo. Quindi, modificare l'interruttore Esegui/Stop su Esegui.
    NOTA: Proponiamo 1,0 mA sulla base dei nostri studi con modelli di roditori nel nostro laboratorio e letteratura che riporta una gamma da 0,75 mA a 1,5 mA come adeguata per gli studi di condizionamento della paura33,34,35.
  5. Accendere lo stimolatore o l'apparecchiatura utilizzata per fornire le pedonole e guardare l'intensità dell'ammortizzatore visualizzata sul pannello dell'applicazione. Se necessario, regolare l'intensità a 1,0 mA utilizzando la manopola sullo stimolatore arivo.
    NOTA: Lo stimolatore Aversive deve essere impostato su "OUT" per testare, calibrare ed eseguire l'esperimento in modo appropriato.

3. Calibrazione del sistema di rilevamento del congelamento

  1. Chiudere la camera sperimentale e le porte della scatola di attenuazione del suono. Non introdurre l'animale a questo punto, in quanto verrà inserito nella camera dopo che la calibrazione del sistema di rilevamento del congelamento è stata completata. Verificare che l'intensità della luce all'interno della scatola sia compresa tra 20 e 30 lux.
  2. Avviare il software del sistema di rilevamento del congelamento e aprire la finestra di dialogo Configurazione esperimento. Immettere i dettagli di ogni argomento (ad esempio il numero di identificazione del soggetto, la data e il gruppo) e caricare il file intitolato "Training protocol VFC.pro" (disponibile http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    NOTA: i test di contesto e cue utilizzano una configurazione di programma diversa; quindi, assicurarsi di utilizzare il file corretto su ogni test. A questo punto il file corretto corrisponde a "Training protocol VFC.pro". Tenere presente che durante le fasi di test il file corrispondente sarà diverso dalla sessione di allenamento.
  3. Scegliere le videocamere corrispondenti e selezionare l'opzione Salva video (se necessario). Impostate Soglia movimento su 100 e Durata min congelamento su 30 fotogrammi.
    NOTA: questo valore di Soglia movimento si basa sulle dimensioni della specie utilizzata (in base al numero di pixel). Il valore Durata minima congelamento è consigliato dal produttore. Questi valori vengono utilizzati per garantire il corretto riconoscimento dell'animale nella camera.
  4. Verificare che il feed live della fotocamera scelta venga visualizzato sullo schermo, insieme al grafico della soglia di movimento e alla sequenza temporale dei diversi stimoli presentati durante l'allenamento (ad esempio, suono e shock).
    NOTA: Utilizzando una marca diversa, l'installazione dell'apparecchiatura dovrebbe offrire la possibilità di misurare i movimenti dell'animale per rilevare un "indice" di movimento che dovrebbe consentire confronti sulla quantità di tempo in cui l'animale si muove o si blocca. Un'altra possibilità è l'utilizzo di un software che con solo la sorgente video (durante o dopo l'esperimento) in grado di rilevare la quantità di tempo in cui l'animale è in movimento o congelamento, come il software libero ImageF13, casella degli strumenti open-source in Matlab14, o un classificatore gratuito del comportamento animale come JAABA15.
  5. Fare clic sull'opzione Calibra tre volte, mentre verificare che l'indice di movimento rimanga al di sotto di 100 (soglia). Quindi, impostare l'apparecchiatura per il blocco facendo clic sul pulsante corrispondente sullo schermo.
    NOTA: in questa sezione viene descritto un processo di calibrazione del sistema di rilevamento del congelamento utilizzando una marca specifica di apparecchiature elencate nella Tabella dei Materiali. Come è stato detto in precedenza, il processo di calibrazione può essere condotto utilizzando diverse marche di attrezzature (per una revisione delle diverse opzioni in attrezzature e software vedere Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Allenamento esteso per condizionamento della paura

  1. Trasportare i ratti nelle loro gabbie di casa, coperti con un panno, dalla struttura di cura degli animali alla sala di addestramento comportamentale in laboratorio. Evitare l'esposizione a rumori o condizioni di generazione di stress durante il trasporto di animali nella sala di addestramento comportamentale. Se più animali vengono trasportati contemporaneamente, portare solo gli animali da testare e mantenere altri ratti in una sala di attesa per migliorare il controllo sperimentale. Maneggiare delicatamente gli animali per 2 minuti prima di iniziare l'allenamento.
    NOTA: Nel protocollo, gli animali sono stati trattati ogni giorno per 2 minuti prima dell'allenamento comportamentale. Dopo la manipolazione, gli animali sono stati introdotti nella camera sperimentale. Abbiamo raccomandato di manipolare gli animali per rendere i ratti abituali al ricercatore.
  2. Introdurre il ratto nella camera sperimentale. Maneggiarlo delicatamente dalla base della sua coda e posizionarlo al centro della camera. Chiudere la camera sperimentale e le porte della scatola di attenuazione del suono.
  3. Avviare la sessione facendo clic sul pulsante Registra. Lasciate che il ratto si acclimata alla camera per 3 minuti. Questo periodo di 3 minuti è lo standard raccomandato dal produttore dell'apparecchiatura e serve come base e tempo di assuzia per la camera.
  4. Fornire 25 accoppiamenti tono-shock (prove) con un 60 s Inter-Trial Interval (ITI), a partire dal minuto 3 della sessione. Presentare il tono (stimolo condizionato – CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50-ms Rise Time) durante gli ultimi 10 s di ogni ITI, e lo shock (stimolo incondizionato – US) durante gli ultimi 2 s di ogni ITI.
    NOTA: l'attivazione del pulsante Registra è condizionata dal fatto che le telecamere siano correttamente calibrate e bloccate.
  5. Rimuovere il ratto dalla camera sperimentale quando la sessione di 28 minuti è finita. Riportare gli animali nella rispettiva gabbia di casa. Trasportare i ratti nelle loro gabbie di casa coperte con un panno dalla sala di addestramento comportamentale alla struttura di cura degli animali.
  6. Ripetere la calibrazione del sistema di rilevamento del congelamento (passaggi 3.1-3.5) e il condizionamento della paura (passaggi 4.1 e 4.3) per addestrare tutti i soggetti.
    NOTA: si consiglia vivamente di ricalibrare il sistema di rilevamento per ogni animale per garantire che il software mantenga gli stessi parametri quando elabora le informazioni per il rilevamento del congelamento.
  7. Periodo di riposo: Durante questo periodo, gli animali riposano individualmente nelle loro gabbie di casa. Monitorare il peso degli animali due volte a settimana durante le 6 settimane del periodo di incubazione. Manipolare delicatamente ogni animale per due minuti mentre sono pesati.

5. Test di contesto – singola sessione da 10 min

  1. Dopo la fase di training, esporre gli animali al primo test di memoria denominato test di contesto. Durante questa fase di 10 minuti, esporre i ratti allo stesso contesto in cui la formazione ha avuto luogo, ma non presentare spunti o shock. Trasportare i ratti nelle loro gabbie di casa coperte (ad esempio, con un panno) dalla struttura di cura degli animali alla sala di addestramento comportamentale. Tenete a mente che gli animali sono stati divisi in gruppi, quindi un gruppo viene testato 48 h dopo la fase di allenamento e l'altro gruppo viene testato 6 settimane dopo l'allenamento (vedi Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Sequenza temporale dell'esperimento. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Pulire tutte le superfici interne della camera sperimentale e del pavimento della griglia in acciaio inossidabile con il 10% di etanolo. Ripetere prima di testare ogni animale.
  2. Ripetere la calibrazione del sistema di rilevamento del congelamento (passaggi da 3.1 a 3.5). Aprire la finestra di dialogo Configurazione esperimento e caricare il file denominato "Context test protocol.pro", disponibile http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    NOTA: questo file contiene l'impostazione per questa fase sperimentale che consiste di nessun shock o toni.
  3. Introdurre l'animale nella camera sperimentale. Maneggiarlo delicatamente dalla base della sua coda e posizionarlo al centro della camera. Chiudere la camera sperimentale e le porte della scatola di attenuazione del suono.
  4. Avviare la sessione facendo clic sul pulsante Registra. Durante questa singola sessione di test del contesto di 10 minuti, non vengono presentati stimoli (shock né suono).
  5. Rimuovere il soggetto dalla camera sperimentale al termine della sessione di 10 minuti. Riportare gli animali nelle rispettive gabbie e trasportare i ratti nelle loro gabbie di casa coperte dalla sala di addestramento comportamentale alla struttura di cura degli animali. Ripetere i passaggi 5.2-5.5 per testare tutti i soggetti.

6. Test cue – singola sessione da 13 min

  1. Un giorno dopo il test di contesto, gli animali vengono sottoposti al secondo test della memoria chiamato cue test. Durante questa fase, i ratti saranno in un contesto diverso di allenamento durante 13 min.; (toni) sono presentati, ma non vengono forniti ammortizzatori. Trasportare i ratti nelle loro gabbie di casa coperte da una copertura dalla struttura di cura degli animali alla sala di addestramento comportamentale. Testare un gruppo 72 h dopo l'allenamento di condizionamento della paura e testare un altro gruppo 6 settimane e un giorno dopo l'allenamento (Figura 1).
    NOTA: un diverso sistema di trasporto (dalla struttura di cura degli animali alla sala sperimentale) potrebbe essere implementato per differenziare più il contesto e i test di segnale. Poiché gli animali sono stati trasportati alla sessione di addestramento e alla sessione di prova di contesto nelle gabbie di casa, durante il trasporto alla sessione di prova potrebbe essere utilizzata una gabbia di trasporto, una biancheria da letto e/o una copertura diverse.
  2. Pulire tutte le superfici interne della camera sperimentale e del pavimento della griglia in acciaio inossidabile con il 10% di etanolo. Ripetere prima di testare ogni animale.
  3. Per cambiare il contesto visivo, inserire la parete circostante in plastica nella camera sperimentale.
  4. Per modificare il contesto olfattivo, applicare l'1% di acido acetico a un tampone con punta di cotone e posizionarlo nel vassoio metallico sotto il pavimentodella griglia 17,18,19.
  5. Ripetere la calibrazione del sistema di rilevamento del congelamento (passaggi 3.1-3.5). Caricare il file denominato "Cue test protocol.pro" file, disponibile da http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    NOTA: Questo file contiene l'impostazione per questa fase sperimentale, che consiste nella consegna degli stessi toni presentati durante la fase di allenamento (CS), ma in assenza di shock (US).
  6. Introdurre l'animale nella camera sperimentale. Maneggiarlo delicatamente dalla base della sua coda e posizionarlo al centro della camera. Chiudere la camera sperimentale e le porte della scatola di attenuazione del suono.
  7. Avviare la sessione facendo clic sul pulsante Registra. Durante la singola sessione di test cue 13 min, lo stimolo CS (tono) viene presentato 10 volte, a partire dal minuto 3 della sessione.
    NOTA: i primi 3 minuti corrispondono alla linea di base di questa sessione, seguiti da 10 prove di prova cue (vale a dire 10 s ciascuna) consegnate con 50 s ITI in assenza di shock. La consegna dei toni è automatica, tramite l'utilizzo del file caricato in precedenza.
  8. Rimuovere l'animale dalla camera sperimentale al termine della sessione di 13 minuti. Riportare gli animali nella rispettiva gabbia e trasportarli coperti all'impianto di cura degli animali. Ripetere i passaggi da 6.2 a 6.5 per testare tutti i soggetti.

7. Analisi dei dati

  1. Ottenere l'indice di attività generale (ad esempio, indice di movimento) derivato dal flusso video utilizzando il software del sistema di rilevamento del congelamento. Questo software trasforma automaticamente l'indice di movimento per fornire la percentuale di tempo di congelamento per sessione e il numero di episodi di congelamento. Impostate la soglia di congelamento sull'impostazione predefinita Durata minima congelamento del sistema (1 s e 30 fotogrammi).
  2. Utilizzare il programma personalizzato aggiuntivo (file disponibile da http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ) per ottenere:
    1. Utilizzare il programma per determinare la percentuale di congelamento durante i primi tre minuti della sessione di allenamento (ad esempio, congelamento della linea di base, poiché non sono stati presentati urti o toni prima o durante quel periodo di 3 minuti) e durante i primi tre minuti della sessione di test cue.
    2. Utilizzare il programma per determinare la percentuale di congelamento per ciascuno degli otto contenitori da 3 minuti della sessione di allenamento.
    3. Utilizzare il programma per determinare la percentuale di congelamento durante le presentazioni cue (cioè, congelamento durante i toni) e periodi no-cue (intervalli intertriali; ITI), sia per le sessioni di formazione che per le sessioni di cue-test.
  3. Per ottenere questi dati, aprire il software del sistema di rilevamento del congelamento.
    1. Selezionare File Proprietà Reports . Riepilogo componente batch.
    2. Selezionare il file con estensione . CMP disponibile da http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Denominare il file di output e impostare Soglia movimento su 100. Quindi, fare clic su OK.
    4. Selezionare i file da analizzare (estensione . RAW). Questi file vengono generati automaticamente dal software di sistema di rilevamento del congelamento quando la sessione è finita e corrispondono ai dati grezzi di ogni sessione. Inizialmente, i file vengono salvati sul desktop del computer, ma possono essere memorizzati in una cartella personalizzata (ad esempio, Documents-Fear condizionamento) per facilitare la loro successiva identificazione e apertura quando hanno bisogno di essere analizzati.
    5. Aprire i file di output (estensione . CSV). Possono essere modificati in un software foglio di calcolo per ulteriori analisi. Questo file contiene i risultati del congelamento durante la sessione sperimentale.
      NOTA: per ottenere la percentuale totale di congelamento, dividere il tempo trascorso dall'oggetto nel tempo totale della sessione. Il numero di episodi di congelamento può essere calcolato contando il numero di eventi di congelamento attraverso la sessione. In entrambi i casi, è necessario definire una soglia di movimento in base a una durata minima di congelamento. Questo è il criterio temporale che definisce se un Episodio di congelamento viene registrato. I sistemi automatizzati di registrazione possono utilizzare una certa quantità di fotogrammi al secondo (fps) come misura della durata minima del congelamento. Ad esempio, con una frequenza di campionamento di 30 fps, una durata minima di congelamento di 15 fotogrammi registra come congelamento un'istanza di immobilità che dura per 30 s.
  4. Calcola la durata media di ogni episodio di congelamento per ogni sessione (allenamento ed entrambi i test, contesto e cue) dividendo la durata totale di congelamento (in secondi) sul numero totale di episodi di congelamento.

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Representative Results

Le variazioni nella percentuale di tempo di congelamento durante le diverse fasi della sessione di allenamento sono state analizzate per tutti i soggetti (n e 12) utilizzando un test t dipendente (Tabella 1). Gli animali sono stati attivi ed esplorato la camera sperimentale durante i primi tre minuti della sessione di allenamento (primo giorno del protocollo), tempo durante il quale non sono stati consegnati toni o urti (cioè, baseline-BL). Come illustrato nella figura 2A, percentuale di tempo di congelamento durante i successivi 25 accoppiamenti tono-shock (M - 48,88; SE - 4,37) è stato significativamente più elevato rispetto a BL (M - 14,65; SE - 4,05), che si presume come indicazione di acquisizione della paura.

Test statistico Figura Fasi
Test t dipendente 2A t (11) - -6,21, p < .001, d - 2,34
Cestini da 3 min
Misure ripetute ANOVA 2B F (3,75, 41,32) - 11,19, p < .001, ηp2 - 0,50.
Fasi Gruppo Fasi X Gruppo
ANOVA mista 2C F(3, 30) - 14,21, p < .001, ηp2 ,58 F(3, 30) - 4,63, p < 0,05, ηp2 .31 F(1, 10) - 2,06, p >.05, ηp2 x 0,17
ANOVA uni-unita 3A F(1, 10) - 6,91, p < 0,05, ηp2 ,40
ANOVA uni-unita 3B F(1, 10) - 10,30, p < 0,05, ηp2 USD 0,50
ANOVA uni-unita 3C F(1, 10) - 5,83, p <. 05, ηp2 ,36 USD
ANOVA mista 4A F(2, 20) - 29,28, p < .001, ηp2 ,74 F(2, 20) - 2,33, p >.05, ηp2 0,18 USD F(1, 10) - 2,14, p >.05, ηp2 x 0,17
ANOVA mista 4b F(1, 10) - 1,53, p >.05, ηp2 x 0,13 F(1, 10) - 3,98, p < .05, ηp2 .28 F(1, 10) - 0,23, p >.05, ηp2 x 0,02
ANOVA mista 4C F(1, 10) - 25,43, p < .001, ηp2 .71 F(1, 10) - 6,17, p < .05, ηp2 0,38 USD F(1, 10) - 0,22, p >.05, ηp2

Tabella 1: Statistiche utilizzate nell'analisi dei dati. Per la figura 2A, la percentuale media di congelamento di tutti i soggetti (n - 12) durante i primi 3 minuti della sessione di allenamento (corrispondente alla linea di base, BL) è stata confrontata con la percentuale di congelamento durante i restanti 25 minuti della sessione (25 prove di tono-shock) mostrando una differenza significativa e una grande dimensionedell'effetto ( d di Cohen - 2,34). Per la figura 2B, è stato eseguito un confronto tra contenitori di 3 minuti che mostra una differenza significativa in un test ANOVA di misure ripetute (BL e otto contenitori da 3 minuti). Per la figura 2C, i confronti tra la percentuale media di congelamento di ogni gruppo di ratti durante la linea di base (BL, primi 3 minuti della sessione di allenamento), il periodo di allenamento (25 accoppiamenti tono-shock), la sessione di test di contesto e la sessione di test cue sono stati condotti tramite un ANOVA misto con fattore tra soggetti del gruppo (48 h o 6 settimane) e all'interno degli argomenti fattore le fasi (BL, Training, Context Test e Cue Test). Differenze nelle fasi e nel gruppo, ma non nell'interazione Fasi-Gruppo sono state trovate. Figura 3A – 3B mostra i dati sull'attività (pannello 3A, indice di movimento), congelamento (pannello 3B, congelamento medio in secondi) e durata degli episodi (pannello 3C, episodi di congelamento media in secondi). Questi dati sono stati analizzati utilizzando un'ANOVA universa, che indicava differenze tra i gruppi in tutte le misurazioni. Infine, per la figura 4A – 4C è stata eseguita una ANOVA mista per ogni pannello (A, B e C), avendo come fattore tra soggetti il gruppo (48 h o 6 settimane) e all'interno dei soggetti fattore le fasi (BL, Formazione, Test di contesto e Cue Test).

Figure 2
Figura 2: Fase di formazione di un protocollo di condizionamento della paura esteso. I dati vengono visualizzati come la media (barre) e il SEM (barre di errore) della risposta di congelamento. (A) indica la percentuale media di congelamento di tutti i soggetti (n - 12) durante i primi 3 minuti della sessione di allenamento, durante la quale non sono stati presentati ammortizzatori o toni (linea di base, BL) e i restanti 25 minuti della sessione (25 prove di tono-shock, con intervallo intertriale, ITI, di 60 s); - diverso da BL (p < .001). (B) indica il tempo medio di congelamento di tutti gli animali (n - 12) durante il periodo di riferimento di 3 minuti (BL, senza urti o toni consegnati) e i successivi bidoni da 3 minuti della sessione di allenamento; : diverso da tutti i contenitori rimanenti (p < .001). (C) indica la percentuale media di congelamento di ciascun gruppo di ratti (test 48 h dopo l'allenamento; test 6 settimane dopo l'allenamento) durante la linea di base (BL, primi 3 minuti della sessione di allenamento), il periodo di allenamento (25 accoppiamenti tono-shock), la sessione di test di contesto e la sessione di test cue; - diverso dal test dopo 48 h(contesto medio diffContext - -34,95, SE - 14,99, p < .05, d di Cohen - 1,34); a - diverso dal periodo di formazione (media diffTraining48h - 42,51; SE 7,28; p < .05; Cohen's d 3,03); b - diverso dal periodo di formazione (media diffTraining6Weeks - 25,94; SE 7,28; p < .05; Cohen's d - 1,77), test di contesto (media diffContext6Weeks - 50.36; SE 10,58; p < .01; Cohen's d - 3.13), e cue test (media diffCue6Weeks - 55.86; SE 10,25; p < .01; Cohen di 2,47 dollari). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un'analisi della risposta al congelamento durante l'acquisizione è stata condotta segmentando la sessione di formazione in otto contenitori da 3 minuti (Figura 2B). Questi dati mostrano che il tempo medio assegnato a questa risposta raggiunge l'asintanno vicino o a 180 s durante le prime tre prove di shock del tono (ad esempio, Bin 1). Questa constatazione è stata presa in considerazione nella ricerca precedente un'indicazione di sovrallentimento11. Le misure ripetute ANOVA hanno rivelato differenze significative costanti tra la linea di base e tutte le collocazioni successive, con grandi dimensioni deglieffetti (tabella 1 e tabella 2).

Confronto Differenza media Errore standard valore p D di Cohen
Previsione collocazione rispetto alla collocazione 1 -60.075* 12,243 < .05 1.95
Previsione collocazione rispetto alla collocazione 2 -69.053* 16,220 < .05 1.89
Previsione collocazione rispetto alla collocazione 3 -66.197* 13,706 < .05 1.91
Previsione collocazione rispetto alla collocazione 4 -68.595* 11,969 < .05 2.08
Previsione collocazione rispetto alla collocazione 5 -65.475* 10,991 < .05 2.15
Previsione collocazione rispetto alla collocazione 6 -65.795* 13,509 < .05 2.06
Previsione collocazione rispetto alla collocazione 7 -72.900* 12,231 < .05 2.53
Previsione collocazione rispetto alla collocazione 8 -78.633* 8,692 < .001 3.37

Tabella 2: Differenza media, errore standard e dimensione dell'effetto per i contenitori da 3 minuti nella figura 2B. In questa tabella vengono illustrati i confronti tra il Raccoglitore di base e ciascuna delle collocazioni successive (Figura 2B). Differenza media, errore standard e p-value e d di Cohen sono riportati come indice delle dimensioni di queste differenze (dimensione dell'effetto).

È stata condotta una ANOVA mista per testare le phases differenze in percentuale di congelamento durante l'attività, avendo fasi (BL, training, test di contesto e cue test) come fattore all'interno del soggetto e gruppo (48 h e 6 settimane) come fattore tra soggetti(Tabella 1). La percentuale di congelamento di tutti gli animali durante il periodo di formazione è stata significativamente superiore a quella del periodo di riferimento (c'è la figura 2C). Non sono state osservate differenze significative tra la percentuale di congelamento durante i test di memoriae ilperiodo di allenamento ( p s > .05).

Non sono state osservate differenze significative tra i due gruppi (48 h e 6 settimane) nella percentuale di congelamento durante il BL, l'allenamento e il cue test (ps > .115; vedi figura 2C). Al contrario, gli animali testati 6 settimane dopo l'allenamento hanno mostrato percentuali significativamente più elevate di congelamento durante il test di contesto rispetto agli animali testati a 48 h, con una grande dimensione dell'effetto (vedi figura 2C). Nel complesso, la figura 2C mostra che il congelamento durante i test di contesto e cue ritardati a lungo termine (cioè 6 settimane dopo l'allenamento) è stato complessivamente significativamente più elevato rispetto alla sessione di allenamento. La tendenza opposta al declino è stata osservata nel gruppo di animali che sono stati testati 48 h dopo l'allenamento. Tuttavia, queste differenze nel gruppo di 48 h non erano statisticamente significative (ps > .05). Infine, anche se il livello di congelamento ha mostrato differenze tra le diverse fasi, potrebbero essere considerati bassi rispetto ad altri protocolli. Una spiegazione potrebbe essere la differenza metodologica intrinseca tra i laboratori o la soglia dell'indice di movimento stabilita durante il processo di calibrazione, rendendo difficile il confronto dei dati tra i laboratori.

La risposta condizionata al congelamento dei due gruppi di soggetti durante la prova di contesto è stata ulteriormente esplorata attraverso l'analisi di altre misure, vale a dire l'attività media (cioè l'indice dimovimento),il tempo di congelamento totale e il tempo di congelamento per episodio. Per verificare le differenze tra queste variabili ( Tabella 1 ) è stata utilizzata una ANOVAuniversa. L'attività dei soggetti che sono stati testati 6 settimane dopo l'allenamento è stata significativamente inferiore a quella degli animali testati 48 h dopo la sessione di allenamento (Figura 3A). Di conseguenza, il tempo di congelamento totale degli animali testati poco dopo l'addestramento è stato significativamente inferiore a quello degli animali testati 6 settimane dopo (Figura 3B). Infine, un'analisi della durata media di ciascun episodio di congelamento ha indicato che gli animali testati 6 settimane dopo l'addestramento hanno mostrato episodi di congelamento più lunghi rispetto agli animali testati 48 h dopo l'allenamento (Figura 3C). Complessivamente, questi risultati indicano un effetto di incubazione della paura.

Figure 3
Figura 3: Effetti di un protocollo esteso di condizionamento della paura cued sulla risposta di congelamento dei ratti.
I dati vengono visualizzati come la media (barre) e il SEM (barre di errore) della risposta di congelamento. (A) mostra l'attività (cioè l'indice di movimento) di ciascun gruppo di soggetti (test 48 h dopo l'allenamento; test 6 settimane dopo l'allenamento) durante il test di contesto; - diverso da 6 settimane. (B) indica il tempo medio di congelamento totale (in secondi) di ciascun gruppo di soggetti durante il test di contesto; - diverso da 6 settimane. (C) indica la durata media di ogni episodio di congelamento (in secondi) per ogni gruppo di soggetti durante il test di contesto; - solo diverso da 6 settimane. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un ulteriore esame delle prestazioni durante la sessione di cue test è stato condotto attraverso analisi delle percentuali (a) di congelamento durante i periodi di base (BL Training e BL Cue Test) e durante l'intero test di cue 10 min (dieci presentazioni di toni da 10 s e dieci ITI di 50 s - Figura 4A), (b) tempo medio di congelamento specificamente durante le presentazioni 10 s del segnale (tono), sia per le sessioni di Training e Cue Test (Figura 4B) e (c) tempo medio di congelamento (in secondi) durante gli intervalli intertriali di 50 s (ITI; cioè, solo periodi no-tone – Figura 4C). Un ANOVA misto è stato utilizzato per analizzare ciascuna di queste misure dipendenti, assumendo fasi (BL Training, BL Cue Test e Cue Test) come fattore e gruppi all'interno dei soggetti (48 h e 6 settimane) come fattore tra soggetti(Tabella 1). Come mostrato nella Figura 4A, il gruppo di ratti testato 6 settimane dopo l'allenamento ha aumentato significativamente la loro percentuale di congelamento durante la linea di base della sessione Di cue Test (BL Cue Test; primi 3 minuti della sessione) e durante il 10 min Cue Test, rispetto all'allenamento BL (cioè, prima di qualsiasi esposizione a toni e urti). Nessuna differenza analoga tra l'allenamento BL e BL Cue è stata osservata per il gruppo di ratti testati dopo 48 h (p > .05). Per entrambi i gruppi di ratti, la percentuale di congelamento durante il Cue Test di 10 min è stata superiore a quella del corrispondente periodo di base della stessa sessione (BL Cue Test), il che suggerisce un effetto di recupero. Non sono state osservate differenze tra i gruppi di ratti in percentuale di congelamento nei diversi periodi (ps > .05).

Figura 4B mostra un confronto del tempo medio di congelamento (in secondi) in particolare durante le presentazioni di tono 10 s attraverso Training (accoppiamenti tono-shock) e Cue Test (solo presentazioni tono). Solo i ratti testati 6 settimane dopo l'allenamento hanno aumentato significativamente la quantità di tempo di congelamento durante lo stenosi.

Infine, come mostrato nella Figura 4C, solo il gruppo di ratti testato 48 h dopo l'allenamento significativamente diminuito il tempo di congelamento durante le ITI dalla sessione di formazione al Cue Test. Non sono state osservate differenze nel tempo di congelamento durante le ITI tra i due gruppi di ratti (ps >.05).

Figure 4
Figura 4: Effetti di un protocollo di condizionamento della paura cued esteso sulla risposta di congelamento durante il test cue.
I dati vengono visualizzati come la media (barre) e il SEM (barre di errore) della risposta di congelamento. (A) indica la percentuale di congelamento di ciascun gruppo di soggetti (test 48 h dopo l'allenamento; test 6 settimane dopo l'allenamento) durante i primi 3 minuti della sessione di allenamento (BL, baseline), i primi 3 minuti della sessione di test cue (BL Cue) e i 10 minuti del cue test (Cue Test); a - diverso dal test Cue dopo 48 h (diff medioBLTraining-Cue48h - 32,84; SE 10,25; p < .05; Cohen's d 1,52); b - diverso da BL Cue Test (media diffBLCue-BL6Weeks - 33,98; SE 8,36; p < .05; Cohen's d - 1,59) e Cue Test (mediaCue-BL6Weeks - 55,86;mean diff SE 10,25; p < .05; Cohen's d 2,47); c - diverso da Cue Test dopo 48 h (diff medioBLCue-Cue48h - 18,99; SE 5,17; p < .05; Cohen's d .67); d - diverso da Cue Test dopo 6 settimane (media diffBLCue-Cue6Weeks - 21,87; SE 5,17; p < .05; Cohen's d .88). (B) indica il tempo medio di congelamento (in secondi) durante il segnale (tono) di ciascun gruppo di soggetti durante l'allenamento e il Cue Test; - diverso da 6 settimane durante il periodo di prova di Cue Test(media diffTraining-Cue6Weeks - -3.14; SE 1,37; p < .05; Cohen è d 1,64). (C) indica il tempo medio di congelamento (in secondi) durante gli intervalli intertriali (ITI) della sessione di allenamento (10 accoppiamenti tono-shock) e il Cue Test (10 presentazioni solo tono) nei due gruppi di ratti (48 h e 6 settimane); - diverso da Formazione per gruppo di ratti testato 48 h dopo l'allenamento (media diffTraining-Cue48h - 506.16; SE 95,08; p < .001; Cohen è d 2,48). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'attuale protocollo esteso di condizionamento della paura è un approccio efficiente e valido per valutare la memoria emotiva in periodi brevi (48 h) e a lungo termine (6 settimane). Così, il protocollo permette di studiare il sovrallenamento e la paura dei fenomeni di incubazione nei ratti. Tra i diversi vantaggi di questo protocollo sono i seguenti. Offre due tipi di test di memoria, vale a dire contesto e cue, che consentono di identificare l'effetto differenziale di due ritardi (48 h e 6 settimane) attraverso le manipolazioni del contesto e del cue. In secondo luogo, il compito comporta una singola sessione di allenamento di 28 minuti, che a sua volta produce effetti a lungo termine che si estendono di diverse settimane. Questo vantaggio è notevole, considerando che alcune versioni di condizionamento della paura esteso hanno bisogno di almeno 100 shock in 10 sessioni di allenamento11. In terzo luogo, il protocollo offre diverse alternative di misurazione, che vengono calcolate automaticamente. Inoltre, vi è crescente evidenza farmacologica, fisiologica e anatomica che supporta la validità di questo paradigma per valutare i fenomeni di memoria emotiva15,16.

Rispetto ad altri paradigmi di condizionamento della paura con brevi sessioni di allenamento (cioè, poche prove), i protocolli estesi che si trascolano in effetti di sovrallenazione hanno ricevuto meno attenzione. Tuttavia, i compiti estesi di condizionamento della paura sono stati fondamentali per comprendere i processi comportamentali e neurobiologici sottostanti dell'incubazione della paura, compresa la sua relazione con altri fenomeni psicologici (ad esempio, disturbo da stress post-traumatico a esordio ritardato)11,12,13. L'attuale protocollo di condizionamento della paura produce in modo affidabile l'incubazione della paura. Ciò è dimostrato con tempi di congelamento più elevati e indici di movimento più bassi negli animali valutati 6 settimane dopo l'allenamento, rispetto agli animali testati 48 h dopo l'allenamento. Inoltre, questo effetto potrebbe essere osservato in modo differenziale in ciascuno dei tipi di prova; in particolare, episodi di congelamento più lunghi durante il test di contesto 6 settimane dopo l'allenamento e incrementi nel congelamento durante le presentazioni cue 6 settimane dopo l'allenamento. In relazione a quest'ultimo effetto (cioè, gli incrementi nel congelamento durante le presentazioni di cue 6 settimane dopo l'allenamento), sembra che la novità della situazione sperimentale (cioè il nuovo contesto) possa essere scartata, poiché i livelli di congelamento della linea di base durante quella stessa sessione erano significativamente inferiori rispetto alle successive presentazioni di cue.

Anche se una tendenza all'apprendimento della paura era evidente in entrambi i gruppi (cioè, differenze tra 3 min baseline e training), gli animali che sono stati testati dopo 48 h (contesto) e 72 h (cue) non presentavano differenze significative nel livello di congelamento durante entrambi i test. Questo può essere considerato una limitazione del protocollo, che sembra il risultato di un'elevata variabilità comportamentale nel gruppo 48 h (vedere la figura 2C). Un cambiamento metodologico che può essere attuato al fine di ridurre la variabilità e migliorare la procedura è quello di eseguire il contesto e cue test 24 h dopo l'allenamento, che è comune in alcune procedure di condizionamento della paura.

Il presente protocollo potrebbe essere applicato nella ricerca clinica23. La forte traccia di memoria e l'effetto di incubazione che derivano dalla sua attuazione possono consentire di testare gli effetti dei farmaci regolarmente utilizzati per il trattamento di patologie psicologiche e psichiatriche (ad esempio, trattamenti anxiolitici o regolatori dell'umore24) sui fenomeni di memoria emotiva (ad esempio, estinzione della paura)25,26,27. Il protocollo potrebbe quindi consentire di misurare l'influenza dei farmaci sulla traccia della memoria attraverso diversi intervalli di tempo, comprese le correlazioni biologiche come neurotrasmettitori e molecole legate alla manutenzione dellamemoria 28,29. Il protocollo potrebbe anche essere rilevante per la ricerca con una prospettiva traslazione, che ha proposto che i paradigmi della paura potrebbero essere utili per testare modelli preclinici di terapie comportamentali30 e studi comparativi sulla paura trale specie 21,22. Infine, da una visione neurobiologica, il protocollo attuale è un modello solido per studiare i meccanismi cerebrali, le comunicazioni tra strutture, reti o insiemi neuronali coinvolti nell'acquisizione a lungo termine, nel consolidamento e nello stoccaggio della memoria emotiva, o effetti dell'incubazione durante losviluppo 32.

Alcuni altri aspetti del protocollo meritano di essere discuti. La privazione di cibo è stata utilizzata durante l'esperimento. Questa decisione è stata adottata perché altri test comportamentali basati su premi alimentari (ad esempio, tecniche operanti o strumentali)33,34,35 possono essere integrati con modifiche minime, rendendo il presente protocollo una tecnica più versatile. Per esempio, abbiamo integrato con successo questo protocollo con protocolli di esercizio basati su ruote e attività di memoria T-laze. Un altro aspetto è legato alla dimensione del gruppo (n. 6) implementata in questo protocollo. Anche se si trattava di un campione relativamente piccolo, e sono certamente raccomandati campioni più grandi, la dimensione dell'effetto di incubazione compensa questa limitazione (c'è la tabella 1). Questo potrebbe essere considerato un vantaggio di questo protocollo, in particolare per quanto riguarda le raccomandazioni dei comitati animali basati sul principio di riduzione. Una limitazione del protocollo era che l'esposizione minima o nessuna alle pedovalute e al corso di tempo dell'incubazione della paura non sono state valutate. Un gruppo di controllo aggiuntivo con le condizioni prima potrebbe aumentare il rigore del progetto sperimentale.

Le raccomandazioni finali per la migliore attuazione e i risultati di questo protocollo includono la corretta pulizia della camera sperimentale, in particolare il pavimento della griglia, la calibrazione delle intensità di urto prima di addestrare ogni soggetto (ad esempio, feci e urina spesso riducono l'affidabilità dell'intensità dell'urti in diverse aree della camera) e la calibrazione del sistema di congelamento (l'affidabilità delle misure di congelamento dipende dalla corretta impostazione della soglia di movimento e dalla durata minima del congelamento).

Questo protocollo potrebbe essere testato con altri ceppi di ratti o altri roditori (ad esempio, topi o gerbilli mongoli), ampliando la portata delle applicazioni. In questi casi, è importante regolare l'intensità dell'urti e le soglie di movimento e durata. L'intensità di shock utilizzata nei protocolli di condizionamento della paura con i topi varia in genere da 0,4 mA a 1,5 mA, con 0,75 mA un'intensità effettivaspesso segnalata 16,36,37,38 e 1,5 mA la più alta intensità riportata39. Il gerbillo mongolo è un modello di roditore scelto meno frequentemente per la ricerca sul condizionamento della paura; tuttavia, i gerbilli mongoli sono stati utilizzati con successo per modellare i ritmi circadiani nei mammiferi40. Di conseguenza, l'attuale protocollo potrebbe essere implementato per studiare potenziali relazioni tra ritmi circadiani e memoria emotiva, entrambi rilevanti in patologie come la depressione, l'ansia o l'alterazione dell'umore41,42. Nel caso dei gerbilli, un intervallo di intensità d'urto efficace per questo e protocolli di condizionamento avversio analoghi è compreso tra 1,0 e 4,0 mA43,44,45,46. Infine, è importante notare che le soglie di movimento e durata devono essere regolate a seconda della specie scelta47. Queste soglie sono i limiti stabiliti sul software di tracciamento del movimento, al di sopra del quale il comportamento animale è registrato come movimento e al di sotto del quale il software registra il congelamento. Negli studi di condizionamento avverso con topi e gerbilli, le soglie effettive di movimento e durata segnalate sono state di 25 e 30 fps (cioè, minimo 1 s immobilità),rispettivamente 30,35.

Per garantire un adeguato controllo della stimolazione avversa (footshocks), tutti i settori del piano della griglia devono fornire la stessa intensità. Si raccomanda di calibrare l'intensità dell'ammortizzatore in tre settori del piano della griglia per verificare che sia coerente. Ciò impedisce agli animali di imparare a ridurre l'esposizione agli urti spostandosi in un punto della scatola che emette un'intensità inferiore. Se la calibrazione mostra che la griglia metallica non fornisce la stessa intensità in tutti i settori, rimuovere la griglia dal pavimento, pulire le aste e sostituire la griglia nella camera. Il pavimento della griglia deve essere inserito correttamente nella camera per garantire la migliore trasmissione elettrica dal dispositivo di stimolazione avversiva al pavimento della griglia.

La messa a fuoco e l'apertura della telecamera del sistema di rilevamento del congelamento sono calibrate dal produttore. Tuttavia, se è necessaria una calibrazione aggiuntiva, allentare i set sull'anello di messa a fuoco, regolare fino a ottenere un'immagine chiara e quindi stringere i set sull'anello di messa a fuoco. Il produttore consiglia di bloccare l'apertura dell'obiettivo nella posizione massima aperta. Per ottenere questa impostazione, assicurarsi che il punto bianco dell'anello di apertura sia allineato con il numero 1.4 sulla canna dell'obiettivo. Si consiglia di consultare il manuale del produttore. Si noti che se la messa a fuoco della fotocamera è stata regolata, deve verificarsi anche la calibrazione della fotocamera utilizzando il software corrispondente. La calibrazione della fotocamera richiede la regolazione della luminosità, del guadagno e dell'otturatore. Si consiglia di consultare il manuale del produttore per istruzioni precise sul processo di calibrazione della fotocamera.

In conclusione, il protocollo permette di testare la memoria emotiva in periodi brevi e a lungo termine e produce incubazione della paura a lungo termine. Questo effetto di incubazione della paura viene generato tramite un sovrallenamento a sessione singola, che mostra gli effetti 6 settimane dopo nei test di contesto e cue. Questo suggerisce una forte traccia di memoria emotiva. L'attuale protocollo è un approccio efficiente e valido per esplorare i componenti della memoria emotiva nei ratti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il sostegno finanziario a questa ricerca è stato fornito da Fundaciàn Universitaria Konrad Lorenz - numero di sovvenzione 9IN15151. Gli autori ringraziano il Dipartimento di Comunicazione dell'Università di Konrad Lorenz per il loro aiuto nella registrazione e nell'editing del video, in particolare Natalia Rivera e Andrés Serrano (Produttori). Inoltre, Nicole Pfaller-Sadovsky e Lucia Medina per i loro commenti sul manoscritto, e Johanna Barrero, Dean presso Corporacion Universitaria Iberoamericana, per la collaborazione istituzionale. Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (ethanoic acid) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Aversive Stimulation Current Package MED Associates Inc ENV-420 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Contextual test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Cue test protocol.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Curved Wall Insert MED Associates Inc VFC-008-CWI https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.zip http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
NIR/White Light Control Box MED Associates Inc NIR-100
Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse MED Associates Inc ENV-005FPU-M https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Small Tabletop Cabinet and Power Supply MED Associates Inc SG-6080D https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) MED Associates Inc ENV-414S https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standard Fear Conditioning Chamber MED Associates Inc VFC-008 https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Training protocol VFC.pro http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Video Fear Conditioning Package for Rat MED Associates Inc MED-VFC-SCT-R https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Comportamento Problema 162 memoria emotiva condizionamento della paura incubazione della paura sovrallenamento congelamento memoria di contesto cue memory
L'incubazione della paura utilizzando un protocollo esteso di condizionamento della paura per i ratti
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Acevedo-Triana, C., Rico, J. L., Ortega, L. A., Cardenas, M. A. N., Cardenas, F. P., Rojas, M. J., Forigua-Vargas, J. C., Cifuentes, J., Hurtado-Parrado, C. Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats. J. Vis. Exp. (162), e60537, doi:10.3791/60537 (2020).

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