Summary
L’objectif global de ce protocole est d’instruire comment extraire, maintenir et dissocier les cellules astrocytes murines et microglies du système nerveux central, suivies d’une infection par des parasites protozoaires.
Abstract
Les astrocytes et les microglies sont les cellules gliales les plus abondantes. Ils sont responsables du soutien physiologique et de l’entretien de l’homéostasie dans le système nerveux central (SNC). Les preuves croissantes de leur participation à la lutte contre les maladies infectieuses justifient l’intérêt croissant pour l’amélioration des méthodologies pour isoler les astrocytes primaires et les microglies afin d’évaluer leurs réponses aux infections qui affectent le SNC. Considérant l’impact de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) et Toxoplasma gondii (T. gondii) infection dans le SNC, ici nous fournissons une méthode pour extraire, maintenir, dissocier et infecter les astrocytes murins et les cellules de microglie avec des parasites protozoaires. Les cellules extraites des cortices nouveau-nés sont maintenues in vitro pendant 14 jours avec le remplacement différentiel périodique de médias. Les astrocytes et les microglies sont obtenus à partir du même protocole d’extraction par dissociation mécanique. Après le phénotypage par cytométrie d’écoulement, les cellules sont infectées par des parasites de protozoaire. Le taux d’infection est déterminé par la microscopie de fluorescence à différents moments, permettant ainsi l’évaluation de la capacité différentielle des cellules gliales pour commander l’invasion et la réplication protozoaires. Ces techniques représentent des méthodes simples, bon marché et efficaces pour étudier les réponses des astrocytes et des microglies aux infections, ouvrant le champ à d’autres analyses neuroimmunologiques.
Introduction
Le CNS est principalement composé de neurones et de cellules gliales1,2,3. Les microglies et les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du SNC. Microglia, le macrophage résident, est l’immunocompétence et la cellule gliale phagocytique dans le CNS3,4, tandis que les astrocytes sont responsables du maintien de l’homéostasie et exercent des fonctions de soutien5.
En dépit des cellules gliales étant classiquement connues pour être responsables du soutien et de la protection des neurones6,7, les fonctions émergentes de ces cellules ont été décrites dans la littérature récente, y compris leurs réponses aux infections8,9,10,11. Ainsi, il ya une poussée pour développer des méthodes pour isoler ces cellules gliales pour comprendre leurs fonctions individuellement.
Il existe d’autres modèles pour étudier les cellules gliales plutôt que les cultures primaires, comme les lignées cellulaires immortalisées et les modèles in vivo. Cependant, les cellules immortalisées sont plus susceptibles de subir des changements génétiques à la dérive et morphologiques, tandis que les études in vivo imposent des conditions de manipulation limitées. Inversement, les cultures primaires sont faciles à manipuler, mieux ressembler aux cellules in vivo et nous permettent également de contrôler les facteurs expérimentaux12,13. Ici, nous décrivons des lignes directrices sur la façon d’extraire, maintenir et dissocier les astrocytes murins et les cellules primaires de microglie dans le même protocole. En outre, nous fournissons également des exemples sur la façon de travailler avec l’infection à protozoaires dans ces cultures.
Les cellules du SNC extraites de souris néonatales (jusqu’à 3 jours) ont été cultivées pendant 14 jours sur des supports différentiels qui permettent la croissance préférentielle des astrocytes et des cellules de microglies. Puisque les microglies reposent au-dessus des astrocytes attachés, les populations cellulaires ont été mécaniquement dissociées dans un incubateur orbital. Ensuite, nous avons recueilli tous les supernatants contenant des microglies et ajouté de la trypsine pour détacher les astrocytes. Les cellules gliales isolées ont été évaluées phénotypiquement par cytométrie d’écoulement et plaquées selon l’expérience désirée.
Nous avons également fourni des exemples sur la façon d’infecter ces microglies et astrocytes isolés avec des parasites protozoaires. T. gondii est un protozoaire hautement neurotrope responsable de la toxoplasmose14, tandis que T. cruzi est responsable de la maladie de Chagas qui peut conduit au développement de troubles neurologiques dans leSNC 15,16. En outre, il a également été signalé que l’infection par T. gondii17,18 ou T. cruzi19,20,21 étaient la cause vraisemblablement de la mort chez les patients immunocompromisés. Par conséquent, l’élucidation du rôle immunologique des cellules gliales du SNC dans le contrôle des infections de protozoaire est d’une grande importance.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales impliquant des souris ont été effectuées conformément à la loi nationale brésilienne (11.794/2008) et approuvées par les Comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université fédérale de Sao Paulo (UNIFESP).
1. Extraction, entretien et dissociation des cellules gliales
REMARQUE : Le nombre de souris utilisées pour l’extraction des cellules gliales dépend de la quantité de cellules nécessaires pour effectuer les expériences souhaitées. Dans ce protocole, un total de 2,7 x 107 astrocytes et 4 x 106 microglies ont été obtenus à partir de six souris néonatales C57BL/6. Toutes les procédures ont été exécutées sous état stérile dans un coffret de biosécurité de classe II.
- Jour 1
- Préparer la solution de sel équilibrée (HBSS) et le HBSS (HBSS) et 10 % du sérum bovin fœtal (FBS) inactivé à la chaleur (voir Tableau des matériaux).
- Préparer le Medium Aigle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco (10 % FBS - 0,08 mM Penicillin - 0,09 mM Streptomycin , 12,5 mM HEPES , 30 mM de bicarbonate desodium, pH 7,2) et filtrer avec un filtre de 0,22 m (voir de la table ).
REMARQUE : Tous les supports culturels doivent être entreposés à 4 oC, mais il est nécessaire de les pré-attendre à 37 oC pendant 20 minutes avant de commencer l’expérience. - Stériliser tous les instruments chirurgicaux (ciseaux, spatule et pincettes) dans un autoclave et utiliser 70% d’éthanol pendant l’intervention.
- Mettre les nouveau-nés (jusqu’à 3 jours) souris dans une chambre scellée contenant du coton imbibé d’isoflurane pendant 5 min pour une anesthésie profonde.
- Vaporiser le chiot souris avec 70% d’éthanol et décapiter l’animal avec des ciseaux.
- Faire la coupe sagittale (postérieure à antérieure) avec des ciseaux le long du crâne pour l’ouvrir et exposer le cerveau. Séparez le crâne du cerveau à l’aide de pincettes. Retirez le cerveau à l’aide d’une micro spatule pour maintenir l’intégrité du cerveau.
- Placer le cerveau dans un plat Sec Petri (6 cm de diamètre). Retirer l’ampoule olfactive et le cervelet à l’aide d’une micro spatule. Déplacez le cortex vers un autre plat Petri (6 cm de diamètre) contenant HBSS et 10 % de FBS (2 ml/Petri).
- Couper le tissu cérébral en petits morceaux avec des ciseaux stériles et à l’aide d’une micropipette p1000 transférer chaque tissu cérébral avec HBSS - 10% FBS à différents tubes coniques de 15 mL. Assurez-vous que le volume final est de 2 ml/tube. Si ce n’est pas le cas, avec HBSS - 10% FBS.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Si c’est le cas, les tubes coniques avec tissu DE SNC doivent être placés sur la glace jusqu’à 1 h. - Laver le tissu cérébral coupé avec 3 ml de HBSS , 10% FBS (par tube) et après décantation. Retirez soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 3 fois.
REMARQUE : Cette étape vise à enlever les débris et à récupérer le tissu extrait. - Laver le tissu cérébral coupé avec 3 ml de HBSS pur (par tube) et après décantation, enlever soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 3 fois.
REMARQUE : Cette étape vise à supprimer le sérum restant des lavages précédents, car les cellules seront trypsinisées à l’étape suivante. - Ajouter 3 ml de trypsine par tube et placer dans un bain d’eau à 37 oC pendant 30 minutes, en secouant doucement les tubes toutes les 5 minutes. Évitez les bulles en inversant ou en mélangeant brusquement les tubes.
REMARQUE : Cette étape vise à digérer le tissu recueilli. - Pour inactiver la trypsine, laver le tissu avec 3 ml par tube de HBSS - 10% FBS et, après décantation du tissu, enlever soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 3 fois.
- Laver le tissu avec 3 ml par tube de HBSS pur et enlever soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 2 fois.
- Ajouter 7 ml par tube de HBSS pur et homogénéiser le tissu à travers des passages successifs dans les pipettes : d’abord avec la pipette sérologique de 10 ml, suivie de la 5 ml et enfin avec la micropipette p1000.
- Après homogénéisation, les tubes de centrifugeuse à 450 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Jetez le supernatant et réutilisez la granule avec 4 ml de HBSS , soit 10 % de FBS par tube.
- Transférer les cellules dans un flacon T-75 prétraité pour une adhérence optimale à la culture cellulaire (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Traiter le tissu de chaque animal par flacon. - Placer le flacon dans l’incubateur à 37 oC et 5% de CO2 pendant 30 min pour l’observance.
- Ajouter 10 ml de DMEM/F12 complété par flacon et incuber à 37 oC et 5 % de CO2.
REMARQUE : Le volume final est de 14 ml par flacon.
- Jour 3
- Retirer 7 ml de milieu de culture du flacon T-75 et ajouter 7 ml de DMEM/F12 frais complété.
REMARQUE : Les flacons contiendront beaucoup de débris cellulaires et un aspect nuageux.
- Retirer 7 ml de milieu de culture du flacon T-75 et ajouter 7 ml de DMEM/F12 frais complété.
- Jour 5
- Retirer tout le milieu du flacon T-75 et ajouter 14 ml de DMEM/F12 frais complété.
REMARQUE : Le milieu est remplacé des flacons pour enlever les débris et les cellules non adhérentes. - Après chaque 48 h, retirer 6 ml du supernatant et ajouter 7 ml de DMEM/F12 frais complété moyen jusqu’au jour 14 de la culture.
- Retirer tout le milieu du flacon T-75 et ajouter 14 ml de DMEM/F12 frais complété.
- Jour 14
- Après avoir enlevé 6 ml du supernatant et ajouté 7 ml de milieu frais DMEM/F12, fermez les flacons T-75.
- Placez-les dans le shaker orbital au sol à 200 tr/min et 37 oC pendant la nuit pour dissocier mécaniquement les microglies des astrocytes.
- Jour 15
- Prenez les flacons du shaker et lavez-les vigoureusement avec leur propre milieu afin d’optimiser la dissociation cellulaire et de récolter le nombre maximum de microglies. Ensuite, recueillir le supernatant (contenant des microglies) et le transférer à un tube conique de 50 ml.
- Ensuite, ajouter 4 ml de trypsine dans chaque flacon et incuber pendant 5 min à 37 oC afin de détacher les astrocytes.
- Ajouter 5 ml par flacon de DMEM/F12 complété pour inactiver la trypsine. Laver les flacons avec leur propre milieu et transférer le contenu dans un tube conique de 50 ml.
- Centrifuge tous les tubes contenant des microglies dissociées et des astrocytes à 450 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Jetez le supernatant. Réutilisez le granule de microglie en 1 ml et les astrocytes dans 10 ml de DMEM/F12 complété.
- Procédez au comptage cellulaire dans une chambre Neubauer ou un compteur cellulaire automatique. Plaquez les cellules avec DMEM/F12 complété à la densité désirée dans une plaque de culture plate appropriée de cellules de fond (prétraité pour l’attachement optimal de cellules ; voir tableau des matériaux). Incuber les cellules à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h pour leur permettre de se fixer.
REMARQUE : Réservez 1,5 x 106 de chaque population cellulaire pour confirmer leur pureté par cytométrie d’écoulement. - Effectuez une analyse cytométrique du débit pour vérifier la pureté des populations cellulaires.
REMARQUE: Nous considérons microglia CD11b '/CD45+'/GFAP- et astrocytes CD11b-/CD45-/GFAP+'. La coloration Iba1 et TMEM119 pourrait être envisagée afin de caractériser pleinement les microglies22. - Ajouter un FMO (Fluorescence Moins One)23 et un échantillon non souillé pour chaque population cellulaire (astrocytes et microglies) comme témoins de l’analyse de cytométrie d’écoulement.
- Pour chaque population cellulaire, réservez 5 x 105 cellules pour chaque échantillon taché et non souillé. Pour l’OMF, réservez deux autres tubes de microglies contenant 2,5 x 105 cellules chacun et réservez également un autre tube de 5 x 105 astrocytes.
REMARQUE : Étant donné que le nombre de microglies peut être un facteur limitant, il est possible d’utiliser moins de cellules pour des contrôles non contaminés et fMO. - Centrifuge tous les microtubes à 450 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant et réutilisez la granule avec 500 L/microtube de tampon FACS (saline tamponnée par phosphate (PBS) - 0,5% albumin de sérum bovin (BSA) - 2 mM EDTA, pH 7.2).
- Centrifuge tous les microtubes à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant et résuspendre la granule avec 100 L/microtube d’anti-CD16/CD32 (clone 93) (1:50) dilué dans le tampon FACS. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
- Ajouter 500 L/microtube de tampon FACS dans tous les microtubes et centrifugeuse à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant. Les astrocytes et les tubes de colorant de microglie et aussi le tube FMO astrocyte avec 50 l/microtube de marqueurs de surface se mélangent : anti-CD45 (PE, clone 30-F11) et anti-CD11b (eFluor 450, clone M1/70) (tous deux dilués à 1: 100 dans le tampon FACS).
- Pour les cellules non contaminées, réutilisez-la avec le même volume de tampon FACS. Pour les microglies FMO, incuber chaque tube de microglie avec anti-CD45 ou anti-CD11b. Incuber tous les échantillons à 4 oC pendant 20 minutes dans l’obscurité.
- Ajouter 500 L de tampon FACS par microtube. Centrifugeuse à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant et réutiliser la granule avec 100 lL/microtube de tampon de fixation (voir tableau des matériaux) pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
- Ajouter 500 l/microtube de tampon de perméabilisation 1x (voir tableau des matériaux) et incuber à 4 oC pendant 5 minutes dans l’obscurité.
- Centrifuge tous les microtubes à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant. Résuspendent des astrocytes et des tubes de colorant de microglies et aussi des tubes FMO de microglie avec 50 l/microtube d’anticorps intracellulaires anti-GFAP (APC, clone GA5) dans une dilution de 1:100 dans le tampon de perméabilisation de 1x. Pour les cellules non contaminées et l’astrocyte FMO, réutilisez les cellules avec le même volume de tampon FACS. Incuber tous les échantillons à 4 oC pendant 30 minutes dans l’obscurité.
- Laver tous les tubes en ajoutant 500 L/microtube de tampon de perméabilisation 1x. Centrifuge tous les microtubes à 450 x g, pour 5 min à 4 oC. Réutilisez chaque microtube dans 200 L de tampon FACS. Acquérir 1 x 105 événements/échantillon sur le cytomètre de flux.
- Pour l’analyse, les cellules doivent être fermées d’abord sur CD11b x CD45, puis GFAP histogramme.
REMARQUE : Les contrôles non entretenus et les contrôles FMO sont utiles pour déterminer les portes.
2. Infection et évaluation des taux d’infection
- Infection des cellules gliales avec T. gondii
- Plaque 3 x 104 microglies ou astrocytes avec DMEM/F12 complété à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h dans une plaque plate prétraitée de 96 puits (voir Tableau des matériaux).
- Infecter chaque population cellulaire avec des tachyzoites de T. gondii RH souche exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) à une multiplicité d’infection (MOI) de 1:1 (parasite:cellule) dilué dans 200 L / puits de supplémenté RPMI (3 % FBS - 0,16 mM Pénicilline - 0,18 mM Streptomycine - 12,5 mM HEPES - 30 mM de bicarbonate de sodium, pH 7.2) (voir Tableau des matériaux). Incuber à 37 oC et 5% de CO2 pour 48 h.
- Ensuite, jetez le supernatant et fixez les cellules en ajoutant 100 L/puits de 1% de paraformaldéhyde (PFA) dilué dans PBS à 4 oC pour 24 h.
- Remplacer PFA par 100 L/puits de PBS à pH 7.2.
- Retirez soigneusement les noyaux des cellules supernatantes et des cellules tachetées en tuyautant 50 L/puits de DAPI (5 mg/mL) dilués dans PBS pH 7,2 (1:1 000) pendant 1 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Remplacez la solution de coloration DAPI par 100 L/puits de PBS (pH 7.2) et analysez-la par microscopie à fluorescence.
- Infection des cellules gliales avec T. cruzi
- Plaque 3 x 104 microglies ou astrocytes avec DMEM/F12 complété à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h dans une plaque plate prétraitée de 96 puits (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Pour chaque fois, utilisez une plaque différente. - Infectez les cellules gliales avec des trypomastigotes de la souche T. cruzi Y à un MOI de 5:1 (parasites:cell) dilués dans 200 L/puits de RPMI complété et incuber à 37 oC et 5% DE CO2 pour 2 h.
REMARQUE: Cette étape est importante pour l’invasion cellulaire par le parasite. - Retirez tous les supernatants et lavez les puits en ajoutant 200 L/puits de RPMI complété pour enlever tous les parasites extracellulaires. Retirez le supernatant et ajoutez 200 L/puits de RPMI frais complété.
REMARQUE: Cette étape vise à éliminer tous les parasites qui n’ont pas envahi les cellules adhérentes. - Incuber les cellules infectées pour 2 h, 48 h et 96 h pour évaluer la réplication de T. cruzi dans les cellules gliales11.
- Après chaque fois, retirez le supernatant et fixez les cellules avec 100 L/puits de méthanol pendant 15 minutes à température ambiante, puis remplacez le méthanol par 100 L/puits de PBS (pH 7.2).
- Après fixation, préparer les cellules pour l’essai d’immunofluorescence comme suit.
- Pour éviter l’autofluorescence, traiter les cellules avec 100 L/puits de 50 mM NH4Cl dilué dans PBS (pH 8.0) pendant 15 min. Laver les cellules en ajoutant 100 L/puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois).
- Ensuite, perméabiliser les cellules en ajoutant 100 L/puits de 0,5% Triton dilué dans PBS pendant 15 min. Laver les cellules en ajoutant 100 L /puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois).
- Ensuite, incuber la culture cellulaire avec 100 L /bien de solution de blocage (5% de lait non gras - 2% BSA dilué dans PBS [pH 7.2]) pour 1 h à température ambiante. Laver les cellules en ajoutant 100 L/puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois).
- Afin de tacher les amastigotes, incuber avec 30 L/puits d’anticorps monoclonal non commercial (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 protéine (1:200) dilué dans la solution de blocage pour 1 h à température ambiante.
- Laver les cellules en ajoutant 100 L/puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois). Incuber la plaque avec 30 L/puits d’anticorps anti-souris secondaires (1:500) dilués dans PBS pendant 1 h à température ambiante.
REMARQUE : La protéine anti-Ssp-4 non commerciale de mAb 2C2 était un bon cadeau du professeur Renato A. Mortara du Département de microbiologie, d’immunologie et de parasitologie de l’Université fédérale de Sao Paulo. - Retirez soigneusement les noyaux supernatants et tachetés en ajoutant 50 l/puits de DAPI (5 mg/mL) dilués dans PBS pH 7.2 (1:1,000) pendant 1 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Remplacez la solution de coloration DAPI par une microscopie à 100 L/puits de PBS pH 7.2 et analysez-la par microscopie à fluorescence.
- Plaque 3 x 104 microglies ou astrocytes avec DMEM/F12 complété à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h dans une plaque plate prétraitée de 96 puits (voir Tableau des matériaux).
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Representative Results
Le 14e jour, la culture des cellules gliales(figure 1A) a subi une dissociation mécanique. Les populations cellulaires isolées ont été analysées par cytométrie d’écoulement selon les marqueurs CD11b, CD45 et GFAP. Nous avons pu observer une pureté de 89,5% pour la population d’astrocytes et de 96,6% pour la population de microglies(figure 1B). Après l’isolement, les cellules ont été plaquées dans une plaque plate de 96 puits et après 24 h elles étaient prêtes à être infectées par T. cruzi ou T. gondii selon les protocoles respectifs d’infection. Ici, nous avons fourni une infection de temps-cours de T. cruzi comme un exemple de l’évaluation de taux d’infection dans ces cellules gliales.
Les astrocytes et les microglies (3 x 104 cellules/puits) ont été infectés par T. cruzi à MOI à 5:1 (parasites:cell) pour 2-96 h(figure 2). Le taux d’infection a été évalué par immunofluorescence en comptant le nombre de cellules et le nombre de parasites tachés d’un intercalateur d’ADN (DAPI). En bref, nous pourrions observer que T. cruzi est capable d’envahir les microglies et les astrocytes à des rythmes similaires. En outre, T. cruzi se réplique dans les deux types de cellules, atteignant le taux d’infection le plus élevé à 96 h après l’infection (p.i.). Fait intéressant, à 96 h p.i. le taux d’infection est plus prononcé chez les astrocytes que dans les microglies, ce qui suggère que les cellules microglia sont en mesure de contrôler la réplication parasite plus efficacement que les astrocytes, comme nous l’avons déjà décrit11.
Il est important de noter que l’utilisation de parasites génétiquement modifiés exprimant des reporters fluorescents ou des parasites étiquetés avec des anticorps fluorescents spécifiques pourrait améliorer la microscopie à l’immunofluorescence, car ils sont mieux distingués du noyau cellulaire(figure 3). En outre, le taux d’infection des parasites fluorescents peut être déterminé par d’autres techniques telles que la cytométrie des débits. Ici, nous avons fourni des exemples de T. gondii RH souche exprimant de façon constitutive YFP (figure 3A) et T. cruzi Y souche tachée de non-commercial mAb 2C2 anti-Ssp-4 protéine(figure 3B).
Au total, ce protocole décrit comment extraire, maintenir, dissocier et infecter les microglies murines et les cellules primaires des astrocytes, ce qui pourrait être un outil puissant pour étudier, par exemple, les réponses immunitaires des cellules gliales à l’infection par le protozoaire comme brièvement élucidé Ici.
Figure 1 : astrocytes primaires et cellules microgliales. (A) Les images de cellules gliales murines C57BL/6 le 14ème jour de la culture ont été obtenues par microscope inversé (400x).th La flèche rouge indique la couche d’astrocytes et la flèche noire indique la microglie. (B) Après dissociation mécanique, les astrocytes et les microglies ont été tachés (5 x 105 cellules) avec anti-CD11b fluorescent, anti-CD45 et anti-GFAP et évalués par cytométrie de débit (1 x 105 cellules d’acquisition). Les astrocytes sont considérés comme cd11b-/CD45- et GFAP- cellules, tandis que les microglies sont CD11b/CD45- et GFAP- cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Cours de temps de l’infection de T. cruzi dans les cellules gliales. Les astrocytes et les microglies de souris C57BL/6 ont été infectés par T. cruzi Y (MOI à 5:1). Après 2 h, 48 h et 96 h, les chambres ont été fixées avec du méthanol et tachées de marqueur de noyau cellulaire DAPI (bleu) et anti-GFAP (rouge). Des images ont été obtenues au microscope à fluorescence inversé (400x). Le nombre d’amastigotes à l’intérieur des cellules et la fréquence des cellules infectées ont été évalués par le logiciel de microscope à fluorescence (voir Tableau des matériaux). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Astrocytes et infection par les microglies par des parasites protozoaires fluorescents. (A) 3 x 104 astrocytes et microglies de souris C57BL/6 ont été infectés (MOI 1:1) avec T. gondii RH YFP (vert) pour 48 h, les chambres ont été fixées avec 1% PFA et tachées de DAPI (bleu). (B) 3 x 104 astrocytes et microglies de souris C57BL/6 ont été infectés (MOI 5:1) avec T. cruzi Y pour 96 h, et les chambres ont été fixées avec du méthanol pur et tachées de DAPI (vert) et mAb 2C2 anti-Ssp-4 (orange). Des images ont été acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L’importance d’étudier les fonctions isolées des cellules gliales dans des contextes biologiques distincts s’est développée au cours des deux dernières décennies. Comprendre le SNC au-delà des neurones est encore un domaine croissant dans la biologie cellulaire, en particulier dans les infections ou les conditions inflammatoires8,9,24. Les cellules glials sont cruciales non seulement pour le soutien physique des neurones (comme on l’appelait précédemment), mais aussi dans de nombreuses autres situations physiologiques telles que l’approvisionnement en énergie neuronale, le neurométabolisme, la surveillance immunitaire, l’élagage synaptique, la mise en forme et la modulation du tissu, entre autres3,25,26,27,28,29.
Puisque les astrocytes et les microglies peuvent être modulés différemment pendant l’infection ou l’inflammation stérile, il est d’une grande importance de comprendre le rôle individuel et relatif de ces cellules gliales. Bien que les microglies soient connues pour représenter le système mononucléaire de phagocyte (MPS) dans le SNC, les astrocytes ont également été décrits comme un acteur pivot dans les réponses immunitaires du SNC8. Afin de comparer le rôle de chaque sous-ensemble gliat dans le contexte de l’infection et/ ou de l’inflammation, il est obligatoire de les obtenir à partir de la même extraction et les mêmes conditions. Il y a peu de rapports au sujet des réponses effectrices des microglies et des astrocytes pour commander des infections, particulièrement en ce qui concerne des parasites protozoaires. En ce sens, nous avons récemment démontré l’exigence de NLRP3 inflammatoire au contrôle de la réplication T. cruzi dans les microglies, mais pas dans les astrocytes par un mécanisme impliquant l’oxyde nitrique (NO) sécrétion11.
Ce protocole décrit une méthode qui se concentre sur l’extraction simultanée des deux populations de cellules gliales les plus abondantes, les astrocytes et les microglies, des souris postnatales (jusqu’à 3 jours). Les souris nouveau-nées âgées de plus de 3 jours peuvent être utilisées, mais nous avons constaté que le rendement des deux cellules diminue légèrement au fil du temps (données non montrées). Notre méthode diffère des protocoles précédemment décrits pour les astrocytes ou l’isolement des microglies parce que nous nous sommes concentrés sur l’obtention et l’isolement des deux types de cellules dans la même extraction, dans les mêmes conditions, optimisant ainsi l’utilisation des animaux expérimentaux et améliorant l’étude du rôle relatif pour ces cellules dans les contextes immunologiques. De plus, notre protocole a également optimisé le rendement des deux types de cellules. Le rendement est généralement de 3 à 5 x 106 astrocytes et de 3 à 5 x 105 microglies par flacon. Comparez cela à d’autres protocoles qui se traduisent par moins de cellules utilisant plus d’animaux par flacon T-75 (certains protocoles utilisent 2-3 animaux par flacon)30,31.
Un autre avantage de ce protocole est le temps nécessaire pour obtenir des astrocytes et des microglies isolés. Dans les 14 jours, il est possible d’obtenir des microglies matures. En fait, il est important de souligner que, comme Flode et Combs l’ont démontré, les microglies âgées de plus de 14 jours présentent une capacité diminuée de sécrétion de cytokines; il est très important d’envisager cela dans les contextes neuroimmunologiques30. Malgré le fait que les fabricants matures pour l’astrocyte ne sont pas complètement compris, GFAP est largement utilisé pour caractériser les astrocytes réactifs et actifs. Certains protocoles atteignent des niveaux de 90% de cellules positives GFAP seulement après 21 ou 28 jours de culture. Pour cette raison, nous avons proposé une méthode qui a fourni, les cellules qui sont immunoresponsives et la plupart du temps matures dans les 7-14 jours. Bien que lapurity peut être plus faible que d’autres méthodes pour les astrocytes31 et les microglies30, l’objectif principal était d’obtenir des microglies et des astrocytes en plus grandes quantités dans une extraction concomitante. Nous comprenons que les populations cellulaires pourraient être mieux triées ou isolées avec la séparation des colonnes pour améliorer leurs puretés. Pour cela, d’autres marqueurs cellulaires peuvent être inclus, tels que Iba1 ou TMEM119 pour les microglies; Aquaporin-4 ou S100B pour les astrocytes, CC1 ou O4 pour les oligodendrocytes et NeuN pour les neurones22,31,32,33. Cependant, une perte importante de cellules à la fin du protocole devrait être considérée.
Ainsi, nous avons fourni une méthode modifiée pour obtenir en même temps des microglies et des astrocytes dans un protocole efficace et bon marché. En outre, ce protocole fournit les avantages d’un grand rendement permettant les études comparatives des sous-ensembles gliales dans les contextes neuroimmunologiques, comme illustré ici pendant l’infection de T. cruzi et de T. gondii.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le professeur Renato A. Mortara de l’Université fédérale de Sao Paulo (UNIFESP) pour mAb 2C2 anti-Ssp-4. Ce travail a été soutenu par des subventions de Fundaço de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, subvention 2017/25942-0 à K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient-fico e Tecnol-ogico (CNPq, 402100/2016-6 à K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) et Coordenaçao de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nàvel Superior (CAPES, Code financier 001). M.P.A. reçoit une bourse du CNPq, A.L.O.P. reçoit une bourse de CAPES, et I.S.F et L.Z.M.F.B. reçoivent une bourse de la FAPESP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 μmm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat - anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS - Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 °C with trypsin |
References
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