Fluorescerande kalciumavbildning och efterföljande in situ hybridisering för neuronal prekursor karakterisering i Xenopus laevis

Summary

Vi presenterar ett tvådelat protokoll som kombinerar fluorescerande kalciumavbildning med in situ hybridisering, vilket gör att experimentören att korrelera mönster av kalciumaktivitet med genuttryckprofiler på en cellnivå.

Abstract

Spontan intracellulär kalciumaktivitet kan observeras i en mängd olika celltyper och föreslås spela kritiska roller i en mängd olika fysiologiska processer. I synnerhet är lämplig reglering av kalciumaktivitetsmönster under embryogenes nödvändigt för många aspekter av ryggradsdjurs neural utveckling, inklusive korrekt neural rörstängning, synaptogenes och signalsubstansfenotypspecifikation. Även om observationen att kalciumaktivitetsmönster kan skilja sig åt i både frekvens och amplitud tyder på en övertygande mekanism genom vilken dessa flöden kan överföra kodade signaler till nedströms effektorer och reglera genuttryck, befintliga metoder på befolkningsnivå har saknat den precision som krävs för att ytterligare undersöka denna möjlighet. Dessutom begränsar dessa metoder studier av cellcellsinteraktionernas roll genom att utesluta förmågan att analysera tillståndet för neuronal bestämning i avsaknad av cellcellkontakt. Därför har vi etablerat ett experimentellt arbetsflöde som partime-lapse kalcium avbildning av dissocierade neuronal explants med en fluorescens in situ hybridisering analys, vilket möjliggör entydig korrelation av kalcium aktivitet mönster med molekylär fenotyp på en cellnivå. Vi kunde framgångsrikt använda detta tillvägagångssätt för att skilja och karakterisera specifika kalciumaktivitetsmönster i samband med att skilja neurala celler och neurala stamceller, respektive; Utöver detta skulle dock den experimentella ram som beskrivs i denna artikel lätt kunna anpassas för att undersöka korrelationer mellan alla aktivitetsprofiler i tidsserier och uttryck för en gen eller gener av intresse.

Introduction

Gratis cytosolic kalcium är avgörande för en mängd olika biologiska processer, allt från cellproliferation och migration till apoptos och autofagi^1,2,3. Inom dessa vägar kan kalcium utöva nedströmseffekter på genuttryck genom att interagera med kalciumbindande domäner för att inducera konformationella förändringar som modulerar proteinaktivitet och interaktioner. Till exempel, en neuronal kalciumsensor som kallas Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) hålls i en ovikt mellanliggande konformation när den är bunden av kalcium, hindrar den från att interagera med sitt protein och DNA mål⁴. Utöver att fungera som en enkel signalering molekyl, men den dynamiska karaktären av intracellulära kalciumtransienter tillåter dessa aktivitetsmönster att koda mer komplexa amplitud- eller frekvensbaserade signaler^5,6. Nukleär flyttning av transkriptionsfaktorn kärnfaktor av aktiverade T-celler (NFAT) förstärks av högfrekventa kalciumsvängningar men hämmas av lågfrekventa svängningar⁷. Övertygande, senaste arbetet har föreslagit att NFAT faktiskt kan vara lyhörd för kumulativ kalciumexponering⁸. Både calcineurin och Ca^{2 +}/ calmodulin-beroende protein kinas II (CaMKII) uppvisar också tydliga svar på kalcium transienter av en viss frekvens, varaktighet, eller amplitud⁹. För att lägga till en ytterligare nivå av reglerande komplexitet, beräkningsmodeller tyder på att många nedströms kalcium-bindande proteiner blir mer eller mindre frekvensberoende som svar på förekomsten eller frånvaron av bindande konkurrenter^10,11.

Inom det utvecklande nervsystemet har två huvudklasser av kalciumaktivitetsbeteenden definierats och associerats med specifika biologiska processer. Kalcium tillströmningar klassificeras som "spikar" om de förekommer inom enskilda celler, nå en toppintensitet på ~ 400% av baslinjen inom fem sekunder, och uppvisar dubbla exponentiellt förfall¹². Denna typ av signal är främst associerad med signalsubstansen fenotyp specifikation¹³. Däremot definieras "vågor" som långsammare, mindre extrema kalciumtransienter där en cells intracellulära kalciumkoncentration stiger till ~200% av baslinjen under en period av trettio sekunder eller mer, sedan sönderfaller under flera minuter¹². Dessa signaler sprider sig ofta över flera angränsande celler, och deras närvaro har associerats med neurite utväxt och cellspridning^14,15. Även om dessa två klasser har definierats baserat på karakteristiska kinetiska profiler, är det fortfarande oklart exakt vilka egenskaper hos dessa mönster faktiskt upptäcks av celler och översätts av nedströms effektorer.

Att förstå förhållandet mellan intracellulära kalciumsvängningar och genuttryck skulle ge avgörande inblick i en av de regleringsmekanismer som säkerställer lämplig utveckling och mönster av nervsystemet. För detta ändamål, studier av embryonala ryggmärgen har visat att ökad kalciumspike aktivitet under utvecklingen är associerad med högre nivåer av hämmande nervceller, medan minskad kalciumspike aktivitet är associerad med högre nivåer av excitatoriska nervceller¹³. Emellertid, dessa befolkningsnivå analyser har inte använts för att associera kalciumaktivitet med genuttryck på en cellnivå.

Att närma sig dessa frågor på nivån för den enskilda cellen erbjuder flera olika fördelar jämfört med tidigare arbete. För en, förmågan att bedöma kalciumaktivitet och genuttryck i många celler individuellt gör att hela repertoaren av distinkta aktivitetsmönster som skall observeras utan att fördunkas av en bulk-nivå mätning. Dessutom innebär studier av dessa relationer i primärkulturen i en cell att cellautonoma kopplingar mellan kalciumaktivitet och genuttryck kommer att upprätthållas, medan interaktioner som kräver cellcellkommunikation kommer att upphävas. Därför gör detta tillvägagångssätt dessa cellautonoma mekanismer som kan studeras isolerat. Emellertid, Det gör också att rollen av icke-cell-autonoma kalciumaktivitet som skall klargöras och förhöras. Till exempel kan celler dissekeras från ett embryo i neurala plattan skede, odlade tills syskon kontroller når neuralrörsstadiet, och sedan jämfört med celler som nyligen har dissekerats från en neural-tube-steg embryo. Detta möjliggör direkt jämförelse av celler som behöll cellcellkommunikation under en viktig utvecklingsperiod till dem där cellcellkommunikation avskaffades.

I syfte att ta itu med begränsningarna i tidigare experimentella metoder, utvecklade vi ett protokoll som skulle möjliggöra bedömning av både kalciumaktivitet och genuttryck i enskilda neurala stamceller, underlätta sambandet mellan specifika aktivitetsmönster med efterföljande differentiering sprogram. Neural vävnad dissekerades från Xenopus laevis i olika stadier av neural utveckling, separeras i enstaka celler, och avbildades via konfokal mikroskopi i närvaro av en fluorescerande kalciumindikator. Efter levande cell avbildning, prover fastställdes och analyseras via fluorescens in situ hybridisering (FISH) för att upptäcka uttryck för en gen eller isoform av intresse. Viktigt, enskilda celler kan spåras över båda bildframställning experiment, vilket innebär att en cells kalcium aktivitet profil och dess genuttryck nivå kan associeras med varandra(figur 1). Protokollet rapporteras här är avsett att sond relationer mellan kalcium aktivitetsmönster och genuttryck över embryonal neuroutveckling i Xenopus laevis. Den bredare experimentella ramen (encellig tidskurssombehandling följt av FISH och bildkoregistrering) kan dock ändras och tillämpas på praktiskt taget alla celltyper, fluorescerande reporter och gen av intresse.

Protocol

Allt arbete med djur utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av institutional animal care and use committee (IACUC) vid College of William and Mary.

1. Djurvård och embryohantering

1. Inducera naturlig parning genom att administrera en subkutan injektion av humant korioniskt gonadotropin (HCG) i den dorsala lymfsäcken hos vuxna Xenopus laevis vid en dos av 600 U för kvinnor och 400 U för män.
2. Efter injektion, placera minst en hane och en kvinnlig groda i en rumstemperatur hålla tank över natten. Äggläggning börjar vanligtvis 9-12 h efter HCG administration.
3. Samla embryon. Degege genom att försiktigt tvätta med 2% cystein (pH 8,0) för 2-4 min.
4. Skölj embryona 3x i 0,1 x Marks modifierade ringsignallösning (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH justerat till 7,4–7,6).
5. Överför embryona till 100 mm glas Petri-rätter som innehåller 0,1 x MMR och 50 μg/mL gentamycin. En densitet av 50-100 embryon per tallrik är lämplig.
6. Inkubera rätterna vid 14 °C–22°C och låt embryona utvecklas tills de når önskat utvecklingsstadium. Ta regelbundet bort obefruktade celler och nekrotiska eller onormalt utveckla embryon med en plast överföring pipett.
   OBS: För att säkerställa konsekvens utförs utvecklingsföriscensättning enligt morfologiska kriterier som definieras av Nieuwkoop och Faber¹⁶. Stadier av intresse kommer att variera beroende på experimentellfokus. Till exempel är viktiga neurodevelopmental landmärken förknippade med steg 14 (uppkomsten av neurulation), steg 18 (uppkomsten av neuralrörstängning), och steg 22 (uppkomsten av tailbud förlängning).

2. Embryodissekering och provberedning

1. Lösningsberedning
   1. Förbered 2 mM Ca²⁺ lösning som innehåller 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl₂·2H₂O, 1,31 mM MgSO₄och 4,6 mM Tris. För varje 100 ml-lösning, tillsätt 1 ml penicillin/streptomycin (10 000 U/mL penicillin; 10 000 μg/ml streptomycin). Justera pH till 7,8 och filtrera steriliseras.
   2. Förbered kalcium- och magnesiumfri (CMF) lösning genom att kombinera 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris och 0,4 mM EDTA. Justera pH till 7,8 och autoklav för att sterilisera. För varje 100 ml-lösning, tillsätt 1 ml penicillin/streptomycin (10 000 U/mL penicillin; 10 000 μg/ml streptomycin). Justera pH till 7,8 och filtrera steriliseras.
2. Beredning av plattor för dissekering och bildbehandling
   1. UV-sterilisera två 35 mm plast Petri rätter och en 35 mm Cell Culture Dish (se Materialbord).
   2. När du arbetar i en laminarflödeshuva, förbered två 50 ml plastkoniska rör som innehåller 10 ml 2 mM Ca²⁺ lösning vardera.
   3. Fortsätta att arbeta i laminarflödeshuven och tillsätt 2 ml 2 mL ca²⁺ lösning till en 35 mm plast Petri skålen, 2 mL av 2 mM Ca^{2 +} lösning på en 35 mm Cell Culture Dish, och 2 ml CMF lösning till en 35 mm plast Petri skålen.
   4. Utanför laminarflödeshuven fyller du två 100 mm plastpetriskålar och en 35 mm plastpetriskål med 0,1 x MMR med gentamycin (50 μg/ml). Fyll en 60 mm plast Petri maträtt med 70% etanol.
   5. Omedelbart före dissekering, tillsätt 0,01 g Collagenase B till ett av de 50 ml-rör en innehållande Ca^2+-lösning. Blanda väl och överför lösningen till en färsk 60 mm plast Petri skålen.
3. Med hjälp av ett dissekerande mikroskop, identifiera embryon från önskat utvecklingsstadium. Använd en steril överföringspipett för att överföra minst sex lämpliga embryon till en av de 100 mm plattor som innehåller 0,1 x MMR + gentamycin beredd i steg 2.2.4. Detta kommer att fungera som hålla plattan.
4. Använd en steril överföringspipett för att överföra ett embryo till den andra 100 mm plattan som innehåller 0,1 x MMR + gentamycin. Detta kommer att fungera som dissekering sett plattan.
   1. Om dissekera embryon som är tillräckligt gamla för att flytta (ungefär steg 23 eller äldre), anösen varje embryo före dissekering genom att överföra det till en maträtt som innehåller 0,1% 3-aminobensosyra etylester utspädd i 0,1 x MMR med gentamycin (50 μg/mL). När embryot är immobiliserat, överför det tillbaka till skålen som innehåller 0,1 x MMR med gentamycin (50 μg/ml) och fortsätt med dissekering.
5. Ta försiktigt bort vitellinmembranet som omger embryot. Detta kan lättast göras genom att använda ett par trubbiga pincett för att stabilisera embryot samtidigt som man använder ett par fina pincett för att förstå membranet. Dra försiktigt med de fina krafterna för att skala vitellinmembranet isär.
6. Använd fina pincett för att separera embryots dorsala och ventrala regioner. Detta kan göras genom att använda pincetten för att "nypa" embryot längs den främre bakre axeln, skära den på mitten. Med en steril överföringspipett överför du dorsala delen till 60 mm-plattan med kollagenlösning som är förberedd i steg 2.2.5. Kasta ventraldelen.
7. Låt dorsala explant att inkubera i kollagenlösning för 1-2 min i rumstemperatur. Överför den försiktigt till dissekeringsplattan.
8. Slutföra dissekering genom att noggrant ta bort alla kvarvarande endodermal och mesodermal kontaminering från presumtiva neuralvävnad av ektodermen. För embryon i steg 22 eller äldre bör neuralröret också tas bort och kasseras.
   OBS: Om det behövs under dissekering, skålen med 70% etanol beredd i steg 2.2.4 kan användas för att rensa eller sterilisera pincett.
9. När dissekeringen är klar överför du försiktigt explantan till 35 mm-plattan ca^2+-lösning som är förberedd i steg 2.2.3.
10. Upprepa steg 2.4-2.9 tills fyra utväxter har samlats in.
11. Använd en P1000 micropipette för att överföra alla fyra utväxter till 35 mm plattan som innehåller CMF-lösning, var noga med att undvika kontakt mellan utväxter och luftvattengränssnittet. Snurra försiktigt skålen så att alla explants klustret i mitten av plattan.
12. Inkubera 1 h vid rumstemperatur för att explantor ska kunna separeras.
    OBS: För att underlätta i dissociation, 0,025%-0,01% trypsin kan läggas till CMF-lösningen. Detta kan vara nödvändigt för effektiv spridning av äldre embryon (steg 22 och äldre).
13. Vid denna punkt bör minst två lämpligt iscensatta embryon finnas kvar på hållplattan. Överför dessa embryon till en färsk maträtt fylld med 0,1 x MMR med gentamycin beredd i steg 2.2.4 och låt dem utvecklas ostört med skålen täckt för att matcha explantskålen. Dessa embryon kommer att fungera som syskonkontroller.
14. Använd superlim för att fästa ett mikrostyrt täckslip (se Materialtabell)till botten av 35 mm Cell Culture Dish förberedd i steg 2.2.3.
    OBS: Placera små sandskäddor av superlim runt kanterna på täckslip, tryck sedan fast den mot undersidan av Cell Culture Dish. Positionsmarkeringarna skyms var som helst limmet kontaktar nätet, så det är viktigt att hålla den centrala nätdelen av täckslipen fri från lim.
15. Efter utväxter har separerat för 1 h, använd en P100 micropipette att överföra dem till Cell Culture Dish. För att plattan så många celler som möjligt på den ingående delen av skålen, håll pipetten i en grunt vinkel nära skålens yta, placera pipettspetsen i hörnet av nätet vänd inåt och utdriva cellsuspensionen över den inrutade ar ea. Helst kommer celler att bosätta sig i ett tätt tätt kluster.
16. Inkubera för 1 h vid rumstemperatur så att cellerna kan fastna på plattan. Bestäm och registrera utvecklingsstadiet för syskonkontrollembryonnär denna inkubationstid börjar.
17. Kombinera 5 μL 1 mM Fluo-4 AM (se Materialtabell)med 2 μL 10% pluronisk F-127 syra.
    OBS: Fluo-4 AM är ljuskänslig och bör hållas i ett ljussäkert eller folietäckt rör hela tiden.
18. När inkubationstiden är klar flyttar du provskålen till ett mörkrum eller annan ljusskyddad plats. Använd en micropipette för att ta bort 100 μl lösning från skålens kant. Tillsätt denna lösning till aliquot av Fluo-4 AM/Pluronic F-127 syra, pipett upp och ner för att blanda, och returnera hela volymen till provskålen. Snurra försiktigt för att blanda.
19. Täck plattan med aluminiumfolie och låt inkubera för 1 h vid rumstemperatur. Bestäm och registrera utvecklingsstadiet för syskonkontrollembryonnär denna inkubationstid börjar.
20. I slutet av inkubationen, använd det återstående koniska röret på 2 mM Ca²⁺ för att utföra tre medietvättar på följande sätt: 1 ml lösning från skålen, tillsätt 3 ml färsk lösning, 2) ta bort 3 ml lösning från skålen, tillsätt 3 ml färsk lösning, 3 ml färsk lösning, 3 ml lösning, 3 ml lösning från skålen, tillsätt 3 ml färsk lösning.

3. Kalciumavbildning

OBS: Kalciumavbildning utfördes med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop(Materialstable).

1. Placera provplattan på mikroskopstadiet och var noga med att skydda den från omgivande ljusexponering. När plattan är säkrad, använd en markör för att märka framsidan av plattan så att samma synfält kan hittas i efterföljande bildbehandling.
2. Leta reda på provet under mikroskopet – först vid 10X och sedan vid 20X förstoring – och välj ett lämpligt synfält för bildbehandling. Ett idealiskt synfält är celltät, men inte så tät att cellerna klumpas ihop eller är svåra att skilja individuellt.
3. Justera mikroskopfokus så att det rutnätsstyrda täckslipen är synlig. Siffrorna som markerats på omslagsslipen fungerar som unika identifierare för vissa rutnätslok och kan användas för att hitta samma synfält för ytterligare bildbehandling. Om det ursprungligen valda synfältet inte överlappar några tal, justera tills ett identifierbart nummer är i bildruta.
4. Ta en bild av det markerade fältet med det rutnätsstyrda följesågfältet i fokus.
5. Justera fokusinställningarna och ta en ljusfältsbild av det valda vyfältet med cellerna i fokus.
6. Med celllagret i fokus, belysa proverna med en 488 nm laser. HV- och Offset-värden kan optimeras för varje experiment för att säkerställa att ett dynamiskt spektrum av fluorescens detekteras på FITC-kanalen.
7. Om du vill ha en två timmars bild ändrar du bildåtergivningen för att registrera 901 bildrutor med en skanningstid på 3,93 s och ett intervall på 8 s. Kör konfiguration för att hämta bild.
8. När avbildningen är klar tar du bort plattan från mikroskopstadiet. Ta bort 1 ml lösning från plattan och byt ut den med 1 ml 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA och 2 mM MgSO₄ i 7,4% formaldehyd).
9. Inkubera plattan för 2 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C. Bestäm och registrera utvecklingsstadiet för syskonkontrollembryonnär denna inkubationstid börjar.
10. När fixeringen är klar, ta bort all lösning från plattan och byt ut den med 2 ml 1 x PBS. Förvara plattorvid 4 °C för vidare bearbetning.

4. Genuttrycksanalys: Probe Syntes

1. Som beskrivs nedan, generera en antisense RNA sond för in situ hybridisering. Dessutom, generera en känsla sond för samma gen för användning som en negativ kontroll.
2. För att rena plasmid DNA som innehåller sonden mallsekvens, inokulera 150 ml LB buljong med bakteriella glycerol lager som innehåller mallplasmid. Inkubera vid 37 °C med skakningar över natten eller tills kulturen är grumlig.
3. Rena plasmid DNA från bakteriekulturen med din metod val.
   OBS: Vi använder McNary-Nagel midi-prep kit för att få hög avkastning av plasmid DNA.
4. För att bekräfta att plasmiden innehåller det förväntade skäret utför du en begränsningssmälta och analyserar produkterna på en agarose gel. Uncut plasmid kan också analyseras på en agarose gel för att kontrollera om det är genomisk DNA-kontaminering.
5. För att linjärisera mallen DNA, ställa in en 100 μL begränsning smälta reaktion som innehåller 20 μg plasmid DNA, 2 μL av lämplig begränsning enzym, och 1x lämplig buffert. Inkubera vid 37 °C i minst 2 timmar.
6. Extrahera linjärt DNA genom att utföra en fenol/kloroform extraktion följt av en kloroformextraktion.
7. Fäll ut DNA med 100% etanol. Detta kan göras snabbt genom att lägga till två volymer kall etanol till provet och inkubera det vid -80 °C tills det stelnar (15-30 min).
8. Använd en kyld centrifug till pellet DNA genom att snurra i 20 min vid 12 000 x g/4 °C.
9. Ta bort supernatanten och tvätta pelleten med 200 μL 70% etanol. Snurra i 5 min vid 12 000 x g/4 °C.
10. Ta bort den supernatant och lufttorra pelleten i ca 5 min. Resuspend i 20 μL 1x TE och förvara vid 4 °C tills den används ytterligare.
11. För att syntetisera och rena antisense RNA-sond, skapa en 2,5 mM rNTP mix genom att kombinera 15 μL av 10 mM rCTP, 15 μL av 10 mM rGTP, 15 μL av 10 mM rATP, 9,75 μL av 10 mM rUTP, och 5,25 μL av 10 mM dig-11 UTP (Se Materialbord).
12. Ställ in en 50 μl in vitro-transkriptionsreaktion som innehåller 4 μg linjärt mall-DNA från steg 4.2-4.10. 15 μL av 2,5 mM rNTP mix från steg 4.11, 10 μl 5x transkriptionsbuffert, 5 μL 0,1 M DTT, 0,5 μL RNAse-hämmare (20 U/μL) och 1,5 μl lämplig RNA-polymeras (T3, T7 eller SP6). Inkubera 1 h vid 37 °C.
13. Tillsätt ytterligare 1,5 μl RNA-polymeras till reaktionen och återgå till 37 °C i ytterligare en timme.
14. Tillsätt 1 μL RQ1 DNAse till reaktion och inkubera vid 37 °C i 10 min för att försämra DNA-mallen.
15. Tillsätt 30 μl av 7,5 M LiCl-lösning för att prova. Pipette att blanda och inkubera vid -20 °C för minst 1 h.
16. Med hjälp av en kyld centrifug, snurra provet 25 min vid 14 000 x g/4 °C.
17. Ta bort supernatanten och skölj pelleten med 500 μL 70% etanol. Snurra i 5 min vid 14 000 x g/4 °C.
18. Ta bort den supernatant och lufttorra pelleten i ca 5 min. Resuspend i 20 μL nuclease-fritt vatten.
19. Skapa vid 10x sondlager genom att spädprovet till en koncentration på 10 ng/μL i hybridiseringsbuffert (50 % formamid, 5x SSC (saltlösning, 750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat, pH 7,0), 1 mg/mL torula RNA, 0,1 % Tween-20, 1x Denhardts lösning, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA och 100 μg/mL heparin). Förvaras vid -20 °C tills vidare.

5. Genuttrycksanalys: Fluorescens i Situ Hybridisering

OBS: Alla tvättar bör utföras med cirka 1 ml lösning med hjälp av en steril, individuellt insvept överföringspipett. Pipetten ska placeras vid plattans kant när du tar bort eller tillför lösning, och tvättar bör utföras så försiktigt som möjligt för att säkerställa att cellerna inte lossnar från plattans yta och försvinner.

1. Ta bort 1x PBS från plattan (från steg 3.10). Byt ut mot färsk 1x PBS och inkubera 5 min vid rumstemperatur.
2. Kombinera 25 ml 0,1 M trietanolamin (pH 8,0) med 62,5 μl ättiksyraanhydrid. Blanda väl. Tvätta plattan med denna lösning i 10 min.
3. Tvätta plattan med 1x SSC i 5 min.
4. Tvätta plattan med 0,02 M HCl i 10 min för att permeabilisera celler.
5. Tvätta 2x med 1x PBS i 5 min vardera.
6. Ta bort lösningen och lägg till 1 ml hybridiseringsbuffert (50 % formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat, pH 7,0), 1 mg/mL torula RNA, 0,1% Tween-20, 1x Denhardts lösning, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA och 100 μg/mL heparin) på plattan. Inkubera med skakning i minst 6 h vid 60 °C.
7. Ta bort hybridiseringsbufferten och byt ut med 750 μL 1x RNA Probe-lösning (utspädd form av 10x-lagret som gjorts i steg 4.19. Sense RNA-sonder kan användas som en negativ kontroll.
8. Inkubera med skakning för 8-14 h vid 60 °C.
9. Ta bort sonden och förvara vid -20 °C.
   OBS: 1x sond utspädning kan återanvändas upp till tre gånger innan de kasseras.
10. Skölj plattan med 0,2 x SSC.
11. Tvätta med färsk 0,2 x SSC för 1 h vid 60 °C.
12. Flytta plattorna till rumstemperatur och jämvikt i 5 min.
13. Tvätta plattan med 0,2 x SSC i 5 min.
14. Tvätta plattan med 1x PBT i 15 min.
15. Tvätta plattan med 2% H₂O₂ i 1x PBT (0,1% Triton-x-100) för 1 h.
    OBS: Denna lösning är ljuskänslig, så den bör göras färsk för varje experiment och avskärmas från ljus. Plattorna bör också vara avskärmade från ljus eller omintetgjorts under denna inkubation.
16. Tvätta plattan med 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1%Tween-20) i 15 min.
17. Utspädd blockeringrea till 2% i malesyra buffert (100 mM hansyra, 150 mM NaCl, pH 7,5). Blockera cellerna i denna blandning i minst 1 h vid rumstemperatur.
18. Byt ut blockeringslösning med anti-digoxygenin-POD-antikropp som späds ut 1:1 000 i 2% Blockeringsreagens i malesyrabuffert. Inkubera natten vid 4 °C.
19. Skölj plattan 3x med 1x TBST.
20. Tvätta 4x med 2 ml 1x TBST i minst 15 min per tvätt med kontinuerlig gungning.
21. Tvätta 2x med 1x PBT i minst 10 min per tvätt med kontinuerlig gungning.
22. Späd Cy3-konjugerat tyramid 1:25 i 1x PBT. Tvätta plattan med 750 μl av denna utspädning i 5 min.
    OBS: Denna lösning är extremt ljuskänslig, och plattor bör hållas omkullkastade eller avskärmade från ljus för resten av experimentet för att undvika signalförsämring.
23. Tillsätt 2,5 μL 0,3% H₂O₂ till denna lösning och inkubera med kontinuerlig gungning i ytterligare 40 min vid rumstemperatur.
24. Tvätta 4x med 1x TBST i minst 15 min per tvätt med kontinuerlig gungning.
25. Skölj med 1x PBT.
26. Fixa cellerna genom att inkubera för 1 h i rumstemperatur i 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA och 1 mM MgSO₄ i 3,7% formaldehyd).
27. Ta bort lösningen och byt ut med 1x PBS. Förvara plattorna i en folierad behållare vid 4 °C tills den vidarebearbetar.

6. Bildceller

OBS: Imaging utfördes med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop.

1. Placera provplattan på mikroskopstadiet och rikta in markeringen i steg 3.1 till scenens framsida.
2. Fokusera bilden så att det rutnätsfodrade följesåget är synligt och justera räckhåll för det rutnät som tas i steg 3.4 som referens för att matcha det synfält som tas upp i kalciumbilden (avsnitt 3).
3. Hämta bilder av både rutnätet och cellerna.
4. Belysa proverna med en 595 nm TRITC laser. Justera vinstvärdena för att på lämpligt sätt skilja signal från bakgrunden med hjälp av bilderna från de negativa kontrollcellerna och hämta en stillbild.
   OBS: Helst bestäms bakgrundsfluorescensnivåerna baserat på en negativ kontrollplatta som bearbetas parallellt med en icke-inriktningskänsla RNA-sond. Förstärkningsinställningar justeras så att den här plattan verkar helt svart (motsvarande bakgrundsnivåer), och hålls sedan konstant för andra plattor som avbildas från den experimentella batchen.

7. Databehandling

Databehandling utfördes med hjälp av Nikon Elements programvara.

1. Öppna 2 h kalciumbilden från steg 3.7. Identifiera pixlar som motsvarar varje enskild cell genom att välja Binär > Spotdetection > Ljuspunkter. Kontrollera att FITC-kanalen är markerad.
2. Färgade cirklar visas över enskilda celler när lagret har genererats. Justera cellfördelnings- och storleksparametrarna så att så många celler som möjligt känns igen och associeras med en unik identifierare.
3. Spåra cellerna över alla bildrutor genom att navigera till Visa > Analyskontroller > Spårningsalternativ. Ange 5 bildrutor som det maximala avståndet mellan spår, ta bort objekt som är associerade med färre än 600 bildrutor och välj alternativet Stäng mellanrum. Välj Spårbinärer om du vill använda cellspårning på bilden.
4. När cellerna har spårats tar du bort ett objekt som inte motsvarar en enskild cell manuellt (till exempel en klump celler). Datapunkter bör dock inte uteslutas från ytterligare analys baserad på morfologi av kalciumaktiviteten spårning.
5. Välj Visa överlägg > Visa binärt objekt-IDi fönstret Bild. Bläddra till slutet av bilden (bildruta 901) och välj Redigera > Skapa vyögonblicksbild (8bit RGB)> Aktuell ram > OK. Detta skapar en ögonblicksbild av den sista bildrutan i bilden med varje cell associerade binära ID-kort synliga. Spara den här bilden.
6. Exportera tidsseriedata genom att markera alla objekt följt av Exportdata till Excel. Spara utdata som en CSV-fil.
7. Öppna FISH-bilden. Optimera spotdetektering som i steg 7.1–7.2 med hjälp av TRITC-kanalen i stället för FITC-kanalen. Ta bort alla felaktigt tilldelade binärer manuellt och välj sedan Automatiserade mätresultat > Uppdatera mått för att beräkna signalintensiteten för varje cell. Exportera en bildögonblicksbild och en datatabell genom att upprepa steg 7.5 och 7.6.
8. Skapa ett kalkylblad där kolumn A är märkt FISH Binary ID och kolumn B är märkt KalciumbinärTID. Öppna bilderna som exporteras i steg 7.5 och 7.7. För varje objekt som identifieras i FISH-bilden (steg 7.7) registrerar du det binära ID:t i kolumn A. Leta sedan upp motsvarande cell i kalciumbilden (steg 7.5) och registrera det binära ID:t i kolumn B. Celler som inte kan identifieras med tillförsikt i båda bilderna ska inte läggas till i kalkylbladet.
   OBS: Det kan vara bra att använda ett fotoredigeringsprogram som Adobe Photoshop eller GIMP bildredigerare för att öppna båda bilderna, göra en semi-transparent, och överlagra den på sin partnerbild för att lättare identifiera och länka de två binära ID som är associerade med varje cell.
9. För varje identifierad cell, sammanställa (antingen manuellt eller med ett skript) dess tidsserie kalciumdata (associerat med kalciumbinärt ID och exporteras i steg 7.6) och dess genuttrycksdata (associerat med FISH Binary ID och exporteras i steg 7.7).
   OBS: Nedströms databehandling och analys kan innebära att sammanställa dessa data i en enda datatabell och tillämpa en rad analytiska tekniker inklusive spike räkna, fraktal analys, och Markovian entropi som gör det möjligt för utredaren att urskilja nya mönster av kalciumaktivitet ^17,18.

Representative Results

Ett framgångsrikt exempel på separerade celler som förberetts för kalciumavbildning kan ses i figur 2A. Celler är tätt pläterade, vilket gör att den maximala mängden information som ska samlas in från varje bild, men inte så tätt pläterade att enskilda celler inte kan vara tryggt framstående bildar varandra. Fluorescens detekteras för varje definierad cell under 2 h bildperioden. Visualisering av en sammansatt tomt som innehåller spår för alla celler som registrerats i ett experiment visar i vilken grad bulk- eller populationsmätningar kan dölja mer nyanserade mönster av tillsattbeteende (figur 2B). När de inspelade profilerna för enskilda celler isoleras kan exempel på den oregelbundna tillsatta aktiviteten som kännetecknar neurala stamceller tydligt identifieras. Till skillnad från mogna nervceller uppvisar embryonala neuronala celler oregelbundna, mycket varierande och komplexa karaktär kalciumaktivitet (figur 2B). För att kvantifiera denna komplexitet har tillämpningen av olika dataanalysmetoder tillämpats^17,18, inklusive olika parametrar för att definiera en spik(figur 2C).

Framgångsrik fluorescens i situ hybridisering, inklusive framgångsrik design och syntes av en antisense mRNA sond, kan bedömas genom att jämföra den experimentella plattan mot en bakgrundskontroll ruvad euberas med en icke-bindande känsla RNA kontroll(figur 3A,B). En positiv sondkontroll kan också utföras genom bearbetning av en celltyp som är känd för att uttrycka målet mRNA på påvisbara nivåer.

Identifiering av samma cell över kalcium och FISH imaging kräver att cellerna behåller ungefär samma position under sond hybridisering och bearbetning. Om plattorhanteras ungefär eller tvättar utförs alltför kraftfullt, celler kan lossna från plattan ytan och antingen förloras när lösningen kasseras eller deponeras på en annan plats på plattan, vilket gör det omöjligt för dem att matchas över bilder(figur 4A). Om detta avbrott påverkar endast några av cellerna i synfältet kan det fortfarande vara möjligt att upptäcka och tilldela vissa celler i bilden(bild 4B). Den maximala mängden data erhålls dock från ett experiment där FISH utförs noggrant och få celler går förlorade eller flyttas mellan bilder(figur 4C).

När data har samlats in för att beskriva både kalciumaktivitet och genuttryck för ett rimligt antal celler i utvecklingsstadiet(s) av intresse, kan ytterligare analyser utföras för att bedöma korrelationer mellan dessa två funktioner(figur 1). Ett antal mått har tillämpats för att kvantifiera kalciumaktivitetsmönster, inklusive spikräkning/frekvens, genomsnittlig effekt, Hurst exponentuppskattning och Markovian entropi mätning^17,18. Genuttryck kan definieras kvantitativt av absolut fluorescensnivå eller graderas på en binär (ja/nej) skala, beroende på de experimentella frågor som behandlas.

Resultat från experiment kolliderar kalcium aktivitet med uttryck för neurala stamfader markör gener visade många associationer mellan specifika mönster av kalciumaktivitet och signalsubstansfenotyper. Vid neurala plattan skede (steg 14), GABAergic celler uttrycker hämmande neuron markör gad1.1 uppvisar kalcium aktivitet som är mer regelbunden och högre amplitud än celler som saknar gad1.1 uttryck (Figur 5A). Dessutom, medan dessa gad1.1-uttryckerceller är associerade med högre nivåer av hög amplitud spiking, låg amplitud spiking är vanligare i glutamaterga celler uttrycker excitatory neuron markör slc17a7.

Bild 1: Schematisk av experimentellt arbetsflöde. Skalstång = 100 μm. Bilder i paneler 3-5 togs från Paudel et al. (2019)¹⁷. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 2: Kalciumavbildning och exempel aktivitetsprofiler. (A)Intracellulär kalciumaktivitet enligt Fluo4-AM: Varje 2 h bild består av 901 ramar, med en representativ ram show här. (B)Sammansatt täppa av fluorescensintensitet över tiden i alla celler inom det avbildade synfältet. Spåren visar tydligt fotoblekning av indikatorfärgning (Fluo4) övertid. Raster tomt på övre vänstra visar representativa spår av kalcium aktivitet efter tillämpningen av en de-trendalgoritm som utvecklats av Eilers och Boelen¹⁹, där celler som visas här uppvisar olika mönster av tillsattbeteende. (C)Tillämpning av olika tröskelvärden (150 % och 200 % av baslinjen, där baslinjen är genomsnittet av avtrendad lysrörsintensitet) för att definiera en spik (gröna och blå pilar). Skalstång = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 3: FISKavbildning. (A)FISK utförs med en icke-bindande känsla RNA sond som en negativ kontroll. Bildinställningarna har justerats så att inga celler verkar fluorescerande. Vissa synfält kan omfatta icke-cellskräp med viss fluorescens, till exempel sett i övre högra och nedre högra hörn av (A); Dessa kan ignoreras i syfte att ange bakgrundsinställning. (B)Samma bildinställningar används sedan för att avbilda en experimentell platta (antisense RNA-sond). Fluorescens under dessa förhållanden motsvarar genuttryck ovanför bakgrunden. Skalstång = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 4: Bildöverlägg och coregistration. Schematiska representationer av ett prov som avbildas för kalciumaktivitet (celler som representeras av fyllda gröna cirklar) och efter FISH (celler som representeras av skuggade röda cirklar). (A)Celler som har rört sig avsevärt under provhantering och bearbetning kan inte identifieras på ett tillförlitligt sätt i de två bilderna. (B)Cellstörningar kan endast påverka vissa celler i synfältet. Vissa celler kan tydligt identifieras i båda bilderna, medan andra inte kan matchas tryggt. (C)Om proverna hanteras noggrant förblir de flesta celler ostörda och kan identifieras i båda bilderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Ett exempel på tillämpning av denna metod, boxplots som visar associationer mellan kalciumaktivitet och genuttryck (GABA och glut för gener gad1.1 respektive slc17a7) i neuralplatta skede Xenopus laevis. I steg 14 uppvisar gad1.1-postivceller (GABA) högre amplitud och mer regelbunden kalciumaktivitet enligt definitionen i (A) Markovian entropy18 och (B)spikvärden med trösklar 125%, 150%, 200% och 300% av genomsnittet av den trendiga fluorescerande intensiteten (baslinjen)¹⁷ än slc17a7 positiva celler (Glut). Stjärnor indikerar statistiskt signifikanta skillnader enligt både Bonferroni-korrigerade tvåprov kolmogorov-Smirnov Test (p < 0,05) och Cohens d-statistik för effektstorlek (n = 5 kulturer och >100 celler; * 0,2 ≤ |d| < 0,5). Siffran ritades om och anpassades från datamängd som erhållits från Paudel et al.¹⁷. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Karakteristiska mönster av kalciumaktivitet har observerats i de celler som utgör det utvecklande nervsystemet, med specifika typer av aktivitet i samband med distinkta neuroutvecklingsprocesser. Ytterligare förståelse av de mekanismer genom vilka dessa informationstäta aktivitetsmönster översätts till transkriptionella svar kräver dock att information om kalciumaktivitet och genuttryck samlas in med encellig upplösning. Medan system som uppvisar mer stereotyp kalcium aktivitet, såsom mogna nervceller, kan rimligen analyseras på en bulk nivå, de oregelbundna mönster som kännetecknar embryonala nervsystemet är lätt maskeras av mindre exakta inspelningar.

Den experimentella ram som fastställs i detta protokoll är lätt att anpassa sig till en mängd olika celltyper och fluorescerande reportrar. Vävnad som innehåller praktiskt taget alla celltyper eller kombinationer av celltyper kan dissekeras från en modellorganism av intresse och pläteras för encellig avbildning. Förutom att tillåta cellidentifiering och isolera effekten av cellautonoma processer, gör en primär cellkultur metod experimentören att definiera mediekomponenter som önskas. Till exempel, experiment jämföra aktiviteten hos neuronala prekursorer i 2 mM Ca^{2 +} lösning har utförts för att undersöka om förhållandet mellan spike frekvens och signalsubstansfenotyp i embryonala ryggmärgen kan rekapituleras utan påverkan av cellceller interaktioner^13,20.

Även om detta protokoll utnyttjar lysrörsmarkören Fluo4-AM för att upptäcka intracellulär kalciumaktivitet, beroende på urvalskriterierna, kan användare välja andra kommersiellt tillgängliga markörer²¹, inklusive genetiskt kodade kalciumindikatorer. På samma sätt kan alternativa markörer användas för att övervaka dynamiska förändringar i koncentrationen av en jon av intresse (inklusive K⁺, Na⁺och Zn²⁺⁾, membranpotential eller cellulära pH. Bildinställningar och bildvaraktighet kan ändras vid behov.

Även om vi korrelerade kalciumaktivitet och neuronal fenotyp som en specifik applikation, är denna metod också tillämplig för en mängd andra cellulära egenskaper. Till exempel kan fluorescens i situ hybridisering utföras med sonder mot någon gen av intresse, inklusive neuronal markör ChAT eller transkriptionsfaktorn Engrailed, vilket möjliggör känslig upptäckt av en anpassningsbar panel av mRNA arter. Dessa sonder kan utformas för att vara isoformspecifika, stödja ytterligare målspecificitet om så önskas. Dubbel fisk kan utföras med hjälp av sonder konjugerade till flera två olika fluorofforer, vilket möjliggör samtidig bedömning av uttrycket av flera gener. De ytterligare tvättar som krävs av denna typ av experiment är dock förknippade med en ökad chans till cellförlust eller rörelse och kräver erfarenhet och delikatess som ska utföras framgångsrikt.

Oavsett eventuella experimentspecifika ändringar som gjorts i det här protokollet finns det flera viktiga steg som kräver noggrann uppmärksamhet. Dissektioner bör utföras med försiktighet för att avlägsna alla förorenande vävnader eller cellpopulationer. eftersom rumsliga mönster går förlorade när utväxter separeras, kommer eventuella återstående celler från angränsande vävnader att varvas med och omöjligatt skilja från de celler av intresse. När cellerna har pläterats ska proverna hanteras så försiktigt som möjligt för att förhindra att celler lossnar. Viktigast av allt innebär detta att alla lösningsändringar bör utföras långsamt och försiktigt, med pipetten placerad vid kanten av plattan när lösningen tas bort och tillsätts. Detta kommer att säkerställa att celler kan identifieras tryggt i både kalcium och FISK bilder. Om celler störs under bearbetningen kan det vara omöjligt att identifiera vissa eller alla motsvarande celler mellan de två bilderna. Vi rekommenderar felning på sidan av försiktighet med dessa uppdrag, så att endast entydigt motsvarande celler används för vidare analys.

Beroende på vilken biologisk fråga som tas upp kan en mängd olika analysmetoder vara lämpliga. Kalciumaktiviteten i tidsserier kan bearbetas och kvantifieras på olika sätt, med experimentflexibilitet när det gäller att välja avtrender parametrar, analysmått och analysparametrar (till exempel % av baslinjetröskeln som används för att definiera en kalciumspik). Korrelationer mellan kalciumaktivitet och genuttrycksnivå kan ritas genom att analysera genuttryck som ett absolut eller relativt fluorescensvärde som utvinns ur FISH-bilden. Alternativt kan korrelationer mellan kalciumaktivitet och genuttryck (närvaro/frånvaro) dras genom att definiera en fluorescenströskel för positiv genuttryckssignal och tilldela "ja" eller "nej"-identifierare till enskilda celler. Som helhet ger detta experimentella schema en otroligt flexibel pipeline för insamling och preliminär analys av tidsseriedata tillsammans med cellmatchade genuttrycksdata. Sådana experiment kommer att vara avgörande för att bättre förstå de komplexa relationerna mellan cellulär dynamik och transkriptionella förändringar, vilket exemplifieras av identifiering av kalciumaktivitetsmönster som är karakteristiska för hämmande-utskändade och excitatoriska-utskändade neuronal prekursorer i embryonala Xenopus laevis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Animal Husbandry & Cell Culture
CHORULON (chorionic gonodotropin)	Merck Animal Health
Gentamycin sulfate salt	Millipore Sigma	G1264
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm	Millipore Sigma	CLS3160102
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm	Fisher Scientific	08-772A
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm	Fisher Scientific	08-772F
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	08-772E
Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta	Fisher Scientific	12-565-90
Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL	Fisher Scientific	13-711-7M
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Millipore Sigma	E10521
Collagenase B	Millipore Sigma	11088807001
Dumont #55 Forceps, Dumostar	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 Forceps, Dumostar	Fine Science Tools	11295-00
Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface	Nexcelom Bioscience	CLS5-25D-050
For Calcium Imaging
Fluo-4, AM, cell permeant	Thermo Fisher Scientific	F14201
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Thermo Fisher Scientific	P6866
For RNA Probe Generation
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222
rATP	Promega	P1132
rCTP	Promega	P1142
rGTP	Promega	P1152
rUTP	Promega	P1162
Digoxigenin-11-UTP	Millipore Sigma	3359247910
Rnase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	N8080119
T3 RNA Polymerase	Promega	P2083
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
RQ1 Rnase-Free Dnase	Promega	M6101
LiCl Precipitation Solution (7.5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9480
For Fluorescence In Situ Hybridization
Acetic Anhydride	Thermo Fisher Scientific	320102
Blocking Reagent	Millipore Sigma	11096176001
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments	Millipore Sigma	11207733910
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester	Millipore Sigma	GEPA13105
Solution Components
Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs	Fisher Scientific	AC349610
Calcium chloride dihydrate	Millipore Sigma	C3306
CHAPS hydrate	Millipore Sigma	C3023
Denhardt's Solution (50X)	Thermo Fisher Scientific	750018
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)	Promega	P1171
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate	Fisher Scientific	S311
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Millipore Sigma	E3889
Formamide (Deionized)	Thermo Fisher Scientific	AM9342
Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Millipore Sigma	H3393
HEPES (Ultra Pure)	Thermo Fisher Scientific	11344041
Hydrogen peroxide solution	Millipore Sigma	H1109
L-Cysteine	Millipore Sigma	168149
Magnesium chloride, pure, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC223211000
Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous	Fisher Scientific	AC413480050
Maleic Acid, 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	ACS125231000
MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP308
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX	Millipore Sigma	R3629
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Triethanolamine	Millipore Sigma	90279
Tris	Millipore Sigma	GE17-1321-01
TWEEN 20	Millipore Sigma	P9416
Equipment
Laminar Flow Hood	model of choice
Dissecting Microscope	model of choice
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	TE200
NIS-Elements Imaging Software	Nikon
Shaking Incubator	model of choice
Refrigerated Centrifuge	model of choice
Miscellaneous
Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity	Millipore Sigma	CLS430769
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22