Isolement concomitant des astrocytes primaires et des microglies pour l’infection de parasite de Protozoa

Summary

L’objectif global de ce protocole est d’instruire comment extraire, maintenir et dissocier les cellules astrocytes murines et microglies du système nerveux central, suivies d’une infection par des parasites protozoaires.

Abstract

Les astrocytes et les microglies sont les cellules gliales les plus abondantes. Ils sont responsables du soutien physiologique et de l’entretien de l’homéostasie dans le système nerveux central (SNC). Les preuves croissantes de leur participation à la lutte contre les maladies infectieuses justifient l’intérêt croissant pour l’amélioration des méthodologies pour isoler les astrocytes primaires et les microglies afin d’évaluer leurs réponses aux infections qui affectent le SNC. Considérant l’impact de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) et Toxoplasma gondii (T. gondii) infection dans le SNC, ici nous fournissons une méthode pour extraire, maintenir, dissocier et infecter les astrocytes murins et les cellules de microglie avec des parasites protozoaires. Les cellules extraites des cortices nouveau-nés sont maintenues in vitro pendant 14 jours avec le remplacement différentiel périodique de médias. Les astrocytes et les microglies sont obtenus à partir du même protocole d’extraction par dissociation mécanique. Après le phénotypage par cytométrie d’écoulement, les cellules sont infectées par des parasites de protozoaire. Le taux d’infection est déterminé par la microscopie de fluorescence à différents moments, permettant ainsi l’évaluation de la capacité différentielle des cellules gliales pour commander l’invasion et la réplication protozoaires. Ces techniques représentent des méthodes simples, bon marché et efficaces pour étudier les réponses des astrocytes et des microglies aux infections, ouvrant le champ à d’autres analyses neuroimmunologiques.

Introduction

Le CNS est principalement composé de neurones et de cellules gliales^1,2,3. Les microglies et les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du SNC. Microglia, le macrophage résident, est l’immunocompétence et la cellule gliale phagocytique dans le CNS^3,4, tandis que les astrocytes sont responsables du maintien de l’homéostasie et exercent des fonctions de soutien⁵.

En dépit des cellules gliales étant classiquement connues pour être responsables du souti....

Protocol

Toutes les procédures expérimentales impliquant des souris ont été effectuées conformément à la loi nationale brésilienne (11.794/2008) et approuvées par les Comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université fédérale de Sao Paulo (UNIFESP).

1. Extraction, entretien et dissociation des cellules gliales

REMARQUE : Le nombre de souris utilisées pour l’extraction des cellules gliales dépend de la quantité de cellules nécessaires pour effectuer les expériences souhaitées. Dans ce protocole, un total de 2,7 x 10⁷ astrocytes et 4 x 10⁶ microglies ont été obtenus à ....

Results

Le 14^e jour, la culture des cellules gliales(figure 1A) a subi une dissociation mécanique. Les populations cellulaires isolées ont été analysées par cytométrie d’écoulement selon les marqueurs CD11b, CD45 et GFAP. Nous avons pu observer une pureté de 89,5% pour la population d’astrocytes et de 96,6% pour la population de microglies(figure 1B). Après l’isolement, les cellules ont été plaquées dans une plaque plate de 9.......

Discussion

L’importance d’étudier les fonctions isolées des cellules gliales dans des contextes biologiques distincts s’est développée au cours des deux dernières décennies. Comprendre le SNC au-delà des neurones est encore un domaine croissant dans la biologie cellulaire, en particulier dans les infections ou les conditions inflammatoires^8,9,24. Les cellules glials sont cruciales non seulement pour le soutien physique des neurones (comme .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 %	d’éthanol Dinâ ; mica Quí ; mica Contemporâ ;	nea Cat : 2231	Stériliser
75 cm2 Flacon	Corning	Cat : 430720U	Matière plastique
96 puits plaque de culture cellulaire	Greiner Cellstar	Cat : 655090	Culture cellulaire
Chlorure d’ammonium (NH4Cl)	Dinâ ; mica Quí ; mica Contemporâ ; nea	Cat : C10337.01.AH	Supprimer l’autofluorescence
Anticorps anti-GFAP	Abcam	Cat. : ab49874	Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 &mu ; mm CA	Corning	Cat : 430513	Milieu de culture
Filtre Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma Aldrich	Cat : A7906	FACS Préparation du tampon
CD11b (FITC)	BD Pharmigen	Cat. : 553310	Anticorps de cytométrie en flux
CD45 (PE)	Invitrogen	Cat. : 12-0451-83	Centrifugeuse d’anticorps de cytométrie en flux
	Eppendorf	Cat : 5810R	Centrifugeuse de centrifugation
	Eppendorf	5415R	Centrifugation
Classe II Enceinte de biosécurité	Pachane	Cat : 200	Armoire de biosécurité pour procédures stériles
CO2 Incubateur	ThermoScientific	Modèle : 3110	Maintenance des cellules primaires
Tubes coniques 15 mL	Corning	Cat : 430766	Matière plastique
Tubes coniques 50 mL	Corning	Cat : 352070	Matière plastique
Compteur de cellules automatisé Countess	Invitrogen	Cat : C10281	Compteur de cellules
DAPI	Invitrogen	Cat. : D1306	Antidoby d’immunofluorescence
Appareil photo de microscope numérique	Nikon	Cat : DS-RI1	Capture d’images au microscope
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	Cat : 12800-058	Milieu de culture cellulaire
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma Aldrich	Cat : E9884	FACS Préparation du tampon
F12 Mélange de nutriments	Gibco	Cat : 21700-026	Milieu de culture cellulaire
FACS Canto II	BD Biosciences	Cytomètre en	flux
indisponible Sérum fœtal bovin (FBS)	LGC Biotechnology	Cat : 10-bio500-1	Complément de milieu de culture cellulaire
Flow Jo (logiciel)	Flow Jo	Version : Flow Jo_9.9.4	Analyse des données
Fluorescence lumière intense	Comment	: C-HGFI	Source de fluorescence
GFAP (APC)	Invitrogen	Cat. : 50-9892-82	Anticorps de cytométrie en flux
IgG de chèvre - anti-souris (FITC)	Kirkeegood& Perry Lab (KPL)	Cat. : 172-1806	Antidoby d’immunofluorescence
HBSS - Solution saline équilibrée de Hank	Gibco	Cat : 14175079	Milieu de culture cellulaire
HEPES	Sigma Aldrich	Cat : H4034	Supplément de milieu de culture
cellulaire IC Fixation Buffer	Invitrogen	Cat : 00-8222-49	Fixation cellulaire pour citométrie en flux
Microscope inversé	Nikon	Modèle : ECLIPSE TS100	Microscope
Isoflurane	Cristá ; lia	Cat : 21.2665	Anesthésique inhalé
Methanol	Synth	Cat : 01A1085.01.BJ	Fixation pour immunofluorescence
Micro spatule	ABC inoxydable	Indisponible	Matériau chirurgical
Microtube 1,5 mL	Axygen	Cat : MCT-150-C	Matière plastique
Anticorps monoclonal (mAb) 2C2 anti-Ssp-4	Non commercial	commercial	Immunofluorescence antidoby
Pipette multicanaux (p200)	Corning	Cat : 751630124	Réactifs pour pipette
NIS Elements Software	Nikon	Version 4.0	Acquisition et analyse d’images
Lait écrémé	Nestlé ;	Cat : 9442405	Solution bloquante pour l’immunofluorescence
Incubateur à agitateur orbital	ThermoScientific	Modèle : 481 Cat : 11	Dissocier la microglie des astrocytes
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma Aldrich	Cat : P6148	Fixation pour l’immunofluorescence
PBS	Non commercial	commercial	Tampon neutre
Pénicilline G	Sigma Aldrich	Cat : P-7794	Supplément de milieu de culture cellulaire
Tampon de perméabilisation (10x)	Invitrogen	Cat : 00-8333-56	Perméabilisation cellulaire pour citométrie en flux
Boîte de Petri 60 mm x 15 mm (jetable, stérile)	Prolab	Cat : 0303-8	PH-mètre en matière plastique
	Kasvi	K39-1014B	Calibrer la solution de pH
RPMI 1640 Medium	Gibco	Cat : 31800-014	Milieu de culture cellulaire
Ciseaux	ABC inox	Cat : LO9-W4	Matériel chirurgical
Pipette sérologique 10 mL	Corning	Cat : 4101	Matière plastique
Pipette sérologique 5 mL	Corning	Cat : 4051	Matière plastique
Pipette monocanal (p1000)	Gilson Pipetman	Cat : F123602	Réactifs de pipette
Simple Pipette à canal (p200)	Gilson Pipetman	Cat : F123601	Réactifs de pipette
	Bicarbonate de sodium Sigma Aldrich	Cat : S6297	Supplément de milieu de culture cellulaire
Sel de sulfate de streptomycine	Sigma Aldrich	Cat : S9137	Supplément de milieu de culture cellulaire
Triton X-100	Sigma Aldrich	Cat : T9284	Perméabilisation pour immunofluorescence
Trypsine	Gibco	Cat : 27250-018	Enzyme digestive
Pince à épiler	ABC inox	Cat : L28-P4-172	Matériel chirurgical
Bain d’eau	Novatecnica	Modèle : 09020095	Digeste tissu à 37 ° ; C avec trypsine