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Biology

बरकरार ऑर्गेनॉइड के सिंगल-सेल रिज़ॉल्यूशन थ्री-डायमेंशनल इमेजिंग

Published: June 5, 2020 doi: 10.3791/60709
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, *1,2,3,4, *1,2,3
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 2Department of Cancer Research, Oncode Institute, Hubrecht Institute-KNAW Utrecht, 3Cancer Genomics Center (CGC), 4Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) and University Medical Center (UMC) Utrecht
* These authors contributed equally

Summary

ऑर्गेनॉइड की पूरी 3डी संरचना और सेलुलर सामग्री, साथ ही मूल ऊतक के साथ-साथ उनकी फेनोटाइपिक समानता को यहां वर्णित एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके कैप्चर किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को मूल, आकार और आकार में अलग-अलग ऑर्गेनॉइड की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।

Abstract

ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी, लघु ऊतकों की इन विट्रो 3 डी संस्कृति ने सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए एक नई प्रयोगात्मक खिड़की खोली है जो अंग विकास और कार्य के साथ-साथ बीमारी को नियंत्रित करतीहै। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ने उनकी सेलुलर संरचना को विस्तार से चित्रित करने और उनके द्वारा उत्पन्न ऊतक के लिए उनकी समानता का प्रदर्शन करने में एक प्रमुख भूमिका निभाई है। इस लेख में, हम इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग पर पूरे ऑर्गेनॉइड के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3डी इमेजिंग के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि मूल, आकार और आकार में भिन्न ऑर्गेनॉइड की इमेजिंग के लिए व्यापक रूप से लागू होती है। इस प्रकार अब तक हमने स्वस्थ मानव ऊतक से प्राप्त वायुमार्ग, कोलन, गुर्दे और यकृत ऑर्गेनॉइड के साथ-साथ मानव स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड और माउस मैमेरी ग्रंथि ऑर्गेनॉइड के लिए विधि लागू की है। हम एक ऑप्टिकल समाशोधन एजेंट, FUnGI का उपयोग करते हैं, जो मार्कर के एकल-सेल मात्राकरण के अवसर के साथ पूरे 3डी ऑर्गेनॉइड के अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। ऑर्गेनॉइड हार्वेस्टिंग से इमेज एनालिसिस तक यह तीन दिन का प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 3डी इमेजिंग के लिए अनुकूलित है।

Introduction

ऑर्गेनॉइड तकनीक जैसे उपन्यास संस्कृति विधियों की उन्नति ने एक डिश1में अंगों की संस्कृति को सक्षम किया है। ऑर्गेनॉइड त्रि-आयामी (3 डी) संरचनाओं में विकसित होते हैं जो उनके मूल ऊतक को फिर से मोड़ते हैं क्योंकि वे फेनोटाइपिक और कार्यात्मक लक्षणों को संरक्षित करते हैं। ऑर्गेनॉइड अब मौलिक जैविक प्रश्नों 2 , कैंसरसहितमॉडलिंग रोगों को संबोधित करने और व्यक्तिगत उपचार रणनीतियों को विकसित करनेकेलिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं4,5,6,,7. चूंकि आंतों के वयस्क स्टेम सेल8से प्राप्त ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए पहला प्रोटोकॉल, ऑर्गेनॉइड तकनीक ने प्रोस्टेट9,मस्तिष्क10,यकृत 1 सहित अंगों से प्राप्त स्वस्थ और कैंसर ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल करने के लिए बढ़ायाहै 1,पेट13, स्तन14,15, एंडोमेट्रियम16, लार ग्रंथि17, स्वाद कली18, अग्न्याशय19और गुर्दे20.14

ऑर्गेनॉइड के विकास ने नई मात्रा की सूक्ष्म माइक्रोस्कोपी तकनीकों के उदय से सहमति जताई है जो 3 डी 21 , 22,23,23,2424में पूरे माउंट ऊतक की वास्तुकला की कल्पना कर सकती है। 3डी इमेजिंग जैविक नमूनों के जटिल संगठन की कल्पना में पारंपरिक 2डी ऊतक अनुभाग इमेजिंग से बेहतर है। 3 डी जानकारी सेलुलर संरचना, सेल आकार, सेल भाग्य निर्णय और बरकरार जैविक नमूनों के सेल सेल इंटरैक्शन को समझने के लिए आवश्यक साबित होता है । गैर-अविनाशी ऑप्टिकल सेक्शनिंग तकनीक, जैसे कॉन्फोकल या मल्टी-फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएफएम और एमएलएसएम) और लाइट शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम), अब एक ही जैविक नमूने के भीतर दोनों ठीक विवरणों के साथ-साथ सामान्य ऊतक वास्तुकला के संयुक्त दृश्य को सक्षम करते हैं। यह शक्तिशाली इमेजिंग दृष्टिकोण संरचनात्मक जटिलता का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है जिसे ऑर्गेनॉइड25 के साथ मॉडलिंग किया जा सकता है और इन 3 डी संरचनाओं की रचना करने वाली सभी व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्थानिक वितरण, फेनोटाइपिक पहचान और सेलुलर राज्य को मैप किया जा सकता है।

हाल ही में हमने फिक्स्ड और क्लियर ऑर्गेनॉइड26के हाई-रेजोल्यूशन 3डी इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रकाशित किया। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से नाजुक ऑर्गेनॉइड संरचनाओं के प्रसंस्करण के लिए डिज़ाइन और अनुकूलित है, जैसा कि,डिस्को27, 28,क्यूबिक29,30, 31और स्पष्टता,32,,31,3333जैसे बड़े अक्षुण्ण ऊतकों के लिए पद्धतियों के विपरीत है। जैसे, यह विधि आम तौर पर मूल, आकार और आकार और सेलुलर सामग्री में भिन्न ऑर्गेनॉइड की एक विस्तृत विविधता पर लागू होती है। इसके अलावा, अन्य वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग प्रोटोकॉल की तुलना में जिन्हें अक्सर काफी समय और प्रयास की आवश्यकता होती है, हमारा प्रोटोकॉल मांग नहीं है और 3 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। हमने मानव वायुमार्ग 34, गुर्दे20,यकृत11और मानव स्तन कैंसर ऑर्गेनॉइड15सहित विभिन्न ऊतकों से प्राप्त नव विकसित ऑर्गेनॉइड प्रणालियों की वास्तुकला और सेलुलर संरचना की कल्पना करने के लिए अपना3डीइमेजिंग प्रोटोकॉल लागू किया है। बहुरंगी फ्लोरोसेंट वंश ट्रेसिंग के संयोजन में, इस विधि का उपयोग माउस मैमेरी ऑर्गेनॉइड14में बेसल कोशिकाओं की बायोपॉपेंसी को प्रकट करने के लिए भी किया गया है।

यहां, हम नॉनटॉक्सिक क्लियरिंग एजेंट एफएनजीआई35को पेश करके प्रोटोकॉल को परिष्कृत करते हैं। FUnGI समाशोधन एक इनक्यूबेशन कदम में हासिल किया जाता है, अपनी चिपचिपाहट के कारण माउंट करने के लिए आसान है, और बेहतर भंडारण के दौरान फ्लोरेसेंस को बरकरार रखता है । इसके अलावा, हम परमाणु धुंधला बढ़ाने के साथ-साथ माइक्रोस्कोपी से पहले आसान स्लाइड तैयारी के लिए सिलिकॉन आधारित-बढ़ते विधि को बढ़ाने के लिए वॉश बफर के लिए सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट (एसडीएस) पेश करते हैं। चित्रा 1 प्रोटोकॉल(चित्रा 1 ए)का ग्राफिकल अवलोकन और 3डी-इमेज्ड ऑर्गेनॉइड(चित्र 1बी−डी)के उदाहरण प्रदान करता है। संक्षेप में, ऑर्गेनॉइड को उनके 3डी मैट्रिक्स, फिक्स्ड और इम्यूनोलबेल्ड, ऑप्टिकली क्लीयर, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेज्ड और फिर 3डी से विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ्टवेयर के साथ प्रदान किया जाता है।

Protocol

माउस-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड का उपयोग नियामक मानकों के अनुरूप था और वाल्टर और एलिजा हॉल संस्थान (WEHI) पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी मानव ऑर्गेनॉइड नमूनों को हबरेक्ट ऑर्गेनॉइड टेक्नोलॉजी (हब, www.hub4organoids.nl) के माध्यम से बायोबैंकों से प्राप्त किया गया था। मानव विषय अधिनियम से जुड़े डच चिकित्सा अनुसंधान का अनुपालन सुनिश्चित करने के लिए हब के अनुरोध पर यूएमसी यूट्रेक्ट (मेटसी यूएमसीयू) की चिकित्सा नैतिक समिति द्वारा प्राधिकरण प्राप्त किए गए थे और उचित होने पर दानदाताओं से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. रिएजेंट्स की तैयारी

  1. 4% (w/v) पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करने के लिए, पानी के स्नान में 400 मिलीएल फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) को सिर्फ 60 डिग्री सेल्सियस के नीचे गर्म करें। पीएफए पाउडर के 20 ग्राम जोड़ें और एक उभारक का उपयोग कर भंग।
    1. इसके बाद, 10 एम नाओएच की कुछ बूंदें जोड़ें। बर्फ पर ठंडा होने दें और पीएच को 7.4 में समायोजित करने के लिए 10 एम एचसीएल की कुछ बूंदें जोड़ें। पीबीएस के साथ 500 एमएल और एलिकोट (2 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर) के साथ टॉप अप करें।
      नोटः पीएफए के क्षरण से बचने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस से ऊपर न गर्म करें। तैयारी का समय = 4 एच।
  2. ट्वीन-20 (पीबीटी) (01% v/v) के साथ पीबीएस तैयार करने के लिए, पीबीएस के ट्वीन-20 से 1 एल के 1 एमएल जोड़ें (4 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें)।
    नोट: तैयारी का समय = 10 मिनट।
  3. 0.5 एम एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) के 100 मिलियन एलएल तैयार करने के लिए, 18.6 ग्राम ईडीए और 2.5 ग्राम नाओएच को 80 एमएल में डीएच2ओ के साथ 80 मिलियन जोड़ें। 1 एम नाओएच के साथ पीएच को समायोजित करें और 100 मिलियन एलएल तक डीएच2ओ के साथ भरें।
  4. 1 एम ट्रिस के 500 एमएल तैयार करने के लिए, 42 मिलियन केंद्रित (36−38%) के साथ 60.55 ग्राम ट्रिस को भंग करें एचसीएल 300 एमएल में डीएच2ओ पीएच को 8 तक एडजस्ट करें और 500 एमएल तक भरें।
  5. ऑर्गेनॉइड वॉशिंग बफर (ओडब्ल्यूबी) तैयार करने के लिए ट्राइटन एक्स-100 का 1 एमएल, 10% (w/v) एसडीएस का 2 एमएल और 2 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को पीबीएस के 1 एल (4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक स्टोर) जोड़ें।
    नोट: तैयारी का समय = 10 मिनट।
  6. FUnGI के 220 मिलीएल बनाने के लिए, डीएच 2 ओ के 202एमएल के साथ ग्लाइसेरोल के 110 एमएल, ट्रिस बफर (1 एम, पीएच 8.0) के 2.2 एमएल और ईडीटीए (0.5 एम) के 440 माइक्रोन के साथ मिलाएं। फ्रक्टोज के 50 ग्राम जोड़ें और भंग होने तक अंधेरे में कमरे के तापमान (आरटी) पर मिलाएं। स्पष्ट होने पर, फ्रक्टोज के 49 ग्राम जोड़ें और भंग होने तक मिलाएं। फिर 33.1 ग्राम यूरिया जोड़ें और भंग होने तक मिलाएं (अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें)।
    नोट: उच्च तापमान पर फ्रक्टोज कारमेलाइज के रूप में गर्मी न करें। एफएनजीआई में 50% (v/v) ग्लाइसरोल, 9.4% (v/v) dH2O, 10.6 m tris बेस, 1.1 m EDTA, 2.5 M फ्रक्टोज और 2.5 एम यूरिया होते हैं। तैयारी का समय = 1 दिन।
  7. पीबीएस-बीएसए (1% w/v) तैयार करने के लिए, पीबीएस के 100 मिलीएल में बीएसए के 1 ग्राम को भंग करें (4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक स्टोर करें)।
    नोट: तैयारी का समय = 10 मिनट।

2. ऑर्गेनॉइड रिकवरी

नोट: निम्नलिखित कदम बेसमेंट झिल्ली निकालने (बीएमई) में उगाए गए ऑर्गेनॉइड पर लागू होते हैं जो 100−500 माइक्रोन के आकार के साथ 24 अच्छी प्लेट में सुसंस्कृत थे।

  1. संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ 1x धोएं। 3डी मैट्रिक्स में खलल डालने से बचें।
  2. बर्फ पर प्लेट रखो और प्रत्येक अच्छी तरह से बर्फ-कोल्ड सेल रिकवरी समाधान(सामग्री की तालिका) के1 एमएल जोड़ें। एक क्षैतिज शेखर (40 आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30−60 मिनट इनक्यूबेट।
    नोट: 3 डी मैट्रिक्स बूंदों को पूरी तरह से भंग किया जाना चाहिए।
  3. 1% पीबीएस-बीएसए में डुबकी लगाकर बीएसए के साथ 1 एमएल पिपेट टिप कोट करें और 2x ऊपर और नीचे पाइपिंग करें। यह कोटिंग ऑर्गेनॉइड को टिप से चिपकने से रोकेगी। 15 एमएल शंकु नली के भीतरी हिस्से को कोट करने के लिए, 1% पीबीएस-बीएसए के 5 एमएल से भरें, उलटा 2−3x करें और पीबीएस-बीएसए को त्यागें।
    नोट: यह कोटिंग निर्धारण (चरण 3.3) तक सभी प्लास्टिक उपभोग्य सामग्रियों के लिए आवश्यक है।
  4. एक लेपित टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे 5−10x की सामग्री को फिर से खर्च करें और ऑर्गेनॉइड को लेपित 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक ही पहचान वाले विभिन्न कुओं से ऑर्गेनॉइड को एक ही ट्यूब में पूल किया जा सकता है।
  5. सभी ऑर्गेनॉइड को कुल्ला और इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक संस्कृति में बर्फ-ठंड 1% पीबीएस-बीएसए का 1 एमएल जोड़ें।
  6. 10 एमएल में ठंडा पीबीएस जोड़ें और 3डी मैट्रिक्स की एक दृश्य परत के बिना एक तंग गोली प्राप्त करने के लिए 70 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए नीचे स्पिन करें। सुपरनेट को सावधानी से दूर करें।

3. फिक्सेशन और ब्लॉकिंग

  1. सावधानी से एक लेपित 1 मिलील टिप का उपयोग करके बर्फ-ठंडे पीएफए के 1 एमएल में ऑर्गेनॉइड को फिर से खर्च करें।
  2. 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें। धीरे-धीरे सभी ऑर्गेनॉइड के बीच निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए लेपित 1 एमएल टिप का उपयोग करके फिक्सेशन समय के माध्यम से ऑर्गेनॉइड को धीरे-धीरे फिर से खर्च करें।
  3. ट्यूब में बर्फ-ठंडे पीबीटी के 10 एमएल जोड़ें, धीरे-धीरे ट्यूब को उलटा करके मिलाएं, 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 70 x ग्रामपर नीचे स्पिन करें, दोनों 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: इस चरण के बाद से सुझावों की कोटिंग आम तौर पर आवश्यक नहीं है क्योंकि अधिकांश ऑर्गेनॉइड प्रकार निर्धारण के बाद टिप से चिपके नहीं रहते हैं। हालांकि, कुछ ऑर्गेनॉइड को फिक्सेशन के बाद भी कोटेड प्लास्टिक की आवश्यकता हो सकती है।
  4. बर्फ-ठंड ओडब्ल्यूबी (ओडब्ल्यूबी के कम से कम 200 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह) में गोली को फिर से खर्च करके ऑर्गेनॉइड को ब्लॉक करें और ऑर्गेनॉइड को 24 अच्छी तरह से निलंबन प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: एक बड़े गोली से ऑर्गेनॉइड को विभिन्न स्टेनिंग करने के लिए कई कुओं पर विभाजित किया जा सकता है।
  5. कम से कम 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

4. इम्यूनोलबेलिंग

  1. एक खाली कुएं में OWB के 200 μL एक संदर्भ के रूप में अच्छी तरह से सेवा करने के लिए।
    नोट: इम्यूनोलाबेलिंग भी एंटीबॉडी उपयोग को कम करने के लिए ४८ या ९६-कुओं प्लेटों में किया जा सकता है । हालांकि, उपयोगकर्ता को पता होना चाहिए कि छोटी मात्रा के कारण धुंधला और धोने का प्रदर्शन दोनों कम किया जा सकता है।
  2. ऑर्गेनॉइड को प्लेट के नीचे बसने की अनुमति दें।
    नोट: इसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके जांचा जा सकता है और अंधेरे पृष्ठभूमि का उपयोग करके इसे आसान बनाया जाता है।
  3. प्लेट को 45° झुकाएं और ओडब्ल्यूबी के 200 माइक्रोल में ऑर्गेनॉइड छोड़ने वाले ओडब्ल्यूबी को हटा दें (200 माइक्रोल का अनुमान लगाने के लिए संदर्भ का उपयोग करें)।
  4. चित्रा1 में परिणामों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी 2x केंद्रित (उदाहरण के लिए, ई-कैडरिन [1:400] और Ki67 [1:200] के साथ ओडब्ल्यूबी के 200 माइक्रोन जोड़ें, केराटिन 8/18 [1:200], एमआरपी 2 [1:50], और चित्रा 2 में परिणामों के लिए Ki67 [1:200]और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट जबकि हल्का कमाल/मिलाते हुए (क्षैतिज शेखर पर ४० आरपीएम) ।
  5. अगले दिन, ओडब्ल्यूबी के 1 एमएल जोड़ें।
  6. ऑर्गेनॉइड को 3 मिनट के लिए प्लेट के नीचे बसने की अनुमति दें। थाली में 200 μL छोड़ने OWB निकालें। OWB के 1 एमएल जोड़ें और हल्के कमाल के साथ 2 घंटे धोने/
  7. दो बार 4.6 कदम दोहराएं।
  8. ऑर्गेनॉइड को 3 मिनट के लिए प्लेट के नीचे बसने की अनुमति दें। कुएं में 200 μL छोड़ने OWB निकालें।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ OWB के 200 μL जोड़ें, संयुग्मित एंटीबॉडी और रंजक 2x केंद्रित (जैसे, DAPI [1:1000], चूहा-AF488 [1:500], माउस-AF555 [1:500], ॉलोडिन-AF647 [1:100] चित्रा 1में परिणामों के लिए; DAPI [1:1000], चूहा-AF488 [1:500], खरगोश-AF555 [1:500], माउस-AF555 [1:500], फल्लोइडिन-AF647 [1:100] चित्रा 2में परिणामों के लिए; DAPI [1:1000], चित्रा 3 में परिणामों के लिए phalloidin-AF647 [1:100]और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट जबकि हल्का कमाल/
  10. अगले दिन, 4.5−4.7 चरणों को दोहराएं।
  11. ऑर्गेनॉइड को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 3 मिनट के लिए 70 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें।

5. ऑर्गेनॉइड का ऑप्टिकल समाशोधन

  1. ऑर्गेनॉइड को बाधित किए बिना पाइपिंग करके जितना संभव हो ओडब्ल्यूबी निकालें।
  2. अंत कट ऑफ के साथ 200 माइक्रोन टिप का उपयोग करके फ्यूनजीआई (कम से कम 50 माइक्रोन, आरटी) जोड़ें और बुलबुला गठन को रोकने के लिए धीरे-धीरे पुनर्व्यवित करें। 20 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
    नोट: FUnGI द्वारा ऑप्टिकल समाशोधन मामूली ऊतक सिकुड़न का कारण बन सकता है । यह मोनोलेयर्ड और मल्टीलेयरेड ऑर्गेनॉइड की सामान्य आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं करेगा; हालांकि, बड़े ल्यूमेंस के साथ गोलाकार आकार के मोनोलेयर्ड ऑर्गेनॉइड गिर सकते हैं। प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 1 सप्ताह के लिए) या -20 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 6 महीने के लिए) पर संग्रहीत किया जा सकता है।

6. कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयारी

  1. एक सिलिकॉन सीलेंट(सामग्री की तालिका)के साथ एक 10 एमएल सिरिंज तैयार करें। एक 200 μL टिप देते हैं और सिरिंज दबाने के बाद चिपचिपा सिलिकॉन के एक कोमल प्रवाह की अनुमति देने के लिए अंत काट। एक स्लाइड के बीच में 1 सेमी x 2 सेमी का आयत खींचने के लिए सिरिंज का उपयोग करें।
  2. 200 माइक्रोन टिप के अंत को काट दें और फोंगी में ऑर्गेनॉइड को आयत के बीच में स्थानांतरित करें।
  3. शीर्ष पर एक कवरलिप रखें। फंसे हुए हवा के बुलबुले को कम करने के लिए, पहले कवरस्लिप के बाईं ओर रखें, फिर धीरे-धीरे बाएं से दाएं कवरस्लिप को कम करें जब तक कि कोई फंसी हुई हवा न हो और फिर कवरस्लिप जारी न करें।
    नोट: स्पेसर्स जो ऑर्गेनॉइड के आकार में सिमिललर हैं, उन्हें क्षतिग्रस्त होने से रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. धीरे-धीरे कवरस्लिप के सभी किनारों पर दबाव लागू करें ताकि इसे सिलिकॉन सीलेंट से मजबूती से जोड़ा जा सके। अब इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयार है।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और नमूना 4 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 1 सप्ताह के लिए) या -20 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 6 महीने के लिए) पर संग्रहीत किया जा सकता है।

7. छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण

  1. एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप(सामग्री की तालिका) काउपयोग करना, कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एक बहु-विसर्जन 25x या तेल विसर्जन 40x उद्देश्य के साथ स्लाइड छवि।
    1. 25x उद्देश्य के लिए निम्नलिखित अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करें: स्कैन मोड फ्रेम, फ्रेम आकार 1024 x 1024, स्वर आकार 332 एनएम x 332 एनएम x 1.2 माइक्रोन, पिक्सेल निवास समय और लेफ्टिनेंट;2 माइक्रोन, द्विदिशात्मक स्कैनिंग, औसत संख्या 1, बिट गहराई 8. फोटोब्लैचिंग को कम करने के लिए, कमजोर धुंधला के लिए कम लेजर पावर (सामान्य रूप से <5%, और एलटी;10% का उपयोग करें)।
    2. निचली और ऊपरी सीमा को परिभाषित करने के लिए जेड-स्टैक मोड का उपयोग करें और जेड-स्टेप आकार को इष्टतम सेट करें। बड़े ऑर्गेनॉइड संरचनाओं या कई ऑर्गेनॉइड को एक साथ इमेजिंग करते समय, 10% ओवरलैप के साथ टाइलिंग मोड का उपयोग करें और ब्याज के क्षेत्र को इंगित करें।
      नोट: इन सेटिंग्स के साथ, एक विशिष्ट ऑर्गेनॉइड के लिए डेटा आकार और लेफ्टिनेंट; 300 माइक्रोन के व्यास के साथ और लेफ्टिनेंट; 1 जीबी है।
  2. टाइल स्कैन डेटासेट के लिए, माइक्रोस्कोप(सामग्रीकी तालिका) के साथ सॉफ्टवेयर में इमेजिंग फाइलों की सिलाई करें। प्रसंस्करण अनुभाग में, विधि के रूप में सिलाई का चयन करें, मापदंडों के तहत नए आउटपुट का चयन करें और सिलाई के लिए फ़ाइल का चयन करें। सिलाई शुरू करने के लिए लागू करें।
  3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर(सामग्रीकी तालिका) में 3डी व्यू टैब के तहत इमेजिंग का 3डी प्रदान किया गया प्रतिनिधित्व प्राप्त करें और बाद में चमक, विषम और 3 डी प्रतिपादन गुणों को अनुकूलित करें। झगड़ा फ़ाइलों के रूप में परिणामों के आरजीबी स्नैपशॉट निर्यात करें।

Representative Results

3 डी में इमेजिंग ऑर्गेनॉइड वास्तुकला, सेलुलर संरचना के साथ-साथ इंट्रासेलुलर प्रक्रियाओं के दृश्य को बहुत विस्तार से सक्षम बनाता है। प्रस्तुत तकनीक मांग नहीं है और संभवतः ऑर्गेनॉइड प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू की जा सकती है जो विभिन्न अंगों या मेजबान प्रजातियों से प्राप्त होती है।

2डी इमेजिंग की तुलना में 3डी इमेजिंग की ताकत माउस मैमेरी ग्रंथि ऑर्गेनॉइड की छवियों से स्पष्ट है जो हाल ही में प्रकाशित तरीकों का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे14। इन ऑर्गेनॉइड की केंद्रीय परत में स्तंभकार के आकार की K8/K18-सकारात्मक चमकदार कोशिकाएं होती हैं और बाहरी परत में लम्बी K5-postive बेसल कोशिकाएं(चित्रा 2A)होती हैं, जो वीवो में स्तन ग्रंथि की आकृति विज्ञान को पुनः रीकैपिटल करता है । यह ध्रुवीकृत संगठन उसी ऑर्गेनॉइड(चित्रा 2बी,मध्य पैनल) के 2डी ऑप्टिकल सेक्शन से सराहना करना चुनौतीपूर्ण है। एक जटिल संरचना का एक और उदाहरण जो 3 डी जानकारी के बिना व्याख्या करना असंभव है, एमआरपी 2-पॉजिटिव कैनालिकुली का नेटवर्क है जो मानव यकृत ऑर्गेनॉइड11 (चित्रा 2 बी)के पित्त तरल पदार्थ के संग्रह को सुविधाजनक बनाता है। यह उदाहरण देता है कि हमारी विधि ऑर्गेनॉइड की आवश्यक संरचनात्मक विशेषताओं के दृश्य की अनुमति कैसे देती है। इसके अलावा, प्राप्त गुणवत्ता और संकल्प अर्ध-स्वचालित विभाजन और छवि विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, कुल सेल संख्या और मार्कर की उपस्थिति पूरे ऑर्गेनॉइड में विशिष्ट सेलुलर उपप्रकारों में मात्रा निर्धारित की जा सकती है। हम इसे 140 कोशिकाओं वाले पूरे ऑर्गेनॉइड के नाभिक को खंडित करके समझाते हैं, जिनमें से 3 कोशिकाएं Ki67 सेल चक्र मार्कर(चित्रा 2 सी)के लिए उच्च सकारात्मकता प्रदर्शित करती हैं। DAPI चैनल स्रोत चैनल के रूप में चुना जाता है, और खंड एक तीव्रता थ्रेसिंग चरण और 10 माइक्रोन के एक क्षेत्र व्यास के आधार पर उत्पन्न होते हैं। छू वस्तुओं बीज अंक से बढ़ क्षेत्र द्वारा विभाजित कर रहे हैं । अंत में, छोटे शोर प्रेरित खंडों को हटाने के लिए 10 स्वरों का आकार फ़िल्टर लगाया जाता है। नाभिक का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रत्येक खंड के लिए, Ki67 चैनल की औसत तीव्रता को साजिश रचने के लिए निर्यात किया जाता है।

हमने हाल ही में ऑप्टिकल क्लियरिंग एजेंट FUnGI35विकसित किया है, जिसे अब हमने ऑर्गेनॉइड की पारदर्शिता को परिष्कृत करने के लिए इस प्रोटोकॉल में एकीकृत किया है। FUnGI का उपयोग करना आसान है, क्योंकि इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला होने के बाद एक इनक्यूबेशन कदम से समाशोधन आसानी से प्राप्त होता है। एजेंट का एक अतिरिक्त लाभ इसकी चिपचिपाहट है, जो स्लाइड बढ़ते के दौरान नमूना हैंडलिंग के लिए आसान बनाता है। FUnGI में फ्लोरोसेंट नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए संग्रहीत होने पर भी उनकी फ्लोरेसेंस को संरक्षित करते हैं। हम प्रदर्शित करते हैं कि फंडजीआई ने ऑर्गेनॉइड(चित्रा 3ए, बी)में फ्लोरोसेंट सिग्नल गुणवत्ता में अस्पष्ट और फ्रक्टोज-ग्लिसरोल को मात दी है, और कवक-निकासी वाले ऑर्गेनॉइड ने अस्पष्ट ऑर्गेनॉइड(चित्रा 3 सी)की तुलना में कुल मिलाकर फ्लोरेसेंस तीव्रता को बढ़ाया है।

संक्षेप में, हम इम्यूनोलेबेल्ड ऑर्गेनॉइड के वॉल्यूमेट्रिक डेटा प्राप्त करने के लिए एक अडमांग, प्रजनन योग्य 3डी इमेजिंग तकनीक का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग स्वस्थ और रोग मॉडल से माउस और मानव मूल दोनों सहित ऑर्गेनॉइड की एक किस्म को छवि देने के लिए आसानी से किया जा सकता है। सीधे नमूना तैयारी को पूरे ऑर्गेनॉइड के उपकोशिकीय संकल्प के लिए सेलुलर प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल, मल्टी-फोटॉन और लाइट शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की सुविधा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। ऑर्गेनॉइड उनके 3डी मैट्रिक्स से बरामद होते हैं। एंटीबॉडी और रंगों के साथ इम्यूनोलबेलिंग से पहले फिक्सेशन और ब्लॉकिंग किया जाता है। फिंगी क्लियरिंग एजेंट का उपयोग करके ऑप्टिकल समाशोधन एक ही चरण में हासिल किया जाता है। इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों का 3D प्रतिपादन किया जा सकता है। (क)प्रक्रिया का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। (ख)एफ-ऐक्टिन और ई-कैडेरिन (ई-कैड) (25x तेल उद्देश्य) के लिए मानव कोलोनिक ऑर्गेनॉइड इम्यूनोलेबल की पूरी माउंट 3डी कॉन्फोकल छवि को मंजूरी दे दी । स्केल बार = 40 माइक्रोन। (ग)क्लीयर्ड होल-माउंट 3डी कॉन्फोकल इमेज । स्केल बार = 20 माइक्रोन। (घ)एफ-ऐक्टिन, ई-कैडेरिन (ई-कैड) और Ki67 (25x तेल उद्देश्य) के लिए एक मानव कोलोनिक ऑर्गेनॉइड इम्यूनोलेबल के बढ़े हुए ऑप्टिकल सेक्शन । स्केल बार = 5 माइक्रोन। इस आंकड़े को Dekkers एट अल से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग जटिल 3 डी आर्किटेक्चर की कल्पना करता है। पूरे माउंट 3डी डेटासेट (बाएं पैनल), 2D ऑप्टिकल सेक्शन (मिडिल पैनल) और बढ़े हुए क्षेत्र (दाएं पैनल) के 3डी क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने वाली कॉन्फोकल छवियां। (क)माउस मैमेरी ग्रंथि के एक बेसल सेल से प्राप्त एक ऑर्गेनॉइड जो लम्बी स्तन बेसल कोशिकाओं के 3 डी संगठन को दर्शाता है जो ल्यूमिनल कोशिकाओं को घेरता है या K8/18, K5 और F-actin (फ्रक्टोज-ग्लिसरोल समाशोधन; 25x तेल उद्देश्य) के लिए लेबल किया जाता है । स्केल बार 55 माइक्रोन (बाएं पैनल) और 40 माइक्रोन (मध्य और दाएं पैनल) का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ख)एमआरपी 2-पॉजिटिव कैनालिकुली के जटिल 3डी नेटवर्क के साथ एक मानव भ्रूण लिवर ऑर्गेनॉइड, डीएपीआई, एमआरपी 2 और एफ-ऐक्टिन (फ्रक्टोज-ग्लिसरोल क्लियरिंग; 40x तेल उद्देश्य) के लिए लेबल किया गया है । स्केल बार 25 माइक्रोन (बाएं पैनल) और 8 माइक्रोन (मध्य और दाएं पैनल) का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ग)DAPI और Ki67 (बाएं पैनल) के साथ लेबल एक मानव भ्रूण जिगर ऑर्गेनॉइड की कॉन्फोकल 3 डी पूरी माउंट छवि और इमेजिंग सॉफ्टवेयर (मध्य पैनल) का उपयोग करके DAPI चैनल पर एक खंडित छवि । स्केल बार = 15 माइक्रोन। ग्राफ ने पूरे ऑर्गेनॉइड (140 कोशिकाओं) (दाएं पैनल) की सभी कोशिकाओं (DAPI-खंडित) में Ki67 मतलब तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने की साजिश रची। इस आंकड़े को Dekkers एट अल से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: FUnGI के साथ ऑर्गेनॉइड की ऑप्टिकल समाशोधन। (A)एफ-ऐक्टिन (ग्रीन) और डीएपीआई (ग्रे) के साथ लेबल किए गए मानव उपनिवेश ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि छवियां और बिना समाशोधन के इमेज्ड, फ्रक्टोज-ग्लिसरोल के साथ मंजूरी दे दी गई या FUnGI (25x तेल उद्देश्य) के साथ मंजूरी दे दी गई। बाएं पैनल: ऑर्गेनॉइड का 3डी प्रतिपादन। राइट पैनल: 150 माइक्रोन गहराई पर ऑर्गेनॉइड का ऑप्टिकल-सेक्शन। "नो क्लियरिंग" स्थिति के लिए ऑर्गेनॉइड की कल्पना करने के लिए "फ्रक्टोज-ग्लिसरोल" और "फंडजीआई" स्थितियों की तुलना में छवि की चमक को बढ़ाना पड़ा। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (ख)नॉनलाइनियर प्रतिगमन फिट विभिन्न ऑप्टिकल समाशोधन विधियों के लिए जेड-गहराई बढ़ाने के साथ DAPI तीव्रता की कमी दिखा रहा है । मान DAPI विभाजन द्वारा पता लगाया व्यक्तिगत कोशिकाओं की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं और ऑर्गेनॉइड के पहले 50 माइक्रोन की औसत DAPI तीव्रता को सामान्यीकृत कर रहे हैं। गहरे किनारों और नवोदित संरचनाओं पर उज्जवल कोशिकाओं के कारण क्षीणन के कम अनुमान से बचने के लिए, केवल ऑर्गेनॉइड के केंद्र क्षेत्रों का विश्लेषण किया गया था। (ग)समान आकार की स्थिति और कवरस्लिप की ओर गहराई के प्रति तीन ऑर्गेनॉइड समान माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करके छवि थे । तुलना के लिए डीएपीआई सिग्नल पर पूर्ण 3डी डेटासेट एकल सेल खंडित किए गए थे। पूर्ण खंडित डेटासेट पर विभिन्न समाशोधन विधियों के साथ औसत DAPI तीव्रता दिखा बार ग्राफ। डेटा को एसडी ± के लिए दर्शाया गया है। मूल्य DAPI विभाजन द्वारा पाए गए 3800 व्यक्तिगत कोशिकाओं की तीव्रता हैं। = पी एंड एलटी; 0.0001, क्रुस्कल-वालिस परीक्षण दो तरफा डन की कई तुलना पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां, हमने एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ अक्षुण्ण ऑर्गेनॉइड की 3डी इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया। इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक अंजाम देने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाने होंगे। इस खंड में हम इन चरणों को उजागर करते हैं और समस्या निवारण प्रदान करते हैं।

पहला महत्वपूर्ण कदम 3 डी मैट्रिक्स को हटाना है। अधिकांश ऑर्गेनॉइड को विट्रो में मैट्रिस के उपयोग के साथ प्रचारित किया जाता है जो अच्छी तरह से ध्रुवीकृत 3 डी संरचनाओं के गठन को बढ़ाने के लिए वीवो एक्स्ट्रासेलर वातावरण में नकल करते हैं। 3 डी मैट्रिक्स के भीतर फिक्सिंग और बाद में धुंधला संभव है, लेकिन एंटीबॉडी के प्रवेश के लिए हानिकारक हो सकता है या उच्च पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न कर सकते हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)। मैट्रिस को कुशल रूप से हटाने से मैट्रिक्स के प्रकार, ऑर्गेनॉइड की मात्रा और आकार और लंबे समय तक खेती से प्रभावित हो सकता है। इसलिए, विभिन्न संस्कृति स्थितियों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। मैट्रिक्स या बीएमई में सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड के लिए, बर्फ-कोल्ड सेल रिकवरी समाधान में 30−60 मिनट का कदम ऑर्गेनॉइड को नुकसान पहुंचाए बिना मैट्रिक्स को भंग करने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, सहायक 3 डी मैट्रिक्स को हटाने से देशी संरचनाओं की हानि हो सकती है और अन्य सेल प्रकारों के साथ ऑर्गेनॉइड संपर्कों में व्यवधान हो सकता है, उदाहरण के लिए जब ऑर्गेनॉइड फाइब्रोब्लास्ट या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी होते हैं। इसके अलावा, इष्टतम ऑर्गेनॉइड निर्धारण 3 डी ऊतक वास्तुकला, प्रोटीन एंटीजेनिकिटी और ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने में महत्वपूर्ण है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए के साथ 45 मिनट के लिए फिक्सिंग आमतौर पर ऑर्गेनॉइड और एंटीजन की एक विस्तृत श्रृंखला की लेबलिंग के लिए पर्याप्त है। हालांकि, 4 घंटे तक एक लंबा निर्धारण कदम, आमतौर पर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करने वाले ऑर्गेनॉइड के लिए अधिक उपयुक्त होता है, लेकिन विभिन्न फ्लोरोफोरस के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। 20 मिनट से कम निर्धारण का समय फॉलोइडिन जांच का उपयोग करके एफ-ऐक्टिन को ठीक से लेबल करने के लिए अपर्याप्त है। एक अन्य आम मुद्दा प्रोटोकॉल के दौरान ऑर्गेनॉइड का नुकसान है। इसलिए यह (i) ध्यान से कोट पिपेट युक्तियों और 1% बीएसए-पीबीएस के साथ ट्यूबों के रूप में वर्णित है जब उन्हें प्लास्टिक से चिपके हुए से रोकने के लिए अनिर्धारित ऑर्गेनॉइड से निपटने के लिए, (ii) कम पालन या निलंबन प्लेटों का उपयोग करने के लिए प्लेट से चिपके हुए से नमूना टालना, और (iii) ऑर्गेनॉइड के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के लिए ध्यान से बफर को हटाने से पहले थाली के नीचे व्यवस्थित करने के लिए । पाइपिंग चिपचिपा FUnGI बुलबुले पेश कर सकते हैं। आरटी में स्वीकृत नमूने को संभालने से चिपचिपाहट कम हो जाती है और आसानी से उपयोग में सुधार होता है, जिससे ऑर्गेनॉइड की हानि कम हो जाती है। जबकि अधिकांश ऑर्गेनॉइड को संभालना आसान होता है, बढ़े हुए ल्यूमेन वाले सिस्टिक ऑर्गेनॉइड में 4% पीएफए के साथ फिक्सिंग या फाउंगी के साथ मंजूरी मिलने पर पतन की उच्च प्रवृत्ति होती है। इस प्रभाव को कम किया जा सकता है, लेकिन पूरी तरह से रोका नहीं जा सकता है, एक अलग फिक्सेटिव (जैसे, फॉर्मेलिन या पीएफए-ग्लूटालाल्डिहाइड) का उपयोग करके। हालांकि, यह संभावित रूप से ऑटोफ्लोरेसेंस, एंटीबॉडी प्रवेश और एपिटोप उपलब्धता को प्रभावित कर सकता है। जब सिस्टिक ऑर्गेनॉइड समाशोधन के बाद मुड़ा हुआ दिखाई देते हैं, तो बहु-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा समाशोधन चरण और छवि को छोड़ने की सलाह दी जाती है, जो प्रकाश बिखरने से कम बाधित होती है। अंत में, ऑर्गेनॉइड की पूरी 3डी संरचना प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है और कवरस्लिप और ऑर्गेनॉइड के बीच न्यूनतम दूरी की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, जब ऑर्गेनॉइड के पास अपने बढ़ते एजेंट में स्थानांतरित करने के लिए जगह होती है, तो इसके परिणामस्वरूप जेड-डेप्थ में डेटा रिकॉर्ड करते समय एक्स-और वाई-शिफ्ट हो सकते हैं। स्लाइड तैयारी के दौरान कम सिलिकॉन सीलेंट का उपयोग करके कवरस्लिप और माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच उप-सूक्ष्म बढ़ते को हल कर सकते हैं। हालांकि, बहुत कम सिलिकॉन ऑर्गेनॉइड संपीड़न और उनकी अंतर्निहित 3 डी संरचना के नुकसान का कारण बन सकता है। FUnGI अपनी उच्च चिपचिपाहट के कारण इमेजिंग करते समय स्लाइड माउंटिंग और ऑर्गेनॉइड की स्थिरता के लिए हैंडलिंग में सुधार करता है।

हालांकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग गहराई से सेलुलर सामग्री और अक्षुण्ण ऑर्गेनॉइड के 3डी आर्किटेक्चर में अध्ययन करने के लिए अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है, कुछ सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। यह कार्यप्रणाली कम-थ्रूपुट और समय लेने वाली है। दरअसल, उपयोगकर्ताओं को यह ध्यान में रखना चाहिए कि 3 डी में बड़े अक्षुण्ण ऑर्गेनॉइड इमेजिंग के लिए जेड में टाइलिंग और नमूना अधिग्रहण दोनों की आवश्यकता होती है, जिससे लंबे समय तक अधिग्रहण का समय मिलता है। तेजी से इमेजिंग को माइक्रोस्कोप परिसंपत्तियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें गूंजता या कताई डिस्क स्कैनर, या लाइट शीट माइक्रोस्कोप तकनीक26द्वारा शामिल है। एक अन्य विचार यह है कि मार्कर को एक ही नमूने से विभिन्न ऑर्गेनॉइड के बीच विषम रूप से व्यक्त किया जा सकता है। इसलिए, संस्कृति में इस ऑर्गेनॉइड विषमता को बेहतर तरह से पकड़ने के लिए कई ऑर्गेनॉइड का अधिग्रहण किया जाना चाहिए। अंत में, जबकि पूर्ण गीली प्रयोगशाला प्रक्रिया सीधी है, डेटा के बाद डेटा के बाद 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और क्वांटिफिकेशन के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में कौशल की आवश्यकता होती है, साथ ही डेटासेट में मौजूद सभी जानकारी को खनन करने के लिए आंकड़े भी आवश्यक हैं।

पिछले दशक में, ऑप्टिकल समाशोधन एजेंटों की एक विस्तृत श्रृंखला के विकास और माइक्रोस्कोपी और कंप्यूटेशनल,प्रौद्योगिकियों में सुधार27,30,31के कारण वॉल्यूम इमेजिंग का क्षेत्र बहुत उन्नत हो गया है।, जबकि अतीत में अधिकांश अध्ययनों में अंगों या संबंधित ट्यूमर की बड़ी मात्रा इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित किया गया था, हाल ही में ऑर्गेनॉइड संरचनाओं सहित छोटे और अधिक नाजुक ऊतकों के लिए तरीके विकसित किए गए हैं,36,,37,,38। हमने हाल ही में बाद के 3 डी प्रतिपादन और छवि विश्लेषण26के लिए एकल सेल स्तर पर विभिन्न मूल, आकार और आकार के पूरे-माउंट ऑर्गेनॉइड इमेजिंग के लिए एक सरल और तेज विधि प्रकाशित की है, जिसे हमने यहां कुछ सुधारों (जैसे, FUnGI, सिलिकॉन बढ़ते) के साथ प्रस्तुत किया और एक वीडियो प्रोटोकॉल के साथ। यह विधि जटिल सेल आकृति विज्ञान और ऊतक वास्तुकला (चित्रा 2) को समझने में पारंपरिक2डीअनुभाग-आधारित इमेजिंग से बेहतर है और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्रयोगशालाओं में लागू करना आसान है। प्रोटोकॉल के मामूली अनुकूलन के साथ, नमूनों को, सुपर-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल, मल्टी-फोटॉन के साथ-साथ लाइट शीट इमेजिंग के साथ संगत बनाया जा सकता है, जो इस प्रोटोकॉल को व्यापक रूप से लागू करता है और उपयोगकर्ताओं को बहुआयामी जटिलता को बेहतर मानते हुए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है जिसे ऑर्गेनॉइड के साथ मॉडलिंग किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम बाल चिकित्सा ऑन्कोलॉजी के लिए राजकुमारी Máxima केंद्र से तकनीकी सहायता के लिए बहुत आभारी है और इमेजिंग समर्थन और सहयोग के लिए Hubrecht संस्थान और Zeiss के लिए । सभी इमेजिंग राजकुमारी Máxima इमेजिंग केंद्र में किया गया था। यह काम बाल चिकित्सा ऑन्कोलॉजी के लिए राजकुमारी मक्सीमा सेंटर द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित था। जेएफडी को मैरी क्यूरी ग्लोबल फेलोशिप और नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एनडब्ल्यूओ) से वेनी ग्रांट का समर्थन मिला था । एसीआर को एक यूरोपीय परिषद (ईआरसी) द्वारा अनुदान शुरू करने का समर्थन मिला था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml safe-lock centrifuge tubes Eppendorf EP0030 120.094
2 ml safe-lock centrifuge tubes Eppendorf EP0030 120.094
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A3059
Cell recovery solution Corning 354253
Confocal microscope Zeiss LSM880
Confocal microscope software ZEN Zeiss ZEN black/blue
Conical tubes 15 ml Greiner Bio-One 5618-8271
Coverglass #1.5 24x60mm Menzel-Glazer G418-15
Coverglass #1.5 48x60mm ProSciTech G425-4860
DAPI ThermoFisher D3571 dilution 1:1000
Dissection Stereomicroscope Leica M205 FA
Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m Scotch 3M
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) Gibco 14190144 1x
EDTA Invitrogen 15576-028
Focus Clear CelExplorer FC-101
Fructose Sigma Aldrich F0127
Glycerol Boom 76050771.0500
Graduated Transfer Pipets Samco 222-15
Horizontal shaker VWR 444-2900
Hydrochloric acid (HCl) Ajax Firechem. 265.2.5L-PL 10M stock solution, corrosive
Imaris software Bitplane
Microscope slides Superfrost ThermoFisher 10143352 ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148-500g Hazardous
Phalloidin Alexa Fluor 647 ThermoFisher A22287 dilution 1:100-200
E-cadherin ThermoFisher 13-1900 dilution 1:400
Ki-67 BD Biosciences B56 dilution 1:200
Keratin 5 BioLegend 905501 dilution 1:500
Keratin 8/18 DSHB (University of Iowa) dilution 1:200
MRP2 Abcam ab3373 dilution 1:50
Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 ThermoFisher A-21208 dilution 1:500
Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 ThermoFisher A-31570 dilution 1:500
Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 ThermoFisher A-31572 dilution 1:500
Silicone Sealant Griffon S-200
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher 28312
Sodium Hydroxide (NaOH) pellets Merck Millipore 567530 10 M stock solution, corrosive
Suspension cell culture plates Greiner Bio-One 662102 24-well
Tris Fisher Scientific 11486631
Triton X-100 Sigma Aldrich T8532 Hazardous
Tween-20 Sigma Aldrich P1379
UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose ThermoFisher 16520050
Urea Sigma Aldrich 51456
Workstation Dell

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References

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जीव विज्ञान अंक 160 ऑर्गेनॉइड सिंगल सेल रिज़ॉल्यूशन 3डी इमेजिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इम्यूनोलेबलिंग ऑप्टिकल क्लियरिंग
बरकरार ऑर्गेनॉइड के सिंगल-सेल रिज़ॉल्यूशन थ्री-डायमेंशनल इमेजिंग
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van Ineveld, R. L., Ariese, H. C.… More

van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids. J. Vis. Exp. (160), e60709, doi:10.3791/60709 (2020).

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