Summary
يمكن التقاط كامل هيكل 3D والمحتوى الخلوي من organoids ، فضلا عن تشابهها الظاهري إلى الأنسجة الأصلية باستخدام تحليل خلية واحدة 3D بروتوكول التصوير الموصوف هنا. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على مجموعة واسعة من الأعضاء المختلفة في الأصل والحجم والشكل.
Abstract
وقد فتحت التكنولوجيا العضوية ، في المختبر 3D زراعة الأنسجة المصغرة ، نافذة تجريبية جديدة للعمليات الخلوية التي تحكم تطوير الجهاز وظيفة ، فضلا عنالمرض. وقد لعبت المجهر الفلوريسنس دورا رئيسيا في وصف تكوينها الخلوي بالتفصيل وإظهار تشابهها مع الأنسجة التي تنشأ من. في هذه المقالة، نقدم بروتوكول شامل للتصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأعضاء العضويين بالكامل عند وضع العلامات المناعية. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتصوير الأعضاء المختلفة في الأصل والحجم والشكل. حتى الآن قمنا بتطبيق هذه الطريقة على مجرى الهواء والقولون والكلى والكبد organoids مشتقة من الأنسجة البشرية السليمة، فضلا عن الأورام البشرية والغدد الثديية الماوس. نحن نستخدم عامل المقاصة البصرية، FUnGI، والتي تمكن من الحصول على كامل 3D organoids مع فرصة لتحديد كمية خلية واحدة من علامات. تم تحسين هذا البروتوكول لمدة ثلاثة أيام من الحصاد العضوي إلى تحليل الصور للتصوير ثلاثي الأبعاد باستخدام المجهر confocal.
Introduction
وقد مكن تقدم أساليب الثقافة الجديدة ، مثل التكنولوجيا العضوية ، ثقافة الأجهزة في طبق1. تنمو الهياكل العضوية إلى هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) تعيد تجميع نسيجها الأصلي لأنها تحافظ على الصفات الظاهرية والوظيفية. Organoids هي الآن مفيدة لمعالجة الأسئلة البيولوجية الأساسية2، والأمراض النمذجة بما في ذلك السرطان3، ووضع استراتيجيات العلاج الشخصية4،5،6،7. منذ البروتوكول الأول لتوليد الأعضاء المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة المعوية8، امتدت تقنية الجهاز لتشمل مجموعة واسعة من الأنسجة الصحية والسرطانية المشتقة من الأعضاء بما في ذلك البروستاتا9، والدماغ10، والكبد11،12، والمعدة13، والثدي14،15، بطانة الرحم16، الغدة اللعابية17، طعم18، البنكرياس19، والكلى20.
وقد اتفق على تطوير organoids مع صعود تقنيات جديدة المجهرية الحجمية التي يمكن تصور بنية النسيج جبل كله في 3D21،22،23،24. التصوير ثلاثي الأبعاد متفوق على تصوير قسم الأنسجة 2D التقليدي في تصور التنظيم المعقد للعينات البيولوجية. المعلومات ثلاثية الأبعاد تثبت أنها ضرورية لفهم التكوين الخلوي، وشكل الخلية، وقرارات مصير الخلية، والتفاعلات الخلوية الخلية للعينات البيولوجية سليمة. تقنيات لتقطيف البصرية غير تدميرية، مثل المجهر المسح الضوئي بالليزر confocal أو متعدد الفوتون (CLSM وMLSM) والمجهر الفلوري ورقة الضوء (LSFM)، تمكن الآن التصور مجتمعة من كل التفاصيل الدقيقة، فضلا عن بنية الأنسجة العامة، داخل عينة بيولوجية واحدة. هذا النهج التصوير القوي يوفر الفرصة لدراسة التعقيد الهيكلي الذي يمكن أن يكون على غرار مع organoids25 وخريطة التوزيع المكاني ، والهوية الظاهرية وحالة الخلوية لجميع الخلايا الفردية التي تؤلف هذه الهياكل 3D.
في الآونة الأخيرة نشرنا بروتوكول مفصل للتصوير 3D عالية الدقة من organoids ثابتة ومبرّدة26. تم تصميم هذا البروتوكول على وجه التحديد والأمثل لمعالجة الهياكل العضوية الحساسة، بدلا من منهجيات للأنسجة سليمة كبيرة مثل DISCO27،28،29،30،31،وSIES32،33. على هذا النحو، هذه الطريقة قابلة للتطبيق عموما على مجموعة واسعة من الأعضاء المختلفة في الأصل والحجم والشكل والمحتوى الخلوي. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع غيرها من بروتوكولات التصوير الحجمي التي غالبا ما تتطلب وقتا طويلا والجهد، بروتوكول لدينا هو غير متطلب ويمكن أن تكتمل في غضون 3 أيام. لقد قمنا بتطبيق بروتوكول التصوير ثلاثي الأبعاد لدينا لتصور بنية وتركيبة خلوية من الأنظمة العضوية المطورة حديثًا المشتقة من الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك المسالك الهوائية البشرية34، الكلى20، الكبد11، و organoids سرطان الثدي البشري15. في تركيبة مع تتبع نسب الفلورسنت متعددة الألوان ، تم استخدام هذه الطريقة أيضًا للكشف عن القدرة البيولوجية للخلايا القاعدية في الماوس الشعاعي الشعاعيالشعاعي 14.
هنا، ونحن صقل البروتوكول من خلال إدخال وكيل المقاصة غير تكسوم FUnGI35. يتم تحقيق FUnGI المقاصة في خطوة حضانة واحدة ، وأسهل في التركيب بسبب لزوجتها ، ويحافظ على الفلورسين بشكل أفضل أثناء التخزين. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم سلفات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى العازلة غسل لتعزيز البقع النووية، فضلا عن طريقة سيليكون القائمة على التركيب لإعداد الشريحة سهلة قبل المجهر. ويقدم الشكل 1 نظرة عامة رسومية للبروتوكول(الشكل 1A)وأمثلة على الأجهزة ذات الصور ثلاثية الأبعاد(الشكل 1B-D). وباختصار، يتم استرداد organoids من مصفوفة 3D، الثابتة والممناعية، مسح بصريا، وصور باستخدام المجهر confocal ثم 3D المقدمة مع برامج التصور.
Protocol
يتوافق استخدام العضيات المشتقة من الماوس مع المعايير التنظيمية وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان التابعة لمعهد والتر وإليزا هول (WEHI). تم استرداد جميع العينات العضوية البشرية من البنوك الحيوية من خلال تكنولوجيا Hubrecht Organoid (HUB، www.hub4organoids.nl). وحصلت اللجنة الأخلاقية الطبية في أوتريخت على التراخيص بناء على طلب المركز من أجل ضمان الامتثال لقانون البحوث الطبية الهولندية المتعلقة بالمواضيع البشرية، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من الجهات المانحة عند الاقتضاء.
1- إعداد الكواشف
- لإعداد 4٪ (ث / الخامس) شبهformaldehyde (PFA)، سخني 400 مل من المالحة الفوسفات المخزنة (PBS) إلى أقل قليلا من 60 درجة مئوية في حمام مائي. إضافة 20 غرام من مسحوق PFA وتذوب باستخدام مُحرك.
- بعد ذلك، أضف بضع قطرات من 10 M NaOH. اتركي البرودة على الجليد وأضفي بضع قطرات من 10 م 10 من كلوريد الهلورات لضبط درجة ح H إلى 7.4. أعلى مع برنامج تلفزيوني إلى 500 مل و aliquot (مخزن في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر).
ملاحظة: لا تسخن فوق 60 درجة مئوية لتجنب تدهور PFA. وقت التحضير = 4 ساعات.
- بعد ذلك، أضف بضع قطرات من 10 M NaOH. اتركي البرودة على الجليد وأضفي بضع قطرات من 10 م 10 من كلوريد الهلورات لضبط درجة ح H إلى 7.4. أعلى مع برنامج تلفزيوني إلى 500 مل و aliquot (مخزن في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر).
- لإعداد برنامج تلفزيوني مع توين-20 (PBT) (0.1٪ v/v)، أضف 1 مل من توين-20 إلى 1 لتر من برنامج تلفزيوني (مخزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع).
ملاحظة: وقت التحضير = 10 دقائق. - لإعداد 100 مل من 0.5 Methylenediaminetetraacetic حامض (EDTA), إضافة 18.6 غرام من EDTA و 2.5 غرام من NAOH إلى 80 مل من dH2O. ضبط درجة الحموضة إلى 8 مع 1 M NaOH وملء إلى 100 مل مع dH2O.
- لتحضير 500 مل من 1 م تريس، قم بذوبان 60.55 غرام من تريس مع 42 مل من تتركز (36-38٪ ) HCl في 300 مل من dH2O. ضبط درجة ح H إلى 8 وملء إلى 500 مل.
- لإعداد العازلة غسل الأعضاء (OWB)، إضافة 1 مل من تريتون X-100، 2 مل من 10٪ (ث / الخامس) SDS و 2 غرام من الألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى 1 لتر من برنامج تلفزيوني (مخزن في 4 °C تصل إلى 2 أسابيع).
ملاحظة: وقت التحضير = 10 دقائق. - لجعل 220 مل من FUnGI، مزيج 110 مل من الجلسرين مع 20 مل من dH2O، 2.2 مل من تريس العازلة (1 م، pH 8.0) و 440 ميكرولتر من EDTA (0.5 م). إضافة 50 غرام من الفركتوز ويخلط في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام حتى يذوب. عندما تكون واضحة، إضافة 49 غرام من الفركتوز ويخلط حتى يذوب. ثم يضاف 33.1 غرام من اليوريا ويخلط حتى يذوب (تخزينها عند 4 درجات مئوية في الظلام).
ملاحظة: لا تسخن كما كراميل الفركتوز في درجات حرارة أعلى. FUnGI يتكون من 50٪ (v/v) الجلسرين، 9.4٪ (v/v) dH2O، 10.6 mM تريس قاعدة، 1.1 mM EDTA، 2.5 M الفركتوز و 2.5 M يوريا. وقت التحضير = 1 يوم. - لإعداد PBS-BSA (1٪ ث / الخامس)، حل 1 غرام من BSA في 100 مل من برنامج تلفزيوني (مخزن في 4 درجة مئوية تصل إلى 2 أسابيع).
ملاحظة: وقت التحضير = 10 دقائق.
2. انتعاش الجهاز
ملاحظة: تنطبق الخطوات التالية على الأعضاء التي تزرع في استخراج الغشاء الطابق السفلي (BME) التي كانت مُزَوَّرة في 24 بئراً بحجم 100−500 ميكرومتر.
- استلهم الوسط الثقافي ويغسل 1x مع PBS الباردة المثلجة. تجنب تعطيل المصفوفة ثلاثية الأبعاد.
- وضع لوحة على الجليد وإضافة 1 مل من الجليد الباردة حل الانتعاش الخلية(جدول المواد)إلى كل بئر. احتضان 30−60 دقيقة عند 4 درجات مئوية على شاكر أفقي (40 دورة في الدقيقة).
ملاحظة: يجب أن تذوب قطرات المصفوفة ثلاثية الأبعاد تماماً. - معطف تلميح ماصة 1 مل مع BSA عن طريق غمس في 1٪ PBS-BSA و pipetting صعودا وهبوطا 2x. هذا الطلاء سوف تمنع organoids من التمسك تلميح. لتلطف الجانب الداخلي من أنبوب مخروطي 15 مل، املأ 5 مل من 1% PBS-BSA، عكس 2−3x وتجاهل PBS-BSA.
ملاحظة: هذا الطلاء ضروري لجميع المواد الاستهلاكية البلاستيكية حتى التثبيت (الخطوة 3.3). - باستخدام طرف مغلفة، بلطف إعادة تعليق محتوى البئر 5-10x ونقل organoids إلى أنابيب 15 مل المغلفة. يمكن تجميع العضيات من آبار مختلفة بنفس الهوية في نفس الأنبوب.
- إضافة 1 مل من الجليد البارد 1٪ PBS-BSA إلى كل ثقافة بشكل جيد لشطف وجمع جميع organoids.
- إضافة PBS الباردة إلى 10 مل وتدور أسفل لمدة 3 دقائق في 70 × ز و 4 درجة مئوية للحصول على بيليه ضيق دون طبقة مرئية من مصفوفة 3D. إزالة بعناية فائقة.
3. التثبيت والحجب
- بعناية resuspend organoids في 1 مل من الجليد البارد PFA باستخدام طرف المغلفة 1 مل.
- في 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. إعادة تعبئة بلطف organoids في منتصف الطريق من خلال وقت التثبيت باستخدام طرف 1 مل المغلفة لضمان التثبيت حتى بين جميع organoids.
- إضافة 10 مل من الجليد البارد PBT إلى الأنبوب، مزيج بلطف عن طريق عكس الأنبوب، احتضان لمدة 10 دقيقة وتدور أسفل في 70 × ز،وكلاهما في 4 °C.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا لا حاجة طلاء نصائح عموما لأن معظم أنواع organoid لا تلتصق تلميح بعد التثبيت. ومع ذلك، قد تتطلب بعض العضيات البلاستيك المغلفة حتى بعد التثبيت. - كتلة organoids عن طريق resuspending بيليه في الجليد الباردة OWB (على الأقل 200 ميكرولتر من OWB في البئر) ونقل organoids إلى 24 لوحة تعليق جيدا.
ملاحظة: يمكن تقسيم العضيات من بيليه كبيرة واحدة على آبار متعددة لأداء بقع مختلفة. - احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
4. التميّز المناعي
- ماصة 200 μL من OWB في بئر فارغة لتكون مرجعا جيدا.
ملاحظة: يمكن أيضًا إجراء تحديد المناعة في ألواح 48 أو 96 بئرًا لتقليل استخدام الأجسام المضادة. ومع ذلك، يجب أن يكون المستخدم على علم بأن كلا من تلطيخ وغسل الأداء يمكن أن تخفض بسبب حجم أصغر. - السماح للعضية لتسوية في الجزء السفلي من لوحة.
ملاحظة: يمكن التحقق من ذلك باستخدام منظار مجسم ثم يتم تسهيل باستخدام خلفية داكنة. - إمالة لوحة 45 درجة وإزالة OWB ترك organoids في 200 ميكرولتر من OWB (استخدام المرجع جيدا لتقدير 200 ميكرولتر).
- إضافة 200 ميكرولتر من OWB مع الأجسام المضادة الأولية 2x مركزة (على سبيل المثال، E-cadherin [1:400] وKi67 [1:200] للنتائج في الشكل 1؛ الكيراتين 5 [1:500]، الكيراتين 8/18 [1:00] 200], MRP2 [1:50], وKi67 [1:200] للحصول على نتائج في الشكل 2) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حين هزاز أقل ما يقال / تهتز (40 دورة في الدقيقة على شاكر الأفقي).
- في اليوم التالي، إضافة 1 مل من OWB.
- السماح للعضيات لتسوية في الجزء السفلي من لوحة لمدة 3 دقائق. إزالة OWB ترك 200 μL في لوحة. إضافة 1 مل من OWB وغسل 2 ساعة مع هزاز خفيف / اهتزاز.
- كرر الخطوة 4.6 مرتين أكثر.
- السماح للعضيات لتسوية في الجزء السفلي من لوحة لمدة 3 دقائق. إزالة OWB ترك 200 ميكرولتر في البئر.
- إضافة 200 ميكرولتر من OWB مع الأجسام المضادة الثانوية، والأجسام المضادة المقترنة والأصباغ 2x تتركز (على سبيل المثال، DAPI [1:1000]، الفئران AF488 [1:500]، الماوس AF5555 [1:500]، phalloidin-AF647 [1:100] للنتائج في الشكل 1. DAPI [1:1000], فئران AF488 [1:500], أرنب AF5555 [1:500], ماوس AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] للنتائج في الشكل 2; DAPI [1:1000] ، phalloidin - AF647 [1:100] للحصول على نتائج في الشكل 3) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في حين هزاز أقل ما يقال / تهتز.
- في اليوم التالي، كرر الخطوات 4.5−4.7.
- نقل organoids إلى أنبوب 1.5 مل وتدور في 70 × ز لمدة 3 دقائق.
5. البصرية المقاصة من organoids
- إزالة قدر الإمكان من OWB عن طريق الأنابيب دون تعطيل organoids.
- إضافة FUnGI (على الأقل 50 ميكرولتر، RT) باستخدام طرف 200 ميكرولتر مع نهاية قطع وإعادة بناء بلطف لمنع تشكيل فقاعة. احتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: قد يتسبب إزالة البصريات بواسطة FUnGI في انكماش الأنسجة البسيط. وهذا لن يؤثر على مورفولوجيا أحادية الطبقات ومتعددة الطبقات. ومع ذلك، قد ينهار العضوية أحادية الطبقات ذات شكل كروي مع التجويفات الكبيرة. يمكن إيقاف البروتوكول هنا ويمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية (لمدة أسبوع على الأقل) أو عند -20 درجة مئوية (لمدة 6 أشهر على الأقل).
6. إعداد الشريحة للتصوير confocal
- إعداد حقنة 10 مل مع تسرب السيليكون (جدول المواد). نعلق 200 μL تلميح وقطع نهاية للسماح تدفق لطيف من السيليكون لزج بعد الضغط على حقنة. استخدم الحقنة لرسم مستطيل من 1 سم × 2 سم في منتصف الشريحة.
- قطع نهاية 200 ميكرولتر تلميح ونقل organoids في FUnGI إلى منتصف المستطيل.
- ضع غطاء على القمة. لتقليل فقاعات الهواء المحاصرة، ضع الجانب الأيسر من الغطاء أولاً، ثم قم بخفض الغطاء ببطء من اليسار إلى اليمين حتى لا يكون هناك هواء محاصر ثم حرر الغطاء.
ملاحظة: يمكن استخدام الفواصل التي هي simililar في الحجم إلى organoids لمنع تلفها. - تطبيق بلطف الضغط على جميع حواف غطاء لإرفاق بحزم على تسرب السيليكون. الشريحة الآن جاهزة للتصوير.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا ويمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية (لمدة أسبوع على الأقل) أو -20 درجة مئوية (لمدة 6 أشهر على الأقل).
7- الحصول على الصور ومعالجتها
- باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر confocal (جدول المواد)، صورة الشريحة مع غمر متعددة 25x أو النفط غمر 40x الهدف للتصوير confocal.
- استخدم إعدادات الامتلاك التالية للهدف 25x: إطار وضع المسح الضوئي، حجم الإطار 1024 × 1024، حجم voxel 332 نانومتر × 332 نانومتر × 1.2 ميكرومتر، وقت البكسل يسكن < 2 ميكرومتر، المسح الضوئي ثنائي الاتجاه، متوسط الرقم 1، عمق البت 8. لتقليل الإضاءة الضوئية، استخدم طاقة ليزر منخفضة (<5% بشكل عام، <10% لضعف البقعة).
- استخدم وضع Z-مكدس لتعريف الحدود السفلية والعليا وتعيين حجم الخطوة Z إلى الأمثل. عند تصوير هياكل أعضاءية كبيرة أو عدة أجهزة أو اعضية معا، استخدم وضع التبليط مع 10٪ تتداخل وتشير إلى منطقة الاهتمام.
ملاحظة: باستخدام هذه الإعدادات، يكون حجم البيانات لعضية نموذجية بقطر <300 ميكرومتر <1 غيغابايت.
- بالنسبة لمجموعات بيانات المسح الضوئي للبلاط، قم بخياطة ملفات التصوير في البرنامج مصحوبة بالمجهر (جدول المواد). في قسم المعالجة، حدد خياطة كطريقة، واختر إخراج جديد تحت المعلمات وحدد الملف الذي تريد غرزته. اضغط على تطبيق لبدء خياطة.
- الحصول على تمثيل 3D المقدمة من التصوير تحت علامة التبويب عرض 3D في برنامج التصوير(جدول المواد)ولاحقا تحسين خصائص السطوع والتباين وتقديم 3D. تصدير لقطات RGB للنتائج كملفات TIFF.
Representative Results
التصوير organoids في 3D تمكن التصور من الهندسة المعمارية، وتكوين الخلايا وكذلك العمليات داخل الخلايا في تفاصيل كبيرة. وهذه التقنية المقدمة غير متطلبة، ومن المفترض أنها يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من النظم العضوية المشتقة من مختلف الأعضاء أو الأنواع المضيفة.
ويتضح قوة التصوير 3D مقارنة مع التصوير 2D من خلال صور من الماوس الغدد الثديية الغدد التي تم إنشاؤها باستخدام الأساليب المنشورة مؤخرا14. الطبقة المركزية لهذه الأعضاء يتكون من العمود على شكل K8/K18-positive الخلايا البارزة والطبقة الخارجية تحتوي على الخلايا القاعدية K5-postive ممدود (الشكل 2A) ، والتي تتلخص في مورفولوجيا الغدة الثديية في الجسم الحي. هذه المنظمة المستقطبة هو التحدي لتقدير من قسم بصري 2D من أن نفس organoid(الشكل 2B، لوحة الأوسط). مثال آخر على بنية معقدة من المستحيل تفسيرها بدون معلومات ثلاثية الأبعاد هي شبكة 11 2B -2B إيجابية MRP2-canaliculi التي تسهل جمع السائل الصفراوية من الأعضاء الكبد البشري11 (الشكل 2B). وهذا يجسد كيف يسمح أسلوبنا التصور من السمات الهيكلية الأساسية من organoids. وعلاوة على ذلك، فإن الجودة التي تم الحصول عليها والدقة تسمح بالتجزئة شبه الآلية وتحليل الصور. وهكذا، يمكن قياس إجمالي عدد الخلايا ووجود علامات في أنواع فرعية خلوية محددة في العضية بالكامل. ونحن نوضح ذلك عن طريق تجزئة نواة من الجهاز بأكمله التي تحتوي على 140 الخلايا، منها 3 خلايا عرض الإيجابية العالية لعلامة دورة الخلية Ki67(الشكل 2C). يتم اختيار قناة DAPI كقناة مصدر، ويتم إنشاء أجزاء بناء على خطوة عتبة كثافة وقطر كروية 10 ميكرومتر. يتم تقسيم لمس الكائنات حسب المنطقة التي تنمو من نقاط البذور. وأخيرا، يتم تطبيق مرشح حجم 10 voxels لإزالة شرائح الضوضاء الصغيرة التي تسبب. لكل قطعة تمثل نواة، يتم تصدير متوسط كثافة قناة Ki67 للتآمر.
قمنا مؤخرا بتطوير عامل المقاصة البصرية FUnGI35، والتي نحن الآن دمجها في هذا البروتوكول لصقل شفافية organoids. FUnGI سهل الاستخدام ، حيث يتم تحقيق المقاصة بسهولة من خلال خطوة حضانة واحدة بعد التلطيخ المناعي. ميزة إضافية من العامل هو اللزوجة، مما يجعل من السهل على معالجة العينة أثناء تركيب الشريحة. تحتفظ العينات الفلورية في FUnGI بفلورها حتى عند تخزينها لعدة أشهر عند -20 درجة مئوية. نثبت أن FUnGI يتفوق على غير مكتشف وفركتوز-غليسيرول في جودة الإشارة الفلورية العميقة في الجهاز العضوي(الشكل 3A, B), وأن لديها organoids التي تم تطهيرها من FunGI بشكل عام تعزيز كثافة الفلورانس مقارنة مع organoids غير مكتشفة(الشكل 3C).
وباختصار، فإننا نصف تقنية تصوير ثلاثي الأبعاد غير متطلبة وقابلة للتكرار للحصول على بيانات حجمية من العضيات المُخصومة مناعي. ويمكن استخدام هذا البروتوكول بسهولة لتصوير مجموعة متنوعة من الأعضاء بما في ذلك تلك من أصل الماوس والإنسان، من نماذج صحية والمرض. يمكن تكييف إعداد العينة المباشر لتسهيل المجاهر الفلورية متعددة الفوتونات والورقة الخفيفة للحصول على الدقة الخلوية إلى الدقة دون الخلوية من العضية بأكملها.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لبروتوكول التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة. يتم استرداد الأجهزة من مصفوفة 3D الخاصة بهم. يتم إجراء التثبيت والحجب قبل المناعة بالأجسام المضادة والأصباغ. يتم تحقيق المقاصة البصرية في خطوة واحدة باستخدام وكيل المقاصة FUnGI. يمكن تنفيذ عرض الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج التصوير. (أ) نظرة عامة تخطيطية عن الإجراء. (B) مسح كامل جبل 3D صورة confocal من مناعة القولونية البشرية organoid إلى F-actin وE-cadherin (E-cad) (25x هدف النفط). شريط مقياس = 40 ميكرومتر. (C) مسح كامل جبل 3D صورة confocal. شريط مقياس = 20 ميكرومتر. (D) القسم البصري الموسع من القولون البشري organoids immunolabeled لF-actin، E-cadherin (E-cad) وKi67 (25x هدف النفط). شريط مقياس = 5 μm. وقد تم تعديل هذا الرقم من Dekkers et al.26. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصوير الحجمي يتصور العمارة ثلاثية الأبعاد المعقدة. صور Confocal تمثل مجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد (اللوحة اليسرى) والأقسام البصرية 2D (اللوحة الوسطى) والمناطق ثلاثية الأبعاد لمنطقة موسعة (لوحة يمين). ( أ) organoid مشتقة من خلية واحدة القاعدية من الغدة الماوس ماماري توضح تنظيم 3D من الخلايا القاعدية الثديية ممدود التي تحيط الخلايا الإنارة أو المسمى لK8/18، K5 و F-actin (الفركتوز- الجلسرين المقاصة؛ 25x هدف النفط). تمثل أشرطة المقياس 55 ميكرومتر (اللوحة اليسرى) و40 ميكرومتر (الألواح الوسطى والأيسر). (ب) جهاز الكبد الجنيني البشري مع شبكة معقدة 3D من canaliculi MRP2 إيجابية، وصفت لDAPI، MRP2 وF-actin (الفركتوز-الجلسرين المقاصة؛ هدف النفط 40x). تمثل أشرطة المقياس 25 ميكرومتر (اللوحة اليسرى) و8 ميكرومتر (الألواح الوسطى والأيسر). (C) Confocal 3D كامل جبل صورة من الجهازية الجنينية الكبد الإنسان المسمى مع DAPI وKi67 (لوحة اليسار) وصورة مجزأة على قناة DAPI باستخدام برنامج التصوير (لوحة الأوسط). شريط مقياس = 15 ميكرومتر. رسم الرسم البياني يمثل الشدة الوسط Ki67 في جميع الخلايا (DAPI-segmented) من الجهاز العضوي بأكمله (140 خلية) (اللوحة اليمنى). وقد تم تعديل هذا الرقم من Dekkers et al.26. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إزالة بصرية من الأعضاء مع FUnGI. (A) صور تمثيلية من الأعضاء القولونية البشرية المسمى مع F-actin (الأخضر) وDAPI (رمادي) وصورة مع عدم وجود المقاصة، مسح مع الفركتوز-الجلسرين أو مسح مع FUnGI (هدف النفط 25x). اللوحة اليسرى: تقديم ثلاثي الأبعاد للعضية. اللوحة اليمنى: المقطع البصري من الجهاز على عمق 150 ميكرومتر. بالنسبة لحالة "عدم المقاصة" كان لا بد من زيادة سطوع الصورة بالمقارنة مع شروط "الفركتوز-الجلسرين" و "FUnGI" لتصور الجهاز. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. (B)الانحدار غير الخطي تناسب إظهار انخفاض كثافة DAPI مع زيادة العمق Z لمختلف طرق المقاصة البصرية. وتمثل القيم كثافة الخلايا الفردية التي اكتشفت بواسطة تجزئة DAPI ويتم تطبيعها إلى متوسط كثافة DAPI لأول 50 ميكرومتر من الجهاز العضوي. لتجنب التقليل من شأن التوهين الناجم عن الخلايا الأكثر إشراقا على الحواف العميقة والهياكل الناشئة ، تم تحليل المناطق الوسطى فقط من organoids. (C) تم تصوير ثلاثة أعضاء لكل حالة من حجم وعمق مماثلين نحو غطاء الغطاء باستخدام إعدادات المجهر متطابقة. كانت مجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد الكاملة عبارة عن خلية مفردة مجزأة على إشارة DAPI للمقارنة. رسم بياني شريطي يوضح متوسط كثافة DAPI مع طرق مسح مختلفة على مجموعات البيانات المجزأة بالكامل. يتم وصف البيانات على أنها متوسط ± SD. القيم هي كثافة > 3800 الخلايا الفردية التي تم الكشف عنها بواسطة تقسيم DAPI. = ف < 0.0001، Kruskal-Wallis اختبار مع اثنين من الوجهين دان مقارنة متعددة اختبار ما بعد مخصص. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هنا، وضعنا بروتوكول مفصل للتصوير ثلاثي الأبعاد من الأعضاء سليمة مع قرار خلية واحدة. لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، يجب اتخاذ بعض الخطوات الهامة. في هذا القسم نبرز هذه الخطوات وتوفير استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
الخطوة الحاسمة الأولى هي إزالة المصفوفة ثلاثية الأبعاد. يتم نشر معظم organoids في المختبر مع استخدام المصفوفات التي تحاكي البيئة في الجسم الحي خارج الخلية لتعزيز تشكيل هياكل 3D المستقطبة بشكل جيد. التثبيت والتلطيخ اللاحقة داخل مصفوفة 3D ممكن، ولكن يمكن أن يكون غير مؤات لاختراق الأجسام المضادة أو يمكن أن تولد إشارة خلفية عالية (البيانات غير مبينة). إزالة المصفوفات بكفاءة يمكن أن تتأثر نوع من المصفوفة، وكمية وحجم organoids واستزراع لفترات طويلة. لذلك، قد يكون التحسين مطلوبة لظروف ثقافة مختلفة. بالنسبة للعضيات المُثقبة في ماتريجل أو BME، فإن خطوة 30-60 دقيقة في محلول استرداد الخلايا الباردة الجليد كافية لإذابة المصفوفة دون الإضرار بالأعضاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي إزالة المصفوفة ثلاثية الأبعاد الداعمة إلى فقدان الهياكل الأصلية وتعطيل الاتصالات العضوية مع أنواع الخلايا الأخرى، على سبيل المثال عندما تكون organoids مُزَوَّرة مع الخلايا الليفية أو الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، التثبيت العضدي الأمثل أمر حاسم في الحفاظ على بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد، وبروين استضدية والتقليل من الفلوروس. تحديد لمدة 45 دقيقة مع PFA 4٪ في 4 درجة مئوية عادة ما يكفي لوضع العلامات من مجموعة واسعة من organoids والمستضدات. ومع ذلك ، فإن خطوة التثبيت الأطول ، تصل إلى 4 ساعات ، عادة ما تكون أكثر ملاءمة للعضوية التي تعبر عن بروتينات المراسل الفلورسنت ، ولكنها ستتطلب تحسينًا لفلوروفوريس مختلفة. مرات التثبيت أقصر من 20 دقيقة غير كافية لتسمية بشكل صحيح F-actin باستخدام تحقيقات phalloidin. وثمة مسألة أخرى شائعة هي فقدان الأعضاء أثناء البروتوكول. ولذلك من المهم أن (ط) بعناية النصائح الأنابيب معطف الأنابيب والأنابيب مع 1٪ BSA-PBS كما هو موضح عند التعامل مع organoids غير المثبتة لمنعهم من التمسك البلاستيك، (2) استخدام لوحات منخفضة الالتزام أو تعليق لتجنب العينة من التمسك لوحة، و (3) السماح بوقت كاف لعضويدات لتسوية في الجزء السفلي من لوحة قبل إزالة المخازن المؤقتة بعناية. قد Pipetting اللزوج FUnGI إدخال فقاعات. إن معالجة العينة التي تم مسحها في RT تقلل من اللزوجة وتحسن سهولة الاستخدام، وبالتالي تقلل من فقدان الأعضاء. في حين أن معظم organoids هي سهلة التعامل معها، organoids الكيسي مع التجويف الموسع لديها ميل عالية إلى الانهيار عند تحديد مع PFA 4٪ أو عندما مسح مع FUnGI. ويمكن تقليل هذا التأثير، ولكن لا يمنع تماما، باستخدام تثبيت مختلفة (على سبيل المثال، formalin أو PFA-glutaraldehyde). ومع ذلك، يمكن أن يؤثر هذا على الفلوروست التلقائية، واختراق الأجسام المضادة وتوافر epitope. عندما تظهر organoids الكيسي مطوية بعد المقاصة، وينصح لتخطي خطوة المقاصة والصورة عن طريق المجهر متعددة الفوتون، والتي هي أقل إعاقة من قبل تشتت الضوء. وأخيرا، يمكن الحصول على كامل هيكل 3D من organoids يكون تحديا ويتطلب الحد الأدنى من المسافة بين غطاء وعضوي. بالإضافة إلى ذلك، عندما يكون لدى الأعضاء مساحة للتحرك في عامل التركيب، يمكن أن يؤدي هذا إلى تحولات X و Y أثناء تسجيل البيانات في العمق Z. يمكن استخدام أقل تسرب السيليكون أثناء إعداد الشريحة حل دون الأمثل تصاعد بين الأغطية والمجهر الشريحة. ومع ذلك، قد يؤدي القليل جدا من السيليكون إلى ضغط organoid وفقدان هيكلها 3D المتأصلة. FUnGI يحسن التعامل مع تصاعد الشريحة واستقرار organoids أثناء التصوير، نظرا لارتفاع اللزوجة.
في حين يمكن استخدام هذا البروتوكول لمجموعة واسعة من التطبيقات لدراسة عمق المحتوى الخلوية والهندسة المعمارية 3D من organoids سليمة، ينبغي النظر في بعض القيود. وهذه المنهجية منخفضة نوعا ما وتستغرق وقتا طويلا. في الواقع ، يجب على المستخدمين أن يضعوا في اعتبارهم أن التصوير العضويات الكبيرة سليمة في 3D يتطلب كل من التبليط واكتساب العينة في Z ، مما يؤدي إلى فترات حيازة طويلة. ويمكن تحقيق أسرع التصوير باستخدام أصول المجهر ، بما في ذلك رنانة أو الغزل الماسح الضوئي القرص ، أو عن طريق ضوء ورقة تكنولوجياالمجهر 26. وثمة اعتبار آخر هو أن العلامات يمكن التعبير عنها بشكل غير متجانس بين مختلف الأعضاء من نفس العينة. لذلك، ينبغي الحصول على عدة أعضاء لالتقاط أفضل هذا التغايرية العضوية في الثقافة. وأخيرا ، في حين أن الإجراء مختبر الرطب الكامل هو واضح ، ومعالجة ما بعد البيانات يتطلب مهارات في برامج تحليل الصور للتصور 3D والكمية ، فضلا عن إحصاءات للتعدين جميع المعلومات الموجودة في مجموعة البيانات.
في العقد الماضي ، وقد تقدم مجال التصوير حجم كبير ، ويرجع ذلك إلى كل من تطوير مجموعة واسعة من وكلاء المقاصة البصرية والتحسينات في تقنيات المجهر والحساب27،30،31. بينما في الماضي معظم الدراسات التي ركزت على حجم كبير من التصوير للأعضاء أو الأورام المرتبطة بها، في الآونة الأخيرة أساليب أصغر وأكثر هشاشة الأنسجة، بما في ذلك الهياكل العضوية، وقد وضعت36،37،38. نشرنا مؤخرا طريقة بسيطة وسريعة لتصوير كل جبل organoids من أصل مختلف، وحجم وشكل على مستوى الخلية واحدة لتقديم 3D اللاحقة وتحليل الصور26، والتي عرضناها هنا مع بعض التحسينات (على سبيل المثال، FUnGI، سيليكون تصاعد) ويرافقه بروتوكول الفيديو. هذه الطريقة متفوقة على التصوير التقليدي القائم على القسم 2D في فك تشكيل الخلايا المعقدة وهندسة الأنسجة (الشكل 2) وسهلة التنفيذ في المختبرات مع مجهر confocal. مع تعديلات طفيفة على البروتوكول ، يمكن إجراء العينات متوافقة مع ، فائقة الدقة confocal ، متعدد الفوتون وكذلك التصوير ورقة الضوء ، مما يجعل هذا البروتوكول قابلة للتطبيق على نطاق واسع ويوفر للمستخدمين أداة قوية لفهم أفضل التعقيد متعدد الأبعاد التي يمكن أن تكون على غرار organoids.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نحن ممتنون جداً للدعم الفني من مركز الأميرة ماكسيما لطب الأورام للأطفال ومعهد هوبريخت وZeiss لدعم التصوير والتعاون. تم إجراء جميع التصوير في مركز الأميرة ماكسيما للتصوير. وقد حظي هذا العمل بدعم مالي من مركز الأميرة ماكسيما لأورام الأطفال. وقد تم دعم برنامج البحوث العلمية من قبل زمالة ماري كوري العالمية و فيني منحة من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO). وقد تم دعم ACR من قبل المجلس الأوروبي (ERC) منحة البدء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
| Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
| Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
| Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
| Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
| Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
| Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
| Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
| Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
| Imaris software | Bitplane | ||
| Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
| Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
| E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
| Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
| Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
| Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
| MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
| Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
| Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
| Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
| Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
| Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Workstation | Dell |
References
- Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
- Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. SnapShot: Tissue Clearing. Cell. 171 (2), 496 (2017).
- Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
- Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).
- Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884 (2019).
