פרוטוקול זה מתאר את השלבים שננקטו כדי לגרום לגידולים קראס ריאות בעכברים, כמו גם כימות של גידולים שנוצרו על ידי הדמיה אולטרסאונד. גידולים קטנים הם דמיינו בזמן מוקדם נקודות כמו B-קווים. בנקודות זמן מאוחרות יותר, המידות היחסיות של נפח הגידול מושגת על ידי כלי המדידה בתוכנת האולטרסאונד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי של התקדמות הגידול ריאה בעכברים על ידי הדמיה אולטרסאונד
במאמר זה
סיכום
תקציר
עם ~ 1,600,000 קורבנות בשנה, סרטן ריאות תורם מאוד את הנטל העולמי של סרטן. סרטן ריאות הוא מונע בחלקו על ידי שינויים גנטיים אונגנים כגון אונקראס גן, אשר מהווה ~ 25% ממקרי סרטן ריאות. הקושי של מיקוד רפואי קראס מונחה סרטן הריאות בחלקו נובע בעל מודלים עניים שיכולים לחקות את ההתקדמות של המחלה במעבדה. אנו מתארים שיטה המאפשרת את הקוונפיקציה היחסית של גידולים קראס ריאה הראשי ב-inducible LSL-קראס G12D מודל העכבר באמצעות הדמיה אולטרסאונד. שיטה זו מסתמכת על בהירות (ב)-רכישת מצב של הריאה בתוך כימומה. גידולים שנוצרו בתחילה במודל זה הם דמיינו כמו B-lines ניתן לכמת על ידי ספירת מספר ה-B-lines הנמצאים תמונות שנרכשו. אלה ייצגו את מספר הגידול היחסי שנוצר על פני השטח של ריאה העכבר. כמו גידולים שנוצרו להתפתח עם הזמן, הם נתפסים כמו בתרי עמוק בתוך הריאה מבכיצ'ימה. מאז היקף הגידול נוצר הוא מוגדר היטב, חישוב נפח הגידול היחסי מושגת על ידי מדידת האורך והרוחב של הגידול ויישום אותם בנוסחה המשמשת עבור מדידות הגידול קליבר. הדמיה אולטרסאונד היא טכניקה לא פולשנית, מהיר וידידותי למשתמש המשמש לעתים קרובות עבור כימות הגידול בעכברים. למרות שפריטים מסוימים עשויים להופיע בעת קבלת תמונות אולטרסאונד, זה הוכח כי טכניקה זו הדמיה היא יתרון יותר עבור כימות הגידול בעכברים לעומת טכניקות דימות אחרות כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT) הדמיה הדמיה ביולומינסנציה (בלי). חוקרים יכולים לחקור מטרות טיפוליות הרומן באמצעות טכניקה זו על ידי השוואת ייזום הגידול ריאות התקדמות בין קבוצות שונות של עכברים.
מבוא
כמו הגורם המוביל של מקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם, סרטן הריאות נשאר עקשן לטיפולים, בעיקר בשל חוסר מודלים רלוונטיים טרום קליניים שיכולים ללכוד את המחלה במעבדה1. סביב 25% ממקרי סרטן הריאות הם בשל מוטציות ב-קראס אונגן2. סרטן ריאות מונחה קראס משויך לעתים קרובות עם פרוגנוזה גרועה תגובה נמוכה לטיפול, הדגשת החשיבות של מחקרים נוספים במחלה זו2.
אנו אופטימיזציה שיטה המאפשרת את ההערכה היחסית של גידול בריאות הגידול בזמן אמת ב-קראס סרטן ריאות המושרה עכברים המוסמכים. אנו משתמשים ב-לקס-Stop-קראס G12D (lsl-קראס G12D) עכברים שבהם הקראס G12D אונגן ניתן לבטא על ידי וקטורים מבוססי וי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקרים בעלי חיים נערכו בהתאם לטיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש (IACUC) של אוניברסיטת מקגיל והליכים אושרו על ידי ועדת הרווחה בעלי החיים של אוניברסיטת מקגיל (השימוש בעלי חיים פרוטוקול 2009-5754).
1. הדור של CA2Cre-shp53 לנטינגירה
הערה: הפרוטוקול הבא זהה לזה שמתואר בשיה ואח '6, עם שינויים קלים.
- הכנת הנגיף (בעבור 15 ס"מ x 10 ס"מ מנות)
- ביום 1, צלחת HEK293T תאים בריאים (7.5 x 106 תאים לכל 10 ס"מ צלחת) עם 10 מ ל של מדיום שונה של Dulbecco של הנשר (dmem), 10% סרום של שור עוברי (fbs), ו 1% עט/דלקת. תרבות ב37 ° c, 5% חממה2 .
- הכינו את תערובת הסיד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר קבלת סיכוייו זיהומיות מדבקת של ~ 2 x 106 TU/mL (איור 1), Ca2Cre-shp53 הנגיף היה intratracheally מוזרק כאשר העכברים lsl-קראס G12D הגיעו לגיל המתאים (6-8 שבועות)9. הדמיה אולטרסאונד בוצעה לאחר 7 שבועות של זיהום בעת חניכה של גידולים (איור 3ב). הדמיה נעשה ב 7 שבועות כדי לכלול את הסוגים השונים של נגעים מקודמן המתרחשים במודל העכבר lsl-קראסG12D , החל היפרפלזיה כדי אדנומה3 כפי שמו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מדגימים שיטה שיכולה להעריך גידול ריאות הצמיחה בinducible LSL-קראס G12D העכבר מודל על ידי אולטרסאונד. שיטה זו יכולה לשמש להערכת ההשפעה של מעכבי פרמקולוגית על גידול הגידול בריאות. זה יכול לשמש גם כדי להשוות את גידול הגידול בריאות בין עכברים של רקעים גנטיים שונים. השימוש בטכניקה זו אינו דורש מיומנויות חישוב מיוחדות, אך חשוב להיות שיטתי במספר המסגרות המשמשות לניתוח כדי לאפשר השוואה נכונה אם השיטה משמשת להשוואת קבוצות שונות של עכברים.
צנרור intratracheal של ~ 2 x 106 TU/mL Ca2Cre-SHP.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים ד ר I. Verma עבור וקטור Ca2Cre-shp53 לנטינגיי. העבודה נתמכת על ידי כספים מן המכונים הקנדיים לחקר בריאות (מנקה CIHR 137113) ל-AEK.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.45 μ m Acrodisc מסנני מזרק | Pall Corporation PN | 4614 | |
| 100 מ"מ צלחת קולטר תאים | CELLSTAR | 664 160 | |
| צלחת תרבית תאים 6 בארות | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra - 15 יחידות סינון צנטריפוגליות | Merck Millipore Ltd. | ||
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 וקטור | מאת ד"ר. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D עכברי | JAX | 8179 | |
| MX550S; שידור מרכזי: 40 מגה-הרץ | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| עט/סטרפטוקוס | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
מקורות
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8(2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
