Laser Capture Microdissectie en Microfluidic qPCR combineren om transcriptieprofielen van enkele cellen te analyseren: een systeembiologiebenadering voor opioïdenafhankelijkheid

Sean J. O'Sullivan; Beverly  A.S. Reyes; Rajanikanth Vadigepalli; Elisabeth  J. Van Bockstaele; James  S. Schwaber

doi:10.3791/60612

Method Article

Laser Capture Microdissectie en Microfluidic qPCR combineren om transcriptieprofielen van enkele cellen te analyseren: een systeembiologiebenadering voor opioïdenafhankelijkheid

DOI:

10.3791/60612

⸱

March 8th, 2020

Sean J. O'Sullivan¹^,² , Beverly A.S. Reyes³ , Rajanikanth Vadigepalli¹ , Elisabeth J. Van Bockstaele³ , James S. Schwaber¹

¹Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, ²Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, ³Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol legt uit hoe je enkele neuronen, microglia's en astrocyten verzamelt uit de centrale kern van de amygdala met hoge nauwkeurigheid en anatomische specificiteit met behulp van lasercapture microdissectie. Daarnaast leggen we ons gebruik van microfluïdeRT-qPCR uit om een subset van het transcriptome van deze cellen te meten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diepgaande transcriptie heterogeniteit in anatomisch aangrenzende enkele cellen suggereert dat robuuste weefselfunctionaliteit kan worden bereikt door cellulaire fenotype diversiteit. Eencellige experimenten die de netwerkdynamiek van biologische systemen onderzoeken, tonen cellulaire en weefselreacties aan op verschillende omstandigheden bij biologisch zinvolle resolutie. Hierin leggen we onze methoden voor het verzamelen van enkele cellen uit anatomisch specifieke locaties uit en het nauwkeurig meten van een subset van hun genexpressieprofielen. We combineren lasercapture microdissectie (LCM) met microfluïde omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreacties (RT-qPCR). We gebruiken ook dit microfluïde RT-qPCR-platform om de microbiële overvloed aan darminhoud te meten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het meten van de genexpressieprofielen van enkele cellen heeft uitgebreide fenotypische heterogeniteit in een weefsel aangetoond. Deze complexiteit heeft ons begrip van de biologische netwerken die weefselfunctie regelen, gecompliceerd. Onze fractie en anderen hebben dit fenomeen in vele weefsels en omstandigheden^{onderzocht 1}^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. Deze experimenten suggereren niet alleen dat regulering van genexpressienetwerken ten grondslag ligt aan een dergelijke heterogeniteit, ma....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van Animal Care and Use Committee (IACUC) van Thomas Jefferson University en Drexel University College of Medicine. Het protocol werd goedgekeurd door de Thomas Jefferson University en Drexel University College of Medicine IACUC.

1. Diermodel

Voeg twee 75 mg slow-release morfine sulfaat pellets of twee placebo pellets onderhuids bij volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten.
1. Gebruik een jurk en handschoenen op de juiste manier voor kleine steriele chirurgie. Scheer de rat dorsum met tondeuse indien nodig.
2. Breng vetzalf aan op de ogen van het di....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De selectie van de enkele cellen werd zowel visueel als moleculair gevalideerd. Visueel werd cellulaire morfologie bekeken voordat de celverzameling werd gevisualerd. Cellen verzameld werden vervolgens bekeken op de QC station en de cellulaire kernen vlek (DAPI) overlapte met de single cell selection marker fluorescentie. Figuur 2A toont representatieve beelden van een dia met gezoomde rattenvoorhersenen met de CeA. Latere afbeeldingen

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eencellige biologie heeft aangetoond dat de heterogeniteit van cellulaire fenotypes en robuustheid van weefselfunctie. Deze bevindingen hebben inzicht gegeven in de organisatie van biologische systemen op zowel macro- als microschalen. Hier beschrijven we de combinatie van twee methoden, LCM en microfluïsche qPCR, om single-cell transcriptome maatregelen te verkrijgen die anatomische specificiteit en transcriptienauwkeurigheid tegen relatief lage kosten bieden (figuur 1). Onze groep hanteert.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde werk werd gefinancierd door NIH HLB U01 HL133360 toegekend aan JS en RV, NIDA R21 DA036372 toegekend aan JS en EVB, en T32 AA-007463 toegekend aan Jan Hoek ter ondersteuning van SJO's.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-48.48	NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β Antibody	Genway Biotech	CCEC48	Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis buffer solution components
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Sample Extraction Device	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube	ThermoFisher Scientific	N8010611
GFAP Monoclonal Antibody	ThermoFisher Scientific	A-21294	Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A28175	Seconadry Antibody
IFC Controller	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher Scientific	11754250	Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Laser Capture Microdissectie en Microfluidic qPCR combineren om transcriptieprofielen van enkele cellen te analyseren: een systeembiologiebenadering voor opioïdenafhankelijkheid

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles