Summary
Hier presenteren we protocollen voor 1) het laboratorium in gevangenschap voortplanting van de federaal bedreigde Miami blauwe vlinder(Cyclargus thomasi bethunebakeri), en 2) de beoordeling van elementaire levensgeschiedenis informatie, zoals onvolwassen ontwikkelingstijd en het aantal larve stadia. Beide methoden kunnen worden aangepast voor gebruik met andere ex situ conserveringsprogramma's.
Abstract
Het verbeteren van de kennis van ex situ best practices voor risicovlinders is belangrijk voor het genereren van succesvolle resultaten van het conserverings- en herstelprogramma. Onderzoek naar dergelijke gevangen populaties kan ook waardevolle gegevens opleveren om belangrijke informatielacunes over het gedrag, de levensgeschiedenis en de ecologie van de doeltaxa aan te pakken. We beschrijven een protocol voor de interne voortplanting van de federaal bedreigde Cyclargus thomasi bethunebakeri dat kan worden gebruikt als model voor andere risicovlinder ex situ programma's, vooral die in de familie Lycaenidae. We bieden verder een eenvoudig en eenvoudig protocol voor het vastleggen van verschillende levensgeschiedenis statistieken die nuttig kunnen zijn voor het informeren van ex situ methodologieën en aangepast voor laboratoriumstudies van andere lepidoptera.
Introduction
Uit een groeiende lijst van studies blijkt dat de vlinderpopulaties1,2,3,4,5op grote en ernstige mondiale dalingen lopen . Dit omvat de overgrote meerderheid van de risicosoorten. Instandhoudingsprogramma's die zijn ontworpen om dergelijke dalingen te beperken, maken vaak gebruik van een mix van strategieën, waaronder bevolkingsbewaking, habitatbeheer en -herstel, wetenschappelijk onderzoek, ontwering van gevangenschap en overlocatie van organismen6. Binnen de VS en haar grondgebied alleen al, een totaal van 30 vlinder taxa zijn opgenomen onder de Endangered Species Act (ESA) als bedreigd of bedreigd, met 21 van deze hebben goedgekeurd ontwerp of definitieve herstelplannen. Voor deze taxa beveelt meer dan de helft van de vastgestelde terugvorderingsstrategieën voor uiting voor intern gebruik of staat zij dat de vermeerdering van intern gebruik moet worden beoordeeld7. Het gebruik van inspanningen ter instandhouding van de plaats van de steun voor vlinders is de afgelopen jaren aanzienlijk gegroeid8,9, en heeft het potentieel om een cruciaal instrument te zijn om herstelinspanningen te ondersteunen10. Tal van instellingen, organisaties en agentschappen zijn momenteel betrokken bij ex situ inspanningen voor ten minste 11 ESA-beursgenoteerde vlinder taxa (dat wil zeggen, Cyclargus thomasi bethunebakeri, Euphydryas editha quino, Euphydryas editha taylori, Heraclides aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides melissa samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae, en Speryeria zerene hippolyta) en diverse andere at-risk taxa (bijvoorbeeld, Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Speyeria idalia, en Eumaeus atala)11. Ondanks het aantal robuuste en succesvolle inspanningen, blijft er een gebrek aan regelmatige communicatie tussen programma's en tussen behandelaars die betrekking hebben op de uitwisseling van ideeën, gegevens, effectieve methodologieën en resultaten. Dergelijke kennisdeling is essentieel omdat het helpt dubbel werk te minimaliseren, de algehele beste praktijken verbetert en de impact op het behoud verbetert. Weinig gepubliceerde hoofd-startende, gevangen fokken, fokken, of veeteelt protocollen zijn direct beschikbaar voor risicovlinder taxa, en degenen die vaak niet voldoende narratief detail en / of illustraties. Deze bieden vaak meestal beknopte details met beperkte stapsgewijze instructies en bijbehorende afbeeldingen, waardoor replicatie uitdagend of toepassing op andere taxa moeilijk te beoordelen12,13,14,15. Veel van de beschikbare protocollen zijn beperkt op een bepaalde manier: ze bestaan alleen in de grijze literatuur, of in verschillende niveaus van detail, leeftijd van publicatie, of als onderdelen in symposium procedures, agentschap / financier rapporten, of in-house handleidingen16,17,18,19,20,21,22,23,24.
Voor de meeste instandhoudingsprogramma's wordt in gevangenschap voornamelijk voortplanting in gevangenschap uitgevoerd ter ondersteuning van de omzetting van instandhouding, die herintroductie, versterking (d.w.z. vergroting) en inleiding25,26omvat. Dergelijke activiteiten zijn bedoeld om strategisch te worden uitgevoerd als onderdeel van de algemene herstelstrategie om het uitsterven van een beursgenoteerde soort, ondersoort of populaties te helpen voorkomen. Opgemerkt moet echter worden dat dit een van de vele andere potentiële rollen die dergelijke ex situ programma's kunnen dienen. Deze kunnen ook bestaan uit het onderhouden van een verzekering (d.w.z. refugia) bevolking, tijdelijke redding van organismen, ondersteuning van herstel-gerelateerd onderzoek en / of opleiding, en bevordering van instandhouding-gerelateerde onderwijs en bewustzijn inspanningen27,28. Ongeacht of ex situ-programma's hebben een enkel gedefinieerd doel of een mix van meerdere, behoud beoefenaars moeten maximaliseren mogelijkheden voor het verzamelen van gegevens om in te vullen belangrijke informatie lacunes waar mogelijk. Dit is vooral belangrijk omdat de overgrote meerderheid van de risicobelasting over het algemeen slecht is bestudeerd voordat de wilde bevolking afneemt. De resulterende verbeterde kennis opgedaan opgedaan op verschillende gedrags-, ecologische of levensgeschiedenis aspecten van de focal taxon kan dienen om te helpen bevorderen effectieve soorten behoud en beheer29.
Hier beschrijven we in detail het captive propagatieprotocol dat is ontwikkeld voor de federaal bedreigde Miami blauwe vlinder(Cyclargus thomasi bethunebakeri) (Aanvullende Figuur 1) als onderdeel van een groter conserverings- en herstelprogramma. In dit geval vervult het kweekprogramma voor gevangenschap drie specifieke rollen: 1) een verzekeringspopulatie moet de bestaande wilde populatie verloren gaan, 2) een onderzoekspopulatie die is ontworpen om geïdentificeerde ecologische en levensgeschiedeniskennislacunes op te vullen die kunnen helpen bij het informeren van herstel en/of beheer, en 3) om levensvatbare organismen te produceren voor het behoud van translocatie naar locaties binnen het historische bereik van de taxon. Het resulterende protocol is goed doorgelicht en bewezen, die is gebruikt en verbeterd voor meer dan een decennium. Daarom zijn wij van mening dat de beschreven technieken en methodologieën een levensvatbaar model vormen dat kan worden toegepast op of gemakkelijk kan worden aangepast voor andere ex situ risicovlinderprogramma's, met name die waarbij Lycaenidae of gerelateerde taxa betrokken zijn. Hoewel we niet suggereren dat het beschreven protocol superieur is aan anderen, zijn we van mening dat er mogelijkheden zijn om sommige methoden breder toe te passen om de productiviteit, zorg of efficiëntie te helpen verbeteren. Dit geldt met name omdat veel van onze fokkerij wordt gedaan onder indoor laboratoriumomstandigheden met beperkte ruimte, vergelijkbaar met de instandhoudingsprogramma's waarbij Euphydryas editha taylori en Speryeria zerene hippolyta17,23. Tal van andere protocollen maken vaak gebruik van potmateriaal voor ovipositie of larve fokken, wat soms kan leiden tot verhoogde complexiteiten in verband met roofdierbestrijding, milieucontrole (d.w.z. vochtigheid, temperatuur), veemonitoring, gegevensverzameling, plantenplaagproblemen en ruimte om er maar een paar21,22te noemen. Ten slotte worden in het gepresenteerde protocol de methoden voor de kweek in gevangenschap beschreven. Veel andere programma's voor het behoud van vlinderdieren in gevaar omvatten het starten van of gevangen fokken met de representatieve protocollen die deze verschillen weerspiegelen. Hoewel vaak klein, zijn we van mening dat dit helpt bij het verbreden van de bestaande pool van beschikbare informatie voor andere programma's te herzien. Dit is van cruciaal belang, omdat de meeste ex situ programma's vertegenwoordigen baanbrekende inspanningen om te helpen vergemakkelijken het herstel van zeldzame en vaak slecht bestudeerde taxa. Beschikbare protocollen kunnen dienen als een uitstekend uitgangspunt om waardevol inzicht te bieden, dubbel werk te verminderen en innovatie te bevorderen. Als gevolg van "de uitgebreide interspecifieke diversiteit van vlinder gedrag, leven geschiedenis eigenschappen, en ecologische eisen in combinatie met vaak duidelijke verschillen in programmafaciliteiten, budgetten, vakexpertise" en andere inherente verschillen, afhankelijkheid van een enkele methodologie, zelfs voor nauw verwante taxa, is vaak beperkend en ongerechtvaardigd30. Flexibiliteit om nieuwe protocollen te verfijnen of te ontwikkelen die zijn afgestemd op de behoeften van specifieke taxa of programma's is essentieel voor succes en moet daarom worden benadrukt. We beschrijven bovendien laboratoriumtechnieken voor het verzamelen van statistieken over de ontwikkeling van organismen onder interne omstandigheden, waaronder het aantal larve-insterren, de duur van individuele ontwikkelingsstadia, totale ontwikkelingstijd en larve- en verpoppenlengte. Deze technieken hebben een brede toepasbaarheid voor levensgeschiedenis studies van Lepidoptera die kunnen worden gebruikt om ex situ protocollen te verfijnen of veldgegevens te informeren.
Protocol
1. Zorgen voor succesvolle verkering en paring voor volwassenen
- Na succesvolle eclosie, laat levensvatbare volwassen vlinders in een veilige, walk-in, gescreende vlucht kooi gelegen in een temperatuur-gecontroleerde kas (Aanvullende Figuur 2).
OPMERKING: Volwassenen kunnen worden gemarkeerd op het ventrale oppervlak van de vleugels met permanente inktmarkers als identificatie van specifieke personen gewenst is voor scheiding van genetische lijnen, oorsprong van de voorraad, of voor specifieke gegevensverzameling met betrekking tot de levensduur van het organisme, gedrag, Enz.- Terwijl de exacte kooiafmetingen kunnen variëren, zorg ervoor dat er voldoende ruimte is om voldoende nectarplantmateriaal aan te passen dat nodig is om de dichtheid van gehuisveste volwassen vlinders te ondersteunen en ruimte te bieden voor een mens om vrij te staan en rond te draaien.
- Zorg er naast temperatuurregeling voor dat de kas veilig is, zodat deze een tweede laag insluiting kan bieden, samen met bescherming tegen slecht weer (bijvoorbeeld zware regen, wind).
- Verhoog potnectar plantmateriaal zodat er niet meer dan 30 cm ruimte is van de binnenbovenkant van de kooi tot de hoogste bloeiende bloemen (Aanvullende figuur 2). Dit biedt optimale toegang tot de beschikbare nectarbronnen, biedt voldoende volwassen zitstokken en minimaliseert de externe vluchtactiviteit.
- Plaats één potgastheerin de vluchtkooi. Dit zorgt ervoor dat zelfs als een gekoppeld paar wordt gemist alle resulterende eieren gelegd kan worden verzameld.
- Zorg voor een consistente luchtstroom. Dit verbetert de verkeringsactiviteit en het paringssucces. In een kas omgeving, blowers en vaste mount circulatie ventilatoren zijn het best gebruikt om te helpen verbeteren ventilatie en luchtbeweging. Kleinere draagbare ventilatie, zoals box- of bureauventilatoren, kan ook worden gebruikt.
- Houd de interne kastemperatuur tussen 27 °C en 32 °C om optimale volwassen activiteiten en paringsslagsucces te bevorderen. De temperatuur in de kooi wordt bewaakt met behulp van een traceerbare geheugencontrolethermometer.
- Mist de afgeschermde vluchtkooi regelmatig (ongeveer eens per 2 uur) met water met behulp van een handpomp, plastic tankspuit of tuinslang.
- Verzamel voorzichtig individuele paringsparen uit de afgeschermde vluchtkooi met behulp van een 50 dram duidelijke plastic snap cap flacon (Tabel van materialen),het plaatsen van een tot twee paren per flacon, en vervoer naar een overdekte opfokkamer of laboratorium (Aanvullende figuur 3).
2. Maximalisatie van de eierproductie
- Stel de ovipositiekamer samen.
- Neem een 12 ounce gewone witte papieren beker en met behulp van een snap blade utility mes, maak twee horizontale bezuinigingen aan elke kant van de beker tegenover elkaar. Elke snede moet ongeveer 1 cm onder de velg liggen.
- Snijd een enkel wattenstaafje in de helft en steek de staaf einde van elk in de twee horizontale bezuinigingen aan elke kant van de papieren beker, zodat het wattenstaafje gedeelte strekt zich ongeveer 2 cm naar het interieur van de beker.
- Met behulp van een snap blade utility mes, maak twee "X" bezuinigingen in de bodem van de papieren beker. Elke diagonaal snede moet ongeveer 1 cm lang zijn.
- Neem een plastic beker van 9 gram en vul de bodem met ongeveer 2 cm kraanwater.
- Plaats een vers snijden, ongeveer 15 cm lang, van terminallarve gastheer plant groei in de papieren beker door het invoegen van de stengel door middel van een van de "X" bezuinigingen in de bodem. Duw de steel door de snede, zodat ongeveer 4-5 cm uitsteekt de bodem.
- Plaats de papieren beker met gastheermateriaal in de plastic beker, zodat de plantensteel in het water is.
- Vul een subq-spuit van 1 ml (0,45 mm x 16 mm) met een sportdrank met smaaken en verzadig beide wattenstaafjes in de papieren beker. Deze fungeren als kunstbloemen.
LET OP: Meloen en fruit punch gearomatiseerde sportdrank bieden de beste nectar alternatief. - Zodra elk paar scheidt, plaats 2-3 gravid vrouwtjes in de geassembleerde beker configuratie (dat wil zeggen, de oviposition kamer).
- Bedek de beker met een gesneden vierkant fragment van zwarte tule (ongeveer 15 cm x 15 cm) en zet deze vast met een elastiekje rond het deksel (Aanvullende figuur 4). Zwarte tule biedt het beste zicht op de beker en eenvoudige identificatie van eieren die af en toe op de tule gelegd kunnen worden.
- Stimuleer volwassen vlinderactiviteit en ovipositie.
- Plaats elke ovipositiekamer op een laboratoriumbank of tafel ongeveer 19 cm onder een 21,59 cm lange klemlamp met een aluminium reflector met een gloeilamp van 40 W (Aanvullende figuur 5).
OPMERKING: Het gloeiend licht zorgt voor de stralingswarmte die nodig is om de activiteit en ovipositie van volwassenen te stimuleren. - Plaats een traceerbare geheugencontrolethermometer naast de lichten en laat de temperatuursensor draaien, zodat deze bovenop een oviposition-kamer direct onder een klemlicht ligt.
OPMERKING: Het doeltemperatuurbereik ligt tussen 27,5 °C-29 °C. - Voeg indien nodig extra klemlichten toe, afhankelijk van het totale aantal ovipositionale kamers dat wordt ingezet.
- Plug klem verlichting in een programmeerbare 15 Amp 24 h indoor plug-in mechanische timer met twee stopcontacten (programmeerbaar in 30 min getimede intervallen).
- Stel de timer in om klemlicht 30 minuten intervallen aan te zetten (d.w.z. een herhaalbare cyclus van 30 minuten aan, 30 minuten uit).
OPMERKING: Deze lichtcyclus helpt om de eiproductie te maximaliseren door herhaalbare perioden van verlichting te bieden om volwassen vlinderactiviteit en ovipositie te stimuleren, gevolgd door korte donkere rustperioden. - Ververs de wattenstaafjes in elke beker met gearomatiseerde sportdrank via de sub-Q spuit en mist regelmatig met water met behulp van een plastic spuitfles ongeveer elke 2-3 uur of indien nodig.
LET OP: Dit zorgt voor voldoende kunstmatige nectar en vocht om de vlinders in staat te stellen vrij te voeden zoals gewenst. Het verbetert daardoor zowel de levensduur van volwassenen als de ovipositieproductiviteit onder laboratoriumomstandigheden waar levend, bloeiend plantmateriaal niet gemakkelijk kan worden gebruikt. - Monitor regelmatig bekers en vervang de gastheerplant indien nodig door verse stekken.
- Wanneer de eieren beginnen uit te komen of de dichtheid van eieren hoog wordt, verplaatst u het vrouwtje(en) naar een nieuwe beker met verse gastheer en begint u met het larvenprotocol met neonaten.
- Plaats elke ovipositiekamer op een laboratoriumbank of tafel ongeveer 19 cm onder een 21,59 cm lange klemlamp met een aluminium reflector met een gloeilamp van 40 W (Aanvullende figuur 5).
3. Larve zorg en onderhoud
- Herhaal stap 2.3-2.6 om bekers voor larven te monteren.
- Wanneer de eieren beginnen uit te komen, verplaats gastheer plantaardig materiaal met eieren en neonate larven in een nieuw geassembleerde beker, het plaatsen van de stengel door de tweede "X" in de bodem ervoor te zorgen dat de plantenstam is in water en bladeren raken aangrenzende verse gastheer snijden.
- Wanneer larven jong zijn (neonaat-2 instar), controleer larve cups dagelijks op versheid van gastheer plantaardig materiaal en de aanwezigheid van schimmel of overmatige frass.
OPMERKING: Dagelijkse verwijdering van gastheermateriaal wordt niet aanbevolen wanneer larven jong zijn, omdat dit kan leiden tot schade aan het organisme als gevolg van de behandeling en/of onnodige verspilling van vers gastheermateriaal. - Als gastheermateriaal verwelkt of in anderszins slechte staat verkeert, plaatst u een ander snijden van vers gastheermateriaal in een beker, zodat het bestaand blad raakt en larven in staat stelt om zelfstandig naar de nieuwe gastheer te gaan.
- Zodra larven de3e instar bereiken, vervang je de papieren beker en voeg ze dagelijks vers gastheermateriaal toe.
- Gebruik een kleine kameel haar aquarel penseel om voorzichtig bewegen de larven van de oude gastheer materiaal of beker oppervlak naar vers gastheer materiaal in de nieuwe beker.
- Plaats het oude gastheermateriaal in een lege rechthoekige plastic voedselopslagcontainer.
- Herhaal stap 3.5-3.7 dagelijks en totdat alle kopjes met larven zijn verwerkt.
- Voeg bij het vullen van de keuken een kleine hoeveelheid vers gastheermateriaal op het plantenafval in de voedselopslagcontainer en plaats er losjes een deksel op.
OPMERKING: Dit dient als een waarborg in het geval larven worden over het hoofd gezien tijdens de dagelijkse verwerking, omdat ze zullen kruipen op de nieuwe gastheer materiaal op de top van het plantenafval en kan de volgende dag worden verwijderd. - Kopjes onder laboratoriumtemperatuur tussen 25 °C-28 °C voor optimale larveactiviteit en ontwikkeling (Aanvullend figuur 6).
OPMERKING: Om optimale opfoktemperaturen te bereiken onder binnenomstandigheden, is het vaak noodzakelijk om bekers onder klemverlichting te plaatsen met aluminium reflectoren met 40 W gloeilampen. De temperaturen kunnen vervolgens actief worden gecontroleerd met behulp van een traceerbare thermometer voor geheugenbewaking en de lichthoogte die is aangepast om optimale opfokomstandigheden te bereiken.
4. Bouw van de verpoppenkamer
- Snijd een enkel gezicht golfkarton rol in gelijke grootte 3,8 cm x 3,8 cm vierkanten.
- Plaats een vierkant in een 2 ounce duidelijke plastic portie beker.
- Plaats de beker op een doorzichtige plastic bekerbak(Aanvullende figuur 7).
5. Het voorbereiden van larven op verpoppen
- Identificeer volwassen larven die klaar zijn om te verpoppen tijdens de dagelijkse verwerking van kolonies.
LET OP: Dergelijke larven zullen een uniforme doffe groenbruin worden, hun chevrons verliezen en vaak van de gastheer afdwalen. - Verwijder voorzichtig elke volwassen larve met een kleine kameel haar aquarel penseel of tang en plaats een in elke pupatie kamer.
- Breek stevig het doorzichtige plastic deksel op de verpoppende kamer.
- Herhaal stap 5.1-5.3 totdat alle larven die klaar zijn om te verpoppen zijn overgebracht naar verpoppenkamers en zo nodig nieuwe plastic trays toevoegen (Aanvullende figuur 8).
6. Behoud van poppen
- Noteer voor elke lade pupatiekamers de datum van eerste verpoppen en alle andere relevante informatie die nodig is (d.w.z. genetische lijn, experimenteel onderzoek, enz.).
- Trays op datum en plaats in een veilige plaats in het laboratorium organiseren (Aanvullend figuur 8).
- Monitor trays dagelijks voor volwassen eclosion.
OPMERKING: Laboratoriumomstandigheden zoals temperatuur zullen de ontwikkelingstijd sterk beïnvloeden. - Verwijder de deksels van de afzonderlijke verpoppen (meestal binnen 10 dagen na de eerste verpoppen) en plaats de lade in een 34,29 cm x 34,29 cm x 60,96 cm inklapbare pop-up opfokkooi(aanvullende figuur 9).
OPMERKING: Poppen die stevig in de groeven van de golfplaten zijn bevestigd, vergemakkelijken succesvolle extase voor volwassenen (Aanvullend figuur 10). - Herhaal het volledige protocol van stap 1.1 voor de volgende populatiegeneratie.
7. Beoordeling van de ontwikkelingstijd van onrijpe stadia en het aantal stadions
- Plaats een enkele larve onder een ontledende microscoop. Gebruik een kleine kameel haar aquarel penseel om zorgvuldig te bewegen en isoleren larven om letsel aan het organisme te voorkomen.
- Dompel een enkel haar van de penseel in niet-toxische lichtgevende verf(Tabel van materialen), en voorzichtig een kleine druppel verf op de rug (dorsum) van de larve. Gebruik een verfkleur die zich onderscheidt van de achtergrondkleur en patroonkleur van de larve(aanvullende figuur 11). Zorg ervoor dat u niet het plaatsen van verf op het hoofd van de larve.
- Zodra de verf droogt (ongeveer 30 s of zo), plaats elke individuele larve in zijn eigen 2 ounce duidelijke plastic deelbeker met ongeveer 1-3 kleine bladeren van verse terminal host materiaal en schrijf een unieke identificatie op de beker en deksel (Aanvullende figuur 12).
- Controleer elke larve dagelijks zorgvuldig. Verwijder bladeren en zet op wit oppervlak. Inspecteer cup, helder deksel, en onderzoeken bladeren onder een ontledenmicroscoop voor de aanwezigheid van larve exuviae (gegoten huiden) en / of hoofd capsules.
- Als een larve exuvia wordt gevonden, verwijder het uit de beker en plaats het in een microcentrifuge buis geëtiketteerd met het bijbehorende bekernummer en de datum (zie stappen 8.1-8.6. hieronder).
- Verf larven na elke vervelling en neem molt data.
- Meet dagelijks de totale lichaamslengte (hoofd tot laatste buiksegment) van elke larve met behulp van digitale remklauwen. Neem drie metingen en neem het gemiddelde van de drie, samen met de datum en tijd. Voor vroege instar larven moet bij het meten een vergrootglas of ontledende scope worden gebruikt om nauwkeurige metingen te garanderen.
- Breng de larve terug naar de bijbehorende plastic portiebeker.
- Voeg indien nodig vers gastheermateriaal toe en verwijder alle frass en oud gastheerafval. Als schimmel wordt gevonden in de beker, gooi en gebruik een nieuwe beker. Schrijf het juiste unieke identificatienummer op de nieuwe beker.
- Herhaal stap 7.5-7.9 totdat alle larven hun laatste instar bereiken en beginnen met de prepupale fase. Wanneer larven stoppen met voeden, draai een uniforme doffe groenbruine kleur, verliezen hun chevrons, en vaak dwalen uit de gastheer, minimaliseren storenze.
- Plaats een klein stukje golfpapier in de beker (zie stap 4.1).
- Zodra elke larve volledig is verpopt, meet de totale lengte als in stap 7.8 hierboven en registreert de datum van verpoppen. Dit zal de laatste molt van elk individu.
- Controleer de poppen dagelijks en registreren eclosion datum en geslacht van elke resulterende volwassen vlinder.
- Meet de lengte van het vleugelakkoord van elke vlinder met behulp van digitale remklauwen. Vlinders kunnen voorzichtig worden gehouden met tangen voor meting. Als de vlinder te actief is om gemakkelijk te meten, plaats deze tijdelijk in een koelkast voor 30 s of minder en probeer het opnieuw.
8. Verzamelen van larve exuviae
- Wanneer een larve exuvia wordt waargenomen, vul dan een microcentrifugebuis met 0,2 μl glycerine. Label de bovenkant van het deksel en de zijkant met het larvenummer, de datum van de vervelling en de hoofdcapsule (H.C.).
OPMERKING: De larven van sommige lepidopteran larven consumeren regelmatig hun exuviae, maar de hoofdcapsule moet blijven. - Plaats de larve exuvia en de bijbehorende hoofdcapsule in een doorzichtige plastic portiebekerdeksel en doe er een paar druppels ethanol in.
- Onderzoek de larve exuvia onder een ontledende microscoop door het in een duidelijke plastic gedeeltekopdeksel te plaatsen en een paar dalingen ethanol op het te zetten. Als de larve kop capsule is al gescheiden van de exuvia, plaats een druppel glycerine op het puntje van puntige entomologische tangen en zachtjes aanraken van het hoofd capsule aan de glycerine. Plaats de hoofdcapsule in de bijbehorende microcentrifugebuis.
- Als de hoofdcapsule nog steeds aan de larveexuvia is bevestigd, gebruik dan puntige tangen en een insectenspeld om de hoofdcapsule van de larveexuvia te scheiden.
- Zodra het is gescheiden, gebruik maken van de glycerine techniek op te halen het hoofd capsule. Als er te veel ethanol is, u een kleine papieren handdoek gebruiken om wat te verwijderen, maar wees voorzichtig om de hoofdcapsule niet per ongeluk te verwijderen.
- Plaats de hoofdcapsule in een met het etiket gelabeldglycerine gevulde flacon en sluit het deksel stevig.
Representative Results
In de loop van twee afzonderlijke instandhoudingsinitiatieven gericht op het herstel van Cyclargus thomasi bethunebakeri van februari 2003 tot december 2010 en van november 2016 tot heden, werd dit protocol gebruikt om met succes een overschot van 51.052 levensvatbare organismen te produceren. Op basis van de beknopte momentopname van een jaar van de totale productiviteit van de in gevangenschap gevangenschap tussen juni 2018 en juni 2019, werden in totaal 10.166 levensvatbare organismen geproduceerd, wat neerkomt op 782,00 ± 118,93 organismen per maand over 13 generaties. Evenzo bedroeg de gemiddelde totale eiproductie per vrouwtje onder laboratoriumomstandigheden 114,00 ± 26,12 (n = 12)31. De resulterende aanzienlijke productiviteit van organismen rangschikt dit programma onder de grootste dergelijke ex situ inspanningen in de VS, samen met die van Euphydryas editha taylori, Speyeria zerene hippolyta, en Lycaeides melissa samuelis24. Een deel van deze productiviteit kan worden toegeschreven aan het feit dat de vlinder continu wordt gebroed, waardoor ongeveer elke 4-6 weken in gevangenschap één generatie wordt geproduceerd. De meerderheid van de andere instandhouding fokprogramma's betrekken taxa die univoltine of bivoltine. Niettemin, zelfs voor programma's met betrekking tot extreem fecund taxa zoals Speyeria spp., het totale aantal levensvatbare organismen geproduceerd voor het behoud translocatie op jaarbasis zelden meer dan een paar duizend32. Daarom heeft onze gevangen populatie gericht onderzoek en uitgebreide gegevensverzameling mogelijk gemaakt op tal van belangrijke gegevenslacunes die belangrijk zijn om de beste laboratoriumveredelings- en veeteeltpraktijken(figuur 1)te verbeteren en bij het informeren van herstel- en managementbeslissingen.
Gemiddelde totale ontwikkelingstijd van neonaatlarve tot volwassene was 28,63 dagen(tabel 1). De meerderheid van de larven had vier molts (Figuur 2, Figuur 3), hoewel twee vijf molts hadden, en één had zes molts. De totale gemiddelde lengte van alle larve instars was 5,97 mm, en larven waren het grootst in de vierde en prepupal eertijds(tabel 1). Toen alleen variabelen met meer dan 30 waarnemingen werden meegebracht, werd de kortste tijd doorgebracht in de eerste instar- en prepupale stadia, en de langste werd besteed als poppen (tabel 1, figuur 2). Vrouwtjes ontwikkelden zich meestal sneller in alle onrijpe stadia in vergelijking met mannen, hoewel dit geen significant effect was (p = 0,625). Statistische analyses werden uitgevoerd met RStudio Versie 1.1.463 (R Core Team 2016)33. De gemiddelde volwassen vleugel akkoord lengte was 12,64 mm (Tabel 2), en er was een significant verschil tussen de geslachten (p = 0,047). De tweezijdige t-test werd uitgevoerd om het vleugelakkoord verschil tussen geslachten te evalueren. Lineair regressiemodel en stapsgewijze regressie voor de gemiddelde lengte van elke levensfase toonden aan dat de verpoplengte de beste voorspeller was voor de lengte van het vleugelakkoord voor volwassenen(tabel 3, tabel 4). Regressiemodellen voor ontwikkelingstijd toonden aan dat het aantal dagen dat in de tweede en vierde insterren werd doorgebracht en het totale aantal dagen de beste voorspellers waren voor de lengte van het vleugelakkoord voor volwassenen, maar alleen het aantal dagen in de vierde instar was significant(tabel 5, tabel 6). Omdat variabelen continu waren, werden twee lineaire regressiemodellen uitgevoerd voor de ontwikkelingstijd van elke levensfase, evenals de lengte van elk levensstadium, met volwassen vleugelakkoordlengte als afhankelijke variabele. Stepwise regressies werden uitgevoerd op beide regressiemodellen om de beste voorspellers van volwassen vleugel akkoord lengte te bepalen.
Aanvullende figuur 1: Gespelde exemplaren van volwassen Cyclargus thomasi bethunebackeri. (A) Volwassen mannetje, rug (links), ventral (rechts). (B) Volwassen vrouwtje, rug (links), ventral (rechts). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 2: Gescreende vluchtkooi gehuisvest in temperatuurgecontroleerde kas. (A) Interieur toont potige volwassen nectar planten en een enkele pot larve gastheer plant. (B) Metalen rekken helpt om potnectar planten verheffen, zodat er niet meer dan 30 cm ruimte van de binnenbovenkant van de kooi tot de hoogste bloeiende bloemen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 3: Procedure voor het verzamelen van volwassen paren in copula. (A) Paring paar van volwassen Cyclargus thomasi bethunebakeri in de gescreende vlucht kooi (vrouw, rechts en mannelijk, links). (B) Paringsparen verzameld uit de vluchtkooi in snap cap flesjes en in het laboratorium gebracht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend cijfer 4: Procedure voor het samenstellen van de ovipositiekamer. (A) Twee cup systeem met terminal host materiaal en wattenstaafjes. (B) Een 1 ml subq spuit (0,45 mm x 16 mm) met gearomatiseerde sportdrank verzadigende wattenstaafjes in de papieren beker. (C) Cups met gravid vrouwtjes beveiligd met zwarte tule. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 5: Laboratoriumopstelling voor het maximaliseren van de eierproductie. (A) Oviposition kamers geplaatst op een laboratorium bank onder een klem licht met een 40 W gloeilamp. (B) Een traceerbare geheugencontrolethermometer wordt naast de lichten geplaatst met de temperatuursensor die bovenop een oviposition-kamer ligt die direct onder een klemlicht ligt. (C) Een 1 ml sub-Q spuit en kleine beker bedrijf gearomatiseerde sportdrank geplaatst naast de oviposition kamers om het vergemakkelijken van het vernieuwen van de wattenstaafjes regelmatig gedurende de dag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 6: Laboratoriumopstelling voor larvezorg en onderhoud. (A) Twee cup systeem met elk met vers eindgastheermateriaal en larven. (B) De temperatuur in de cups wordt gehandhaafd tussen 25 °C-28 °C voor optimale larveactiviteit en ontwikkeling door bovengrondse klemlichten met gloeilampen van 40 W. (C) Een traceerbare geheugencontrolethermometer met de temperatuursensor die direct in een beker wordt geplaatst, wordt gebruikt om de temperatuur te controleren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 7: Voorbereide verpoppenkamers. (A) Individuele plastic portiebekers gehuisvest op de doorzichtige plastic bekerbakken. (B) Een golfplaten papier vierkant wordt geplaatst in elke plastic portie beker. (C) Een enkele volwassen larve zal worden geplaatst in elke bereide plastic portie beker te verpoppen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 8: Het voorbereiden van larven op verpoppen en onderhoud van poppen. (A) Volwassen larve klaar om te verpoppen op golfkarton. Het is een uniforme doffe groenbruin en heeft verloren alle chevrons. (B) Verpoppenkamers klaar om volwassen larven te ontvangen naast bekers met voederlarven. Alle verpoppenkamers met deksels huis larven die zich voorbereiden om te verpoppen. (C) Verpoppenkamers met poppen. (D) Banken van verpoppenkamers met poppen die op datum worden georganiseerd en onder laboratoriumomstandigheden worden onderhouden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 9: Laboratorium opkomst kooi. (A) Een inklapbare mesh pop-up opfokkooi waarin de bezette verpoppenkamers. (B) De deksels van alle verpoppenkamers worden verwijderd om succesvolle volwassen eclosie te vergemakkelijken. (C) Alle resulterende levensvatbare volwassen vlinders zullen worden vrijgegeven in de gescreende vlucht kooi om een succesvolle copulatie veilig te stellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 10: Volwassen mannelijke vlinder met succes uitvoegen van pop op een golfplaten papier vierkant. (A) Volwassen uitvoegen van poppen. (B) Volwassene volledig verwijderd uit de popbehuizing. (C) Volwassene gepositioneerd om zijn vleugels uit te breiden. (D) Volwassene breidt zijn vleugels uit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 11: Vijfde instar larve gemarkeerd met niet-toxische lichtgevende verf. (A) Een kleine druppel contrasterende rode, niet-toxische lichtgevende verf wordt geplaatst op de dorsum met behulp van een penseel om met succes de larve markeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 12: Opfokopstelling voor levensgeschiedenisstudie. (A) Uniek geëtiketteerd 2 ounce plastic plastic portiebekers. (B) In elke beker wordt één larve afgezonderd. (C) Alle larven worden individueel gevolgd door alle ontwikkelingsstadia, van neonaat tot volwassen vlinder. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 1: Aantal geregistreerde paren in copula op basis van temperatuur (°C) binnen een inloop, afgeschermde vluchtkooi gehuisvest in een temperatuurgecontroleerde kas. De temperatuur werd geregistreerd binnen de eerste 2 min van een succesvol koppelevenement (n = 411). De resulterende gegevens werden gebruikt om de gecontroleerde milieuomstandigheden te helpen verfijnen om het paringssucces en uiteindelijk de algehele productiviteit van de gevangenschap te maximaliseren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Gemiddelde ontwikkelingstijd (aantal dagen) van elke onvolwassen levensfase. (A) Balken tonen het gemiddelde van elke groep en foutbalken vertegenwoordigen de bovenste en onderste standaarddeviatiewaarden voor elke groep. (B) Donkerblauwe staven vertegenwoordigen vrouwtjes, en lichtblauw vertegenwoordigen mannetjes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Hoofdcapsules verzameld van individuele #25 met behulp van levensgeschiedenis protocol. Hoofd capsules werden gefotografeerd door Johnathan Bremer met behulp van een automontage systeem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Levenspodium | Gemiddelde lichaamslengte (mm) | Std. Fout (lengte) | Gemiddelde ontwikkelingstijd (num. dagen) | Std. Fout (dev. tijd) |
| Instar I | 1.69478261 (n=23) | 0.02152643 | 2.90625 (n=32) | 0.08229783 |
| Instar II | 2.77248958 (n=32) | 0.04302826 | 3.375 (n=32) | 0.16649857 |
| Instar III | 5.45751042 (n=32) | 0.12120829 | 3.5 (n=32) | 0.20080483 |
| Instar IV | 10.2369688 (n=32) | 0.23653991 | 3.875 (n=32) | 0.18917265 |
| Instar V | 8.7625 (n=2) | 2.6125 | 1.5 (n=2) | 0.5 |
| Instar VI | 10.2666667 (n=1) | NA | 3 (n=1) | NA |
| Pre-pop | 11.0858333 (n=24) | 0.23948251 | 2.9375 (n=32) | 0.21504641 |
| Pop | 9.0316129 (n=31) | 0.12106792 | 11.6578947 (n=38) | 0.3272288 |
Tabel 1: Gemiddelde lengte en ontwikkelingstijd van elke levensfase. Standaardfout voor elke variabele en steekproefgrootte tussen haakjes.
| Levenspodium | Gemiddelde vleugelakkoordlengte (mm) | Std. Fout |
| Volwassen | 12.63895 (n=38) | 0.1365516 |
| Vrouwelijke | 12.960 (n=13) | 0.1465588 |
| Mannelijke | 12.472 (n=25) | 0.1863205 |
Tabel 2: Gemiddelde voorvleugelakkoordlengte voor volwassen vlinders. Omvat middelen voor vrouwen, mannen en alle volwassenen (beide geslachten gecombineerd).
| LM Model 1 | Std. Schattingsfout | t waarde | p-waarde |
| Onderscheppen | 1.9179 | 3.128 | 0.0046 ** |
| Avg. lengte tweede instar | 0.6822 | -1.11 | 0.278 |
| Avg. lengte derde instar | 0.2928 | 0.476 | 0.6381 |
| Avg. lengte vierde instar | 0.1373 | -0.57 | 0.5739 |
| Avg. lengte poppen | 0.246 | 3.957 | 0.0005 *** |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. | |||
Tabel 3: Coëfficiëntentabel voor lineair regressiemodel (LM Model 1) om de relatie tussen de gemiddelde lengte van elke levensfase (n > 30 opgenomen in de analyse) en de lengte van het vleugelakkoord voor volwassenen te evalueren. Afhankelijke variabele: volwassen vleugelakkoordlengte (mm).
| Coëfficiënten | Std. Schattingsfout | t waarde | Pr (>|t|) |
| Onderscheppen | 1.7091 | 3.031 | 0.0053 ** |
| Avg. lengte poppen | 0.1878 | 4.414 | 0.0002 *** |
Tabel 4: Stapsgewijze regressie (Stapsgewijs 1). Afhankelijke variabele: volwassen vleugelakkoordlengte (mm).
| LM Model 2 | Std. Schattingsfout | t waarde | p-waarde |
| Onderscheppen | 1.1888 | 12.643 | 4.21e-12 *** |
| Num. dagen eerste instar | 0.3486 | 0.937 | 0.3583 |
| Num. dagen tweede instar | 0.2603 | -0.686 | 0.4993 |
| Num. dagen derde instar | 0.2281 | 1.028 | 0.3141 |
| Num. dagen vierde instar | 0.2048 | 2.378 | 0.0257 * |
| Num. dagen pre-pupae | 0.222 | 1.133 | 0.2686 |
| Num. dagen poppen | 0.2495 | 0.616 | 0.5435 |
| Totaal aantal. dagen | 0.1913 | -1.454 | 0.1589 |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. | |||
Tabel 5: Coëfficiëntentabel voor lineair regressiemodel (LM Model 2) om de relatie tussen ontwikkelingstijd en de lengte van het vleugelakkoord voor volwassenen te evalueren. Afhankelijke variabele: volwassen vleugelakkoordlengte (mm).
| Coëfficiënten | Std. Schattingsfout | t waarde | p-waarde |
| Onderscheppen | 0.89304 | 16.314 | 7.86e-16 *** |
| Num. dagen tweede instar | 0.17974 | -1.809 | 0,0811 • |
| Num. dagen vierde instar | 0.16917 | 2.075 | 0.0473 * |
| Totaal aantal. dagen | 0.04184 | -1.787 | 0,0848 • |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05; • p < 0,1 | |||
Tabel 6: Stepwise regressie (Stepwise 2) voor ontwikkelingstijd. Afhankelijke variabele: volwassen vleugelakkoordlengte (mm).
Discussion
Hier illustreren we de effectiviteit van dit bewezen ex situ conservation breeding protocol voor massaproductie van risicovlinders, en hoe het kan worden aangepast voor wetenschappelijk onderzoek om belangrijke gedrags-, levensgeschiedenis- of ecologische gegevenshiaten aan te pakken. Meer begrip van de gemiddelde totale ontwikkelingstijd (ei tot volwassene), gemiddelde duur in elke levensfase, en optimale temperatuur voor paring, bijvoorbeeld, werden gebruikt om te helpen verfijnen van het protocol en verbeteren van het totale programma succes. De overgrote meerderheid van de bestaande protocollen detail alleen organisme veeteelt methoden en niet bespreken gegevensverzameling, wetenschappelijk onderzoek, of het gebruik van dergelijke resultaten te helpen informeren en mogelijk aan te passen ex situ methoden.
Dit protocol vereist dagelijkse organismeveeteelt. De gezondheid en productiviteit van het organisme worden gemaximaliseerd door schone opfokomstandigheden, een gebrek aan overbevolking van organismen en de beschikbaarheid van hoogwaardig larvegastheerplantaardig materiaal. Voor het grootste deel maken we gebruik van wegwerp opfokbenodigdheden en containers (bijvoorbeeld papieren en plastic bekers) en vervangen we ze meestal regelmatig, vaak dagelijks, en hergebruiken we het materiaal nooit. Dit is zowel kosteneffectief als minimaliseert de behoefte aan meer arbeidsintensieve sanitaire voorzieningen van materialen. Veelgebruikte gereedschappen, zoals entomologische tangen, aquarel verf borstels, en kleine pop-up vlucht kooien, evenals alle opfokoppervlakken zoals tafelbladen en laboratorium bankbladen worden regelmatig ontsmet met behulp van een 5% bleekmiddel oplossing. Het exacte schema van sanitaire voorzieningen is sterk afhankelijk van de frequentie van het gebruik, de fenologie van het organisme en andere variabelen, en moet worden afgestemd op de specifieke behoeften van elk ex situ-programma. Bovendien vinden we dat wit slagerspapier nuttig is om alle opfokoppervlakken te bedekken. Het biedt een goedkoop, gemakkelijk inzetbaar schoon substraat, en de witte achtergrondkleur vergemakkelijkt het waarnemen van verdwaalde organismen. Voor de dagelijkse veehouderij moet al het laboratoriumpersoneel altijd wegwerplaboratoriumexamenhandschoenen dragen om besmetting te minimaliseren en personeel te beschermen tegen mogelijke huidirritatie als gevolg van de behandeling van planten of organismen. Dit is vooral van cruciaal belang als een laboratorium personeel hebben huisdieren die actuele vlooienbehandelingen vereisen. Zelfs een kleine hoeveelheid actief ingrediëntresidu kan gevaarlijk zijn voor vee in gevangenschap.
Daarnaast moet ervoor worden gezorgd dat de overbevolking van organismen tot een minimum wordt beperkt. Overbevolking van larven kan snel leiden tot verminderde gezondheid van het organisme en zelfs kannibalisme in bepaalde taxa, met name Lycaenidae. Het regelmatig scheiden van larven om getallen in opfokcontainers te verminderen en/of zelfs individuele larven te isoleren zoals beschreven in het levensgeschiedenisgedeelte van het protocol kan nodig zijn. De ideale aantallen per container kunnen aanzienlijk variëren op basis van de specifieke taxon en verschillende ex situ programma beperkingen zoals beschikbare begroting, laboratoriumfaciliteiten, en het totale aantal manpersoneel. We raden ook aan om voldoende ruimte te laten tussen cups waarin larven worden ondergebracht om het potentieel van de beweging van organismen tussen containers te minimaliseren. Ten slotte wordt het voor grotere populaties in gevangenschap ten zeerste aanbevolen om de voorraad te scheiden tussen een of meer laboratoriumfaciliteiten. Deze vrijwaringsstrategie kan helpen bij het minimaliseren van catastrofaal verlies van de gehele bevolking als gevolg van ziekte of andere onvoorziene effecten.
Larve gastheer plant kwaliteit en beschikbaarheid drijft de veehouderij en sterk van invloed op zowel larve ontwikkeling tarieven en de algehele gezondheid van de bevolking. Niettemin, weinig gepubliceerde rapporten of studies wijzen op deze backstage eis of bespreken beste kwekerij praktijken. Succesvolle ex situ programma planning moet rekening houden met voldoende hoeveelheden installaties, productie en onderhoud. Aangezien veel larven ook bepaalde plantendelen vereisen of verkiezen (bijvoorbeeld terminale nieuwe groei, bloemknoppen en bloeiwijzen, fruit, enz.), is effectieve enscenering vereist om een passende plantenfenologie te garanderen.
Aanvullende overwegingen omvatten een passend demografisch en genetisch beheer en het minimaliseren van eventuele negatieve effecten van gevangenschap. Wij raden de ontwikkeling van een genetisch beheersplan aan. Dit kan strategieën omvatten om de infusie van nieuw genetisch materiaal op regelmatige basis op te nemen, de diversiteit te maximaliseren en nauwe inteelt te voorkomen, periodiek belangrijke fitnessvariabelen voor organismen te evalueren en de genetica op een bepaald niveau te monitoren om vergelijking met bestaande populaties mogelijk te maken en de gezondheid van de interne voorraad te controleren. Periodieke vergelijking van de kenmerken van in gevangenschap levende personen met personen uit de oprichtende bevolking is ook gerechtvaardigd34,35.
Deze protocollen vertegenwoordigen bewezen best practices. Ze moeten gunstig zijn voor een verscheidenheid van onderzoekers en beschermers die direct kunnen toepassen of aanpassen van onze methoden om hun eigen studies en ex situ at-risk vlinder of insect behoud en herstel programma's. De specifieke geschetste captive breeding protocol is waarschijnlijk het meest van toepassing op programma's gericht op andere Lycaenidae, gerelateerde taxa, of kleinere grootte taxa. Niettemin, tal van componenten, zoals die waarbij het veiligstellen van succesvolle verkering en copulatie, volwassen onderhoud met kunstmatige nectar, het maximaliseren van ovipositie, en algemene larve zorg aantoonbaar meer in het algemeen kunnen worden toegepast of aangepast aan een bredere array van taxa. Zoals eerder vermeld, kan de toegang tot andere gevestigde methoden, hoewel eerder vermeld, waardevolle inzichten en een levensvatbaar vertrekpunt voor aanpassing en innovatie helpen. De methoden gepresenteerd voor de beoordeling van verschillende levensgeschiedenis kenmerken zoals larve ontwikkelingstijd en het aantal larve stadia aantoonbaar heeft een brede toepasbaarheid op andere instandhouding fokprogramma's en at-risk taxa. We moedigen anderen aan om belangrijke ecologische gegevenshiaten waar mogelijk aan te pakken en om doorgelicht protocollen en programmaresultaten te publiceren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Conservation Recovery Initiative (F17AP00467) van de U.S. Fish and Wildlife Service (F17AP00467) en het Disney Conservation Fund. Extra ondersteuning werd geboden door het Florida Museum of Natural History en de afdeling Entomologie en Nematologie aan de Universiteit van Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 oz plain white paper cups (Karat) | Lollicup | C-KC16 | |
| 15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer | Lowes | UTTNI2423 | |
| 1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm) | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 2 oz clear plastic portion cup lids | Party City | #791091 | |
| 2 oz Clear Plastic Portion Cups | Party City | #791088 | |
| 34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage | Bioquip | 1466BV | |
| 8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light | Lowes | PTC301L | |
| Adoric Electronic Digital Caliper | Amazon.com | B07QX2SK2F | |
| Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes | Walmart | #10965135 | |
| Clear Plastic Cup Tray | Frontier Scientific Services | AG_9040 | |
| Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer | Fisher Scientific | 15-077-8D | |
| Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless | BioQuip | 4531 | |
| Humco Glycerin 6 oz | Walmart | #303951037966 | |
| Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram | Bioquip | 1166A | |
| Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink | Walmart | #568456137 | |
| Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer | Amazon.com | NTK026 | |
| Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile | Amazon.com | 24-272C | |
| Plastic Tank Sprayer | Lowes | #5318 | |
| Q-tips Cotton swabs | Walmart | #551398298 | |
| Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid) | Walmart | #554320171 | |
| Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip | Amazon.com | #787793151378 | |
| Single face corrugated paper roll | Amazon.com | BXSF12 | |
| Snap blade utility knife | OLFA | #5023 | |
| Solo 9 oz plastic cups | Solo | SQ950 | |
| Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.) | Thorton Plastics | #50 | |
| Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black | Jo Ann Fabrics | #16029696 | |
| Zep 32 oz Plastic Spray Bottle | Lowes | HDPRO36 |
References
- Thomas, J. A. Butterfly communities under threat. Science. 352 (6296), 216-218 (2016).
- Swengel, S. R., Schlicht, D., Olsen, F., Swengel, A. B. Declines of prairie butterflies in the Midwestern USA. Journal of Insect Conservation. 15 (1-2), 327-339 (2011).
- Habel, J. C., et al. Butterfly community shifts over two centuries. Conservation Biology. 30 (4), 754-762 (2016).
- Gilburn, A. S., et al. Are neonicotinoid insecticides driving declines of widespread butterflies? Peer J. 3, e1402 (2015).
- Sánchez-Bayo, F., Wyckhuys, K. A. G. Worldwide decline of the entomofauna: A review of its drivers. Biological Conservation. 232, 8-27 (2019).
- Daniels, J. C., Magdich, M., Tolson, P. Butterfly recovery planning: Determining how to contribute. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 1-21 (2015).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Environmental Conservation Online System. Listed Animals. , https://ecos.fws.gov/ecp (2019).
- Schultz, C. B., Russell, C., Wynn, L. Restoration, reintroduction and captive propagation efforts for at-risk butterflies: a review. Israel Journal of Ecology and Evolution. 54, 41-61 (2008).
- Grow, S., Allard, R., Luke, D. The role of AZA-accredited zoos and aquariums in butterfly conservation. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 23-34 (2015).
- Crone, E. E., Pickering, D., Schultz, C. B. Can captive rearing promote recovery of endangered butterflies? An assessment in the face of uncertainty. Biological Conservation. 139, 103-112 (2007).
- Sanchez, S. J., Daniels, J. C. The butterfly conservation initiative: Developing a new conservation vision through compound eyes. News of the Lepidopterists' Society. 49 (3), 75-77 (2007).
- Wardlaw, J. C., Elmes, G. W., Thomas, J. A. Techniques for studying Maculinea butterflies: I. Rearing Maculinea caterpillars with Myrmica ants in the laboratory. Journal of Insect Conservation. 2 (1), 79-84 (1998).
- Mattooni, R., Longcore, T., Krenova, Z., Lipman, A. Mass rearing the endangered Palos Verdes blue butterfly (Glaucopsyche lygdamus palosverdesensis:Lycaenidae). Journal of Research on the Lepidoptera. 37, 55-67 (1998).
- Pearce-Kelly, P., et al. The captive rearing of threatened Orthoptera: a comparison of the conservation potential and practical considerations of two species' breeding programmes at the Zoological Society of London. Journal of Insect Conservation. 2 (3-4), 201-210 (1998).
- Wells, C. N., Edwards, L., Hawkins, R., Smith, L., Tonkyn, D. A rearing method for Agrynnis (Speyeria) diana (Lepidoptera: Nymphalidae) that avoids diapause. Psyche. , 1-6 (2011).
- Grosboll, D. N. Captive Rearing the Endangered Mardon Skipper (Polites mardon) and Taylor's Checkerspot (Euphydryas editha taylori) Butterflies: Initial Results (Lepidoptera, Nymphalidae). Proceedings of the species at risk, pathways to recovery conference. , Species at Risk Pathways to Recovery Conference Organizing Committee. Victoria. 1-6 (2004).
- Barclay, E., Arnold, M., Andersen, M., Shepherdson, D. Husbandry manual: Taylor's checkerspot (Euphydryas editha taylori). , 1st edition, Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2009).
- Johnson, J., et al. Captive Rearing of the Laguna Mountains Skipper (Pyrgus ruralis laguanae): Final Report. , (2010).
- Linders, M. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot in South Puget Sound: 2011-2012. 2012 Annual Progress Report to the ACUB Technical Review Committee. , (2012).
- Linders, M., Lewis, K. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot butterfly (Euphydryas editha taylori.): South Puget Sound, Washington, 2012–2013. 2013 Annual Report to the US Fish and Wildlife Service (Cooperative Agreement F12ACI00835), Joint Base Lewis-McChord Fish and Wildlife Program and JBLM-ACUB Technical Review Committee. , (2013).
- Department of Conservation and Research, Toledo Zoo. Propagation Handbook for the Karner Blue Butterfly Lycaeides melissa samuelis. , Fourth edition, (2006).
- Johnson, J. J., et al. Captive Rearing of Lange's Metalmark Butterfly, 2011-2015. United States Fish and Wildlife Service, CVPIA Habitat Restoration Program (F11AP00168). , (2016).
- Andersen, M. J., et al. Oregon Silverspot Butterfly Husbandry Manual. , Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2010).
- Washington Department of Fish and Wildlife. Threatened and Endangered Wildlife in Washington: 2012 Annual Report. Listing and Recovery Section, Wildlife Program, Washington Department of Fish and Wildlife. , Olympia. (2013).
- McGowan, P. J. K., Traylor-Holzer, K., Leus, K. IUCN guidelines for determining how ex situ management should be used in species conservation. Conservation Letters. 10 (3), 361-366 (2017).
- Pearce-Kelly, P., et al. The conservation value of insect breeding programmes: Rationale, evaluation tools and example programme case studies. Insect Conservation Biology: Proceedings of the Royal Entomological Society's 23nd Symposium. Stuart, A. J. A., New, T. R., Lewis, O. T., et al. , 57-75 (2007).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Policy Regarding Controlled Propagation of Species Listed Under the Endangered Species Act. United States Federal Register. 65 (183), 56916-56922 (2000).
- IUCN/SSC. Guidelines on the use of ex situ management for species conservation. Version 2.0. IUCN Species Survival Commission. , Gland, Switzerland. (2014).
- Sutherland, W. J., Pullin, A. S., Dolman, P. M., Knight, T. M. The need for evidence-based conservation. Trends in Ecology & Evolution. 19 (6), 305-308 (2004).
- Daniels, J. C., Nordmeyer, C., Runquist, E. Improving standards for at-risk butterfly translocations. Diversity. 10, 67 (2018).
- Saarinen, E. V. Population genetics of the endangered Miami blue butterfly Cyclargus thomasi bethunebakeri.: implications for conservation. , University of Florida. Gainesville. (2009).
- Becker, T. Propagation and repatriation of the regal fritillary butterfly. , http://titag.org/2016/2016papers/beckerregal.pdf (2019).
- R Core Team. R A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2016).
- Schultz, C. B., Dzurisin, J. D., Russell, C. Captive rearing of Puget blue butterflies (Icaricia icarioides blackmorei) and implications for conservation. Journal of Insect Conservation. 13 (3), 309-313 (2009).
- Frankham, R., Loebel, D. A. Modeling problems in conservation genetics using captive Drosophila populations: Rapid genetic adaptation to captivity. Zoo Biology. 11 (5), 333-342 (1992).
