Summary
여기서, 2개의 뮤린 상처 치유 모델이 기술되고, 하나는 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 평가하기 위해 고안되고 다른 하나는 상처 폐쇄의 속도를 정량화하도록 설계된다. 이 방법은 가난한 상처 치유의 각종 양상에 의하여 기계장치를 결정하기 위하여 당뇨병과 같은 복잡한 질병 모형으로 이용될 수 있습니다.
Abstract
상처 치유는 염증, 과립 조직 형성, 섬유증 및 분해의 질서 정연한 진행을 필요로하는 복잡한 과정입니다. Murine 모델은 이러한 프로세스에 대한 귀중한 기계적 통찰력을 제공합니다. 그러나 상처 치유 반응의 모든 측면을 완전히 해결하는 단일 모델은 없습니다. 대신 여러 모델을 사용하여 상처 치유의 다양한 측면을 해결하는 것이 이상적입니다. 여기서, 상처 치유 반응의 다양한 양상을 해결하는 두 가지 다른 방법이 설명된다. 첫 번째 모델에서, 폴리 비닐 알코올 스폰지는 피하 마우스 dorsum을 따라 이식된다. 스폰지 검색 다음, 세포는 기계적 중단에 의해 분리 될 수 있으며, 유체는 원심 분리에 의해 추출 될 수있다, 따라서 급성 상처 환경에서 세포 및 사이토 카인 반응의 상세한 특성을 허용. 이 모델의 한계는 상처 폐쇄 속도를 평가할 수 없다는 것입니다. 이를 위해 꼬리 피부 절제 모델이 활용됩니다. 이 모델에서는 꼬리 의 기저부 근처의 등쪽 표면을 따라 10mm x 3mm 직사각형 의 꼬리 스킨 조각을 절제합니다. 이 모델은 치부 분석을 위해 쉽게 촬영하여 치유 속도를 결정할 수 있으며 조직학적 분석을 위해 절제될 수 있습니다. 설명된 두 방법 모두 유리하게 변경된 마우스 긴장에서 이용될 수 있습니다, 또는 상처 치유 기계장치를 해명하기 위하여 당뇨병, 노화, 또는 이차 감염과 같은 comorbid 조건의 모형과 함께.
Introduction
상처 치유 과정을 검사할 수 있는 많은 뮤린 모델 시스템이 있으며, 각각 특정 한 장점과 한계를 가지고1,,2. 다음 방법은 두 개의 뮤린 상처 모델을 제시하며, 각 모델은 상처 치유 반응의 특정 측면을 다루고 부상에 대한 반응에서 교란의 원인과 효과를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 상처 치유 과정은 별개의 단계에서 발생합니다. 첫 번째 단계는 혈소판, 호중구 및 단핵구 / 대식세포의 급속한 유입뿐만 아니라 전염증성 사이토 카인 및 케모카인의 생산을 특징으로하는 염증성입니다. 염증의 해결에 따라, 환경은 profibrotic 및 proangiogenic 사이토 카인 및 성장 인자의 유도와 함께 더 회복 상태로 전환. 과립 조직은 증착되고 신혈관은 근섬유 아세포, 섬유 아세포, 상피 세포 및 내피 세포의 이동과 함께 형성됩니다. 최종 단계에서 임시 세포 외 매트릭스가 리모델링되고 흉터 형성 및 상처 폐쇄가2,3,34,45,5,66,7,,8로진행됩니다.
어떤 단일 뮤린 모델은 상처 치유의 모든 단계를 연구하는 시스템을 제공하지않습니다 2. 여기에서, 2개의 외과 상처 모형은 기술됩니다: 1개는 심각한 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 설명하고, 다른 하나는 조직학 분석 뿐만 아니라 상처 폐쇄의 평가를 허용합니다. 이들 두 가지 방법은 상처 치유 반응의 상이한 양상에 대한 섭동 또는 동반의 효과를 평가하기 위해 상호 보완적인 방식으로 사용될 수 있다. 폴리 비닐 알코올 (PVA) 스폰지의 등쪽 피하 이식은 세포 및 과립 조직반응의다양한 측면을 해명하기 위해 수십 년 동안 설치류 모델에 사용되어 왔다 시스템9,10, 11,,12,,11,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19,,20 ,21,22,23,,24. 이 접근법은 사이토카인이 풍부한 상처 액과 세포 침투를 검색할 수 있게 합니다. 이 모델에서는 1cm x 1cm x 0.5 cm 크기의 PVA 스폰지가 후방 등쪽 중간선에서 제작된 2cm 절개를 통해 피하 포켓에 넣습니다. 절개는 수술 클립으로 닫혀 있으며, 스폰지는 세포와 유체 격리를위한 이후 시점에서 검색 할 수 있습니다. 분리된 스폰지의 세포 및 사이토카인 밀리유는 약 14일 간 이식 후 급성 상처 치유의 정상적인 단계를 반영한다. 나중 시점에서 모델은 과립 조직 형성 및 이물질 반응1을연구하는 데 더 유리하다. 이 시스템을 사용하면 다른 생검 기반 방법,,,1,,22,23,25,26에서세포를 분리하는 것에 비해 자형및 기능성 세포 및 RNA 분리에 대한 뚜렷한 이점을 제공하는 >106 세포를 분리할 수 있습니다.
상처 폐쇄율은 꼬리 피부 절제 모델을 사용하여 결정됩니다. 이 모델에서, 처음에 Falanga 등에서 설명한 바와 같이 다른 사람에 의해 보고27,,28,,29,,30,꼬리 피부의 1cm x 0.3 cm 전체 두께 섹션은 꼬리의 기저 부근에서 제거된다. 상처 부위는 쉽게 시각화되고 시간이 지남에 따라 측정 할 수 있습니다. 대안적으로, 꼬리 조직은 조직학적 분석을 위해 분리될 수 있다. 이러한 접근법은 잘 확립된 등쪽 펀치 생검 방법에 대한 대안으로서 또는 이를 사용할 수 있다. 이 두 모델 사이의 주요 차이점은 상처 폐쇄율, 모피의 존재 또는 부재, 및 피부 구조22,31,,32입니다. 꼬리 피부 상처는 전체 폐쇄가 발생하기까지 약 21 일이 걸리기 때문에 상처 폐쇄를 평가하는 더 긴 기간을 제공합니다. 이것은 파니큘러스 카르누스의 작용으로 인해 주로 수축에 의해 훨씬 더 빨리 (~ 7-10 일) 치유되는 부목되지 않은 등쪽 펀치 생검에 반대합니다. 부목 등쪽 펀치 생검은 더 느리게 치유하고 수축 치유의 효과를 감소시키지만, 수축계메커니즘을제한하기 위해 이물질의 존재에 의존한다1,2,27,,30,,31,,33.,
설명된 상처 모델은 교란이 없는 정상적인 상처 치유 과정을 이해하는 데 유익합니다. 설치류 피부의 치유는 느슨한 구조, 수축성 치유에 대한 의존성 및 기타 해부학적 차이를 포함하여 인간의 피부와 매우 중요한 면에서 다르지만, 뮤린 시스템은 기계론및 선별 연구에 특정 한 이점을 제공합니다. 이들 중 가장 중요한 것은 근친 균주와 유전 돌연변이체의 가용성, 유전 적 견인성 및 낮은 비용입니다. 뮤린 연구에서 얻은 기계적 통찰력은 돼지 계통2,,31과같은 인간의 피부 치유를 보다 밀접하게 모방하는 복잡한 동물 모델로 번역될 수 있다.
안정된 상태에서 상처 치유 반응을 검사하는 것 외에도, 이러한 모델은 세포, 사이토카인 및 총 조직 수준에서 상처 치유 결함의 기초를 이해하기 위해 comorbid 조건과 결합 될 수 있습니다. 이러한 특정 환경에서는 수술 후 폐렴과 같은 특정 동반 질환 상태의 효과를 평가하기 위해 두 모델이 함께 사용될 수 있으며, 급성 세포 상처 치유 반응 및 상처폐쇄속도(30)에대한 반응도 있다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 동물 연구는 브라운 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원의 동물 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었습니다. 참고: 비디오에서는 데모 목적으로 수술용 드레이프가 생략되었습니다.
1. PVA 스폰지의 피하 이식
- 가위를 사용하여 PVA 스폰지 시트를 8mm x 8mm x 4mm 조각으로 자릅니다. 비커에 멸균 1x PBS에 담가 PVA 스폰지 조각을 다시 수화.
- 스폰지를 1x PBS로 오토클레이브하여 살균하고 완전히 식힙니다. 4 °C에서 멸균 1x PBS에 오토 클레이브 스폰지를 저장합니다.
- 외과 적 이식을 수행하기 전에, 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 멸균 배양 접시에 스폰지의 필요한 수를 aliquot. 여분의 스폰지를 멸균 1x PBS에 보관하여 향후 사용을 위해 4°C에 보관하십시오. 재수화 후 스폰지가 1cm x 1cm x 0.5cm로 팽창하도록 하십시오. 탈수 된 PVA 스폰지의 이미지는 그림 1A에표시됩니다.
참고 : 수술 부위의 멸균성을 유지하기 위해 PVA 스폰지 이식 절차는 한 개인이 마우스를 처리하고 수술 부위를 준비하고 두 번째 사람이 이식을 수행해야합니다. - 8-12주 된 남성 C57BL/6J 마우스를 복강 내 주사로 80 mg/kg 케타민을 마취시다. 관리 40 진의 mg/kg의 실 라 진 복 강 진에 대 한 진 통. 페달 반사의 손실에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 클리퍼로 도르섬을 따라 머리카락을 제거하여 수술 부위를 준비하십시오. 멸균 거즈를 사용하여 포비동 요오드 용액을 면도 부위에 2x 바르고 70 % 에탄올을 바르습니다.
- 멸균 수술 커튼위에 마우스를 놓습니다. 가열된 패드를 수술용 커튼 아래에 놓아 마우스의 핵심 온도를 유지합니다.
- 수술을 수행하기위한 멸균 수술 장갑을 착용. 집게로 기본 조직에서 등쪽 피부를 당기고 멸균 수술 가위를 사용하여 등쪽 중간선을 따라 약 2cm 앞쪽으로 꼬리를 절개하십시오. 멸균 집게로 절개를 열어 놓고, 도 1B에표시된 위치 중 하나에서 도르섬을 따라 피하 포켓을 형성하기 위해 멸균 곡선, 무딘 팁 수술 가위를 사용합니다.
- 포셉을 계속 사용하여 피부를 기본 조직에서 들어 올립니다. 멸균 수술 용 가위를 사용하여 배양 접시에 PVA 스폰지 1 개를 부드럽게 짜서 과도한 PBS를 제거하십시오. 멸균 수술 가위를 사용하여 PVA 스폰지를 한 쪽 모서리로 집어 들고 가위가 들고있는 모서리로 이어지며 1.4 단계에서 형성 된 피하 포켓에 스폰지를 놓습니다.
- 그림 1B와같이 총 6개의 스폰지를 피하 포켓에 넣고 이 과정을 5회 반복합니다.
- 절개된 등지 피부를 멸균 집게와 함께 꼬집고 두 개의 스테인리스 스틸 상처 클립으로 절개를 닫습니다.
- 각 마우스에 대한 멸균 수술 기구의 새로운 세트를 사용합니다. 또는 비드 멸균기를 사용하여 마우스 사이에 악기를 살균하십시오.
2. PVA 스폰지에서 유체의 절연
- 급성 상처 사이토 카인 밀리유를 평가하기 위해, 1-14 일 후 착상 사이에 스폰지를 분리.
- 5 mL 주사기의 배럴을 16 mL 배양 튜브에 중첩하여 유체 수집 튜브를 준비합니다.
- CO2 질식에 의해 이식된 PVA 스폰지로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구를 후.
- 수술 스테이플을 제거하고 톱니 집게로 절개를 엽니다. 가위를 사용하여 등중간선을 따라 절개를 확장합니다.
- 집게를 사용하여 피하 주머니에서 스폰지 하나를 추출하고 스폰지에 대한 압력을 최소화하기 위해주의하면서 준비된 주사기 배럴로 옮긴다. 스폰지의 표면에 부착 된 남아있는 결합 조직을 분리하십시오. 필요한 경우 가위를 사용하여 스폰지를 주변 조직에서 해부하십시오. 나머지 스폰지와 스폰지 제거 과정을 반복합니다. 스폰지가 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 상처 액을 분리하기 위해, 5 mL 주사기를 포함하는 배양 튜브를 스폰지700 x g에서 10분 동안 원심분리한다.
- 원심 분리 후 주사기와 스폰지를 버립니다. 상처액은 16 mL 배양 튜브에서 수집될 것이다. 7일째 상처로부터 채취한 유체의 대표적인 이미지는 도 1D에나와 있다. 상처 액을 -80 °C에서 장기간 보관하기 위해 깨끗한 튜브로 옮깁니다.
3. PVA 스폰지에서 세포의 격리
- 급성 상처 치유 세포 milieu를 평가하기 위해, 사이 스폰지를 수집 1-14 일 후 스폰지 이식. 이식 후 7일 후에 상처로부터 얻은 스폰지는 도 1E에나타내었다.
- 1% FBS, 1% HEPES 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 1x HBSS(+칼슘/+마그네슘/-페놀 레드)를 함유한 수집 매체를 준비하십시오.
- 15 mL 원추형 튜브에 HBSS 수집 매체의 5 mL.
- 2.2-2.4에 기재된 바와 같이 안락사된 마우스로부터 PVA 스폰지를 추출한다. 스폰지를 HBSS 수집 매체의 5 mL을 포함하는 원추형 튜브에 넣습니다.
- 스폰지와 HBSS 컬렉션 매체를 붓는 다음 80 mL 블렌더 백에 옮니다. 패들이 스폰지와 미디어를 공격할 수 있도록 패들 블렌더의 해치에서 블렌더 백을 걸어 놓습니다. 패들 블렌더의 설정을 조정하여 60초 동안 높은 높이에서 실행합니다.
- 믹서기 백에서 파이펫이 있는 15mL 원추형 튜브로 미디어를 다시 옮기고 스폰지를 가방에 넣습니다. 스폰지를 짜서 미디어를 철저히 놓습니다. 패들 블렌더의 설정을 조정하여 높은 높이에서 30s 동안 실행합니다. 블렌더 백에 5 mL의 용지를 넣고 배복 과정을 2x 반복하여 총 3개의 스폰지 세스를 시둡니다.
- 원심분리기원심은 250 x g에서 5분 동안. 세포와 적혈구의 빨간 펠릿원심 분리 후 원심 관의 바닥에 볼 수 있습니다.
- 상류를 버리고 적혈구 를 수행 : 혼합 세포 펠릿과 피펫에 dH2O의 900 μL을 추가합니다. 10x PBS의 100 μL로 중화하십시오. 튜브에 4 mL의 1x PBS를 추가하여 용해를 완전히 중화 한 다음 250 x g에서 원심 분리기를 5 분 동안 추가하십시오.
참고: 라시스 단계는 간략해야 합니다. 3-5 s 이상세포와 접촉하는 근해를 떠나는 것은 비 적혈구의 용해 귀착될 수 있었습니다. - 원심 분리 후, 적혈구가없는 상처 세포를 포함하는 백혈구 펠릿이 원엽 관의 바닥에 나타납니다. 상급체를 버리고 하류 분석을 위해 원하는 배지에 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
4. PVA 스폰지 상처에서 분리 된 선천성 백혈구의 선택적 유동 세포 분석
- 10 μg/mL 항 CD16/CD32 FcRγII/III 항체를 함유하는 차단 항체용의 25 μL에서 25 μL에서 0.5-1 x 106개의 상처 세포를 1x PBS + 1% BSA로 희석한 재중단.
참고: 모든 항체는 유세포 분석분석을 위한 최적의 농도를 결정하기 위해 적정되어야 합니다. - 얼음에 10 분 동안 차단 항체로 세포를 배양.
- PerCP-eFluor710-Ly6G의 2.5 mg/mL, FITC-Ly6C의 5 mg/mL, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, 및 eFluor660-F4-80 의 10 mg/mL을 포함하는 항체의 2x 마스터 믹스를 만듭니다. 직접 차단 항체에 인큐베이팅 세포에 항체 칵테일의 25 μL을 추가합니다.
- 빛으로부터 보호된 얼음에 20분 동안 세포를 배양합니다.
- 세포를 1x PBS로 2x 세척합니다.
- 1x PBS에서 1:1,000희석된 아민 반응성 생존가능 성염염-eFluor506의 마스터 믹스를 만드십시오. 생존성 염료 용액의 50 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
참고: 혈청은 내인성 단백질에 염료의 결합을 방지하기 때문에 고정 가능한 생존 단계에서 제외되어야 합니다. 빛으로부터 보호된 얼음에 20분 동안 세포를 배양합니다. - 세포를 1x PBS로 2x 세척합니다. 1% 파라포름알데히드의 50 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단시다.
- 빛으로부터 보호된 얼음에 15분 동안 1% 파라포름알데히드로 세포를 배양합니다.
- 세포를 1x PBS로 1x 세척하고 유세포 분석분석을 위해 1x PBS로 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
5. 꼬리 피부 절제
- 8-12주 된 남성 C57BL/6J 마우스를 복강 내 주사로 80 mg/kg의 케타민을 마취시다. 관리 40 진의 mg/kg의 실 라 진 복 강 진에 대 한 진 통. 페달 반사의 손실에 의해 마취의 깊이를 확인합니다.
- 무균 거즈를 사용하여 마취 된 마우스의 꼬리에 수술 부위를 준비하고 povidone-요오드 용액을 2 x 적용한 다음 70 % 에탄올을 한 번 적용합니다.
- 미리 만들어진 템플릿에서 추적하는 영구 마커를 사용하여 꼬리의 등쪽 표면에 10 mm x 3 mm 섹션을 정의하고 꼬리의 기저부로부터 10mm(그림1C)를정의합니다.
- 마취 된 마우스를 멸균 수술 커튼에 놓습니다.
- 수술 절차를 수행하기 위해 멸균 수술 장갑을 착용하십시오. 멸균 메스 블레이드를 사용하면 상처 부위의 오른쪽, 아래 및 왼쪽 가장자리를 따라 전체 두께절개를 합니다.
- 멸균 집게를 사용하여 절제된 피부를 꼬리에서 벗겨내고 멸균 수술 용 가위를 사용하여 상처 부위의 위쪽 가장자리를 잘라냅니다.
- 출혈을 막기 위해 멸균 거즈로 압력을 가하십시오.
- 상처 부위에 스프레이 배리어 필름을 적용합니다.
- 일정한 시간 간격으로 고정 된 거리에서 상처를 촬영하십시오. 평면 분석으로 사진을 분석하여 상처 영역 측정을 결정합니다. 또는 캘리퍼스를 사용하여 상처 길이 및 너비 측정을 얻습니다.
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Representative Results
PVA 스폰지 이식 다음 전신 염증 반응
PVA 스폰지 이식 수술은 상처 후 1일 동안 플라즈마에서 IL-6의 유도에 의해 입증된 바와 같이 전신 염증 반응을일으켰다(도 2A). TNF-α 및 IL-1β를 포함하는 다른 전염증성 사이토카인뿐만 아니라 CCL2 및 CXCL1을 포함하는 케모카인의 배열은 PVA 후 7일 동안 전세포증으로 유도되었고, 다른 곳에서26,,30을기재하였다.
PVA 스폰지 상처에서 세포와 액체의 격리
PVA 스폰지 상처 모델의 주요 장점은 급성 세포 상처 치유 반응의 현상형 및 기능 분석을위한 충분한 세포를 복구 할 수있는 능력이다. PVA 스폰지 상처로부터 회복 될 수있는 세포의 수는 상처 당일 1 x 10 6 에서 8 x 106 세포에 상처 당일 1 x10 6 세포 당 약 2 x 106 세포에서 시간이 지남에 따라 증가합니다(그림 2B). 셀 수는 7일째 를 넘어 계속 증가하고 있습니다. 스폰지가 콜라겐에 의해 완전히 캡슐화되고 시스템이 급성 상처 치유 반응을 모델링에서 이물질 육아종1,,22,,23,,25,,26을모델링하는 것으로 전환되기 때문에 ~14 일 이후에도이 모델을 계속하지 않는 것이 좋습니다. 호중구, 단핵구 및 대식세포는 PVA 스폰지 상처에서 1 차적인 세포 침투물이었습니다. 호중구는 상처 후 하루 동안 상처 세포 밀리우를 지배하노며, 유동 세포 측정 분석에 의해 평가되었다(도2C). 단핵구 및 단핵구 유래 대식세포는 스폰지 이식 후 3일 이내에 축적되고, 3세포 집단은 시간이 지남에 따라 증가하였다(도2C). 호중구, 단핵구 및 대식세포 집단을 식별하기 위한 대표적인 유동 세포분석 게이팅 전략이 도 2D에나타내고 있다. FSC-H 및 SSC-H 파라미터를 사용하여 세포 이슬을 배제한후(도 2D, i 및 ii),생존불가능한 세포는 아민 반응성 고칠 성 생존성 염료(여기에 도시된) 또는 핵산 염료(예를 들어, 시톡스 또는 프로피듐 요오드화물)를 사용하여 배제하였다(도2D, iii). 이전의 게이팅 단계에 의해 제거되지 않은 잔류 세포 파편은 FSC-A 및 SSC-A 파라미터를 사용하여 배제하였다(도2D, iv). 조혈 세포는 PVA 스폰지 상처 세포의 대부분을 구성하고 CD45 발현에 의해 확인되었다(도 2D, v). 호중구는 Ly6G+시글렉-F– (도 2D, vi)로확인되었다. 시갈-F++ 세포는 주로 호산구(도2D, vii)였다. Ly6G에 게이팅–시글렉-F– 세포, 단핵구/대식세포는 F4/80+ 세포로 확인되었다(도 2D, viii). F4/80+ 세포는 Ly6Chi 염증 단핵구(도2D, ix)와Ly6C저단핵구 유래 대식세포(도2D, x)26을구별하기 위해 Ly6C 발현에 의해 더 분별될 수 있었다.
사이토카인 및 기타 상처 수용성 인자를 측정하는 능력은 PVA 스폰지 상처 모델의 또 다른 장점입니다. 스폰지 당 최대 100 μL의 유체를 추출 할 수 있습니다. 추출된 유체는 다양한 하류 검사에 적합합니다. ELISA 또는 비드 계 멀티플렉스 면역분석에 의한 초기 및 후기 상처 유체에서 사이토카인 및 케모카인의 검출은 다른 곳에서26,,30에서보고되었다. 동일한 상처에서 세포와 체액을 모두 얻을 수 있습니다. 이렇게하려면, 세포 격리를위한 등쪽 중간선의 한쪽에서 세 개의 스폰지와 유체 추출을위한 등쪽 중간선의 반대쪽에서 3 스폰지를 분리하는 것이 좋습니다.
꼬리 피부 절제 모델을 이용한 상처 폐쇄 평가
절제 꼬리 피부 모델은 조밀한 모피가 결여된 단단한 피부에서 느린 상처 폐쇄를 연구하는 등지 피부 펀치 생검 방법에 대한 대안을 제공합니다. 1, 7 및 15일 후 절제 후 꼬리 피부 상처의 예상은 도 3A에도시되어 있다. 상처 폐쇄는 시간이 지남에 따라 상처 침대의 면적을 측정하여 정량화 될 수있다. 7일째 및 15일째 상처 층 부위는 각각 약 70% 및 35%, 1일째 상처부위(도 3B)였다. 전체 상처 폐쇄는 약 28 일이 필요합니다. 꼬리 피부 상처는 조직학적 분석에 의해 단면에서 관찰될 수도 있습니다. 그림 3C와 그림 3D는 각각 H&E와 마슨의 삼조염색 꼬리 단면의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 절제된 피부의 측면 여백은 꼬리의 등쪽 표면에 화살촉으로 표시됩니다.
그림 1: 뮤린 상처 치유 모델의 개략적. (A)측면(왼쪽) 및 상단(오른쪽) 8 mm x 8mm x 0.4 mm를 측정하는 탈수 PVA 스폰지의 보기(B)등쪽 중간선 절개(중앙 빨간색 선)와 피하 포켓에 6 개의 1cm x 1cm x 0.5cm PVA 스폰지의 배치를 보여주는 마우스의 그림. (C)꼬리의 등쪽 표면에 절제 피부 상처 (10mm x 3mm 빨간 직사각형)의 크기와 배치를 보여주는 회로도. (D)이식 후 7일 후에 피하 공간에서 회수된 3개의 스폰지로부터 분리된 상처 액을. (E)이식 후 7일 후에 상처에서 회수된 스폰지의 출현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: PVA 스폰지 이식에 대한 전신 및 세포 반응. (a)혈장에서 IL-6 수준의 시간 과정은 PVA 스폰지 이식이 전신 염증 반응을 유도한다는 것을 보여준다. IL-6의 농도는 멀티플렉스 비드 계 면역분석액을 사용하여 측정되었다. (B)PVA 스폰지 상처에서 분리 된 세포의 수는 시간이 지남에 따라 증가했다. (C)시간 과정은 시간이 지남에 따라 PVA 스폰지 상처에 호중구, 단핵구 및 단핵구 유래 대식세포의 축적을 보여줍니다. (D)PVA 스폰지 상처로부터 분리된 세포의 대표적인 게이팅 전략은 유세포분석으로 백혈구 서브세트를 식별하는 방법을 보여준다. 게이트는 다음과 같이 정의된다:(i 및 ii)두배 배제,(iii)아민 반응성 고칠 수 있는 생존성 염료를 이용한 죽은 세포 배제,(iv)FSC-A및 SSC-A에 의한 파편 배제,(v)CD45+ 조혈 세포,(vi)Ly6G+ 호중구,(vii)시글렉-F+ 호산구,+ (viii)Ly6G–시글렉-F– F4/80+ 모노사이트/매크로(ix) Ly6C안녕 단핵구 및(x)F4/80+Ly6C낮은 대식 세포. 게이트는 형광-마이너스 1(FMO) 제어에 따라 배치되었다. A-C에 도시된 데이터는 평균 ±SEM, n=6-10 마우스(A), n=8-9마우스(B)및 n=6-8 A마우스(C)에서이다.AC 모든 데이터는 2-3개의 독립적인 실험에서 결합됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 절제꼬리 피부 상처 치유의 평가. (A)1, 7, 15일 후 상처를 입은 절제된 꼬리 피부 상처의 대표적인 사진. (B)절제 꼬리 피부 상처의 폐쇄 율. 상처는 격일로 촬영되었습니다. 이미지 프로세싱 소프트웨어는 상처 베드 여백을 추적하고 표시된 시점에서 상처 부위를 계산하는 데 사용되었습니다. 상처 부위는 1일째에 측정된 상처 부위의 분수로서 제시된다. 파라핀이 내장되어 있고, 단면화되고,(C)H&E 또는(D)마슨의 삼조판으로 염색된 꼬리 단면의 대표적인 이미지. 상처는 꼬리 단면의 등쪽 표면에 위치했다; 측면 상처 여백은 화살촉으로 표시됩니다. (B)에B도시된 데이터는 그룹당 평균 ±SEM, n=8 마우스이다. 데이터는 두 개의 독립적인 실험에서 결합됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서는 급성 상처 치유 반응의 평가를 허용 하는 두 가지 견인 뮤린 상처 모델을 설명 합니다. 첫 번째 방법은 등지 피하 공간에서 PVA 스폰지의 외과 이식을 포함한다. 이 접근법은 고립된 스폰지로부터 수득된 많은 수의 세포 및 상처 체액의 양으로 인해 세포 상처 치유 반응을 연구하기 위한 생검 기반 상처 모델보다 뚜렷한 이점을 제공한다. 이 절차의 성공적인 실행을 위해, 절개 주위 피부를 철저히 청소하여 멸균 수술 장을 유지하는 것은 필수적입니다, 상처에 박테리아의 전좌는 크게 치유의 과정을 변경합니다. 여기에 기술된 세포 분리 방법을 사용하여, 스폰지 추출 의 시간에 따라 PVA 스폰지로부터 적어도 1-10 x 106 세포를 분리할 수 있다. PVA 스폰지 상처로부터 분리된 세포의 대부분은 실행가능하다(그림 2D). 그러나, 죽은 세포가 기계적 중단 후에 단리된 상처 세포의 ~20%까지 구성할 수 있기 때문에, 유세포 분석 기지를 둔 분석을 진행할 때 생존 성 얼룩을 사용하는 것이 좋습니다. PVA 스폰지 상처로부터 분리된 세포는 주로 CD45 양성에 의해 결정된 조혈 기원이다(도2D). 단핵구와 대식세포에 이어 호중구의 급속한 축적은 상처 수리3,4,34,,,35,,36,,37,3438의급성 단계와 일치합니다.37 단리된 세포는 면역phenotyping, 세포 선별, 배양, RNA 추출 및 다양한 기능적인 분석을 포함하는 다운스트림 분석에 적합합니다.
PVA 스폰지 상처 모델은 또한 급성 상처 환경에서 사이토 카인 및 성장 인자 반응을 평가하는 데 이상적인 유체의 격리를 허용합니다. PVA 스폰지 유체는 ELISA, 비드 계 멀티플렉스 면역 분석 및 단백질 정량에 의한 테스트에 적합합니다. 이전 연구는 사이토카인 및 성장 인자 측정을 통해 초기 상처 환경이 자연에서 염증성이 있음을 입증했으며, IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 신속한 유도는 1-3일부터 진행되었습니다. 상처 환경은 VEGF 및 TGF-β22,,,23,,25,26,30을포함하는 친혈관성 및 친섬유성 성장 인자의 후기 유도와 함께 회복 상태로 전환된다.,
PVA 스폰지 이식 모델은 급성 상처 세포 및 사이토 카인 반응을 연구하는 데 유리하지만, 그 한계 중 하나는 치유 속도 또는 정도를 측정 할 수 없다는 것입니다. 상처 치유반응의 다양한 양상에 대한 혼수상태의 효과를 평가할 때 상처 치유의 이러한 양태의 측정이 필요할 수있다(30). 이 메트릭에 대 한, 생 검 기반 방법 바람직하다. 여기서, 꼬리 피부 절제 모델이 제시된다. 이 모델에서는 꼬리 피부의 전체 두께 단면이 꼬리의 등쪽 표면에서 절제됩니다. 다시 말하지만, 멸균 수술장을 유지하는 것은 상처 침대를 접종하지 않도록하는 것이 중요합니다. 스프레이 장벽 필름 또는 다른 상처 덮개의 사용은 또한 나중에 상처 감염을 피하기 위해 권장됩니다. 더 오래된 남성 마우스 또는 공격적인 긴장은 상처의 중단을 피하기 위하여 솔로 하우징을 요구합니다. 상처 치유를 연구하기 위한 부위로서 꼬리의 특별한 장점은 다른 사람27,,32,,33에의해 설명된 바와 같이 폐쇄에 대한 재상피에 더 의존한다는 것이다. 상처 층 면적을 측정하고 조직학적 분석을 수행하는 것 외에도, 다른 사람들은 치유 과정을 조절하는 국소 개입의 효능을 평가하는 데 그 사용을 보고했다33.
이러한 방법에 설명 된 상처 모델의 각각은 정상 상태와 동반 변이의 존재에서 상처 수리 과정을 이해하기위한 뚜렷한 장점을 제공합니다. 근친 상간 마우스의 유전적으로 변경된 긴장의 넓은 가용성 때문에, 프로세스에 관하여 기계론적인 질문에 대답하기 위하여 상처 치유 반응을 조작하는 것도 가능합니다. 더욱이, 이들 시스템은 당뇨병, 노화, 이차 감염 및 기타30,,36,,39,,40을포함하는 가난한 상처 치유와 관련된 조건의 뮤린 모델로 구현될 수 있다. murine 연구에서 얻은 기계론적 통찰력은 다음 더 높은 순서의 동물 모델에서 상처 치유를 공부하기위한 기초를 제공 할 수 있습니다. 함께, PVA 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델은 정상 상태 및 병리학 적 조건에서 상처 치유 과정을 해명하는 견인 및 다양한 시스템을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 브라운 대학 유동 세포 분석 및 선별 시설의 케빈 칼슨 (Kevin Carlson)에게 유동 세포 분석 실험에 대한 상담 및 지원에 감사드립니다. 그림 1B 및 C의 이미지는 BioRender로 작성되었습니다. 카일 리와 그레고리 세르파는 사진 촬영에 도움을 준 것에 대해 감사를 표한다. 이 작품은 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) YFAA15 D15AP0100, 신흥 새로운 과학 상 (브라운 대학), 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, 국립 환경 과학 연구소 (NIES) T32-ES7272 (환경 병리학 교육), 브라운 대학 연구 종자 상.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17x100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum - Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge - large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
References
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