Summary
L'immunoprécipitation de chromatine couplée au séquençage de prochaine génération (ChIP-seq) est une méthode employée pour établir des interactions entre des facteurs de transcription et les séquences génomiques qu'ils contrôlent. Ce protocole décrit les techniques d'exécution du ChIP-seq avec des biofilms bactériens, en utilisant Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm bactérien à titre d'exemple.
Abstract
L'immunoprécipitation de chromatine suivie du séquençage (ChIP-seq) est une technique qui peut être employée pour découvrir les cibles réglementaires des facteurs de transcription, des modifications d'histone, et d'autres protéines ADN-associées. Les données ChIP-seq peuvent également être utilisées pour trouver une liaison différentielle des facteurs de transcription dans différentes conditions environnementales ou types de cellules. Initialement, ChIP a été effectué par hybridation sur un microarray (ChIP-puce); cependant, ChIP-seq est devenu la méthode préférée grâce aux progrès technologiques, à la diminution des obstacles financiers au séquençage et à des quantités massives de données de haute qualité. Les techniques d'exécution de ChIP-seq avec des biofilms bactériens, une source majeure d'infections persistantes et chroniques, sont décrites dans ce protocole. ChIP-seq est réalisé sur Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm et cellules planctoniques, ciblant le régulateur maître de biofilm, CsgD, pour déterminer la liaison différentielle dans les deux types de cellules. Ici, nous démontrons la quantité appropriée de biofilm à récolter, normalisant à un échantillon de commande planctonique, homogénéisant le biofilm pour l'accès de cross-linker, et exécutant des étapes courantes de ChIP-seq pour obtenir des résultats de séquençage de haute qualité.
Introduction
Les biofilms bactériens, agrégats structurels de cellules incorporées dans une matrice autoproduite, sont résistants à la dessiccation, aux antibiotiques et aux réponses immunitaires de l'hôte1. En tant que tels, ils causent des infections persistantes et chroniques et présentent des défis uniques aux chercheurs en raison de leurs solutions à la survie et à la transmission. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) a été trouvé pour établir des populations phénotypiquement hétérogènes d'agrégats de biofilms qui sont résistants à la dessiccation et aux antibiotiques, et les cellules planctoniques qui expriment des facteurs de virulence dans la culture pure lorsqu'ils sont exposés au stress environnemental (28 oC, limitant les nutriments)2. Ces deux types de cellules surviennent en raison de l'expression bistable du régulateur maître de biofilm, CsgD3. Nous avons émis l'hypothèse qu'il pourrait s'agit d'une stratégie de couverture de pari pour Salmonella, où les cellules planctoniques participent à la transmission à court terme et les cellules biofilm sont en mesure de persister à long terme dans l'environnement jusqu'à ce qu'une occasion d'infecter un nouvel hôte se pose2,4. Bon nombre des éléments réglementaires qui contrôlent l'expression de l'opéron csg sont bien caractérisés5. Cependant, en dehors de l'adrA et de la csg operon6, peu d'objectifs réglementaires de csgD sont connus. L'identification du réseau de réglementation csgD nous aiderait à mieux comprendre le cycle de vie de Salmonella et le rôle que jouent les biofilms dans la transmission.
L'immunoprécipitation de chromatine suivie du séquençage à haut débit (ChIP-seq) est une technique in vivo puissante pour l'identification à l'échelle du génome des interactions protéine-ADN et fournit des informations sur les processus réglementaires impliquant des facteurs de transcription, des modifications d'histone, ou des nucléosomes7. De nouvelles études ont utilisé cette technique pour évaluer la liaison différentielle des protéines entre les conditions de croissance et les types de cellules8. Dans l'immunoprécipitation de chromatine (ChIP), les fragments d'ADN avec les protéines interagissant sont enrichis par la sélection d'anticorps des protéines cibles. Les cellules sont récoltées et les protéines liant l'ADN sont reliées à l'ADN in vivo par le traitement du liaison croisée du formaldéhyde. Les cellules sont lysées, libérant le contenu de la cellule, et la chromatine est cisaison dans environ 200 à 600 fragments de bp7. Les fragments d'ADN liés à la protéine cible sont immunoprécipités à l'aide d'anticorps, et isolés par dé-croisement suivi d'une digestion protéique9. Ces fragments d'ADN représentent des sites de liaison protéique s'adéquation avec l'hybridation à un microréseau (ChIP-chip) ou par le séquençage profond et la cartographie de la séquence génomique10,11. Bien que les expériences de puces ChIP produisent des données réglementaires adéquates, elles sont limitées en raison de l'utilisation de sondes coûteuses, ainsi que de l'hybridation et du biais de tableau12. ChIP-seq a une plus grande plage dynamique avec une résolution et une couverture nucléotides accrues, un rapport signal-bruit amélioré et moins d'artefacts par rapport à La puce ChIP7.
ChIP a été utilisé pour analyser la réglementation Sfh et OmpR dans Salmonella serovar Typhimurium13,14, quorum-détection AphA règlement dans Vibrio alginolyticus15, réglementation RpoS à Escherichi a coli16, virulence régulateur EspR réglementation dans Mycobacterium tuberculosis17, cyclases diguanylate potentiel par la réglementation AmrZ dans Pseudomonas aeruginosa18, ainsi que VraSR règlement dans Staphylococcus aureus19. Les expériences bactériennes ChIP-seq qui ont été décrites commencent par la croissance des cellules dans les médias liquides et la récolte sous forme de cellules individuelles. Cependant, l'analyse des biofilms et la régulation génétique correspondante représentent un nouvel ensemble de défis pour générer un protocole ChIP-seq réussi. Dans ce protocole, ChIP-seq est utilisé pour trouver des cibles réglementaires différentielles de CsgD, le S. Régulateur de biofilm maître de Typhimurium dans le biofilm et les types de cellules planctoniques. Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les quantités appropriées de biofilm pour ChIP-seq, récolter le biofilm de la culture des flacons, normaliser les échantillons de biofilm et de contrôle cellulaire unique, homogénéiser le biofilm et l'immunoprécipitation complète. Cela sera utile pour l'étude des cibles réglementaires dans les biofilms bactériens et peut être adapté pour de nombreuses espèces.
Protocol
1. Croissance des cellules de culture Flask
- À partir de stocks congelés, les souches de Sérovar Typhimurium de Salmonella stries de strie sur l'agar LB (20 mL de support solide dans la plaque Petri de 100 mm) avec l'antibiotique approprié et incuber à 37 oC pendant 16 à 20 h pour obtenir des colonies isolées.
- Inoculer 5 mL lb bouillon contenant l'antibiotique approprié dans un 25 mm x 150 mm borosilicate tube de culture avec 1-3 colonies de plaques de stries de l'étape 1.1. Incuber à 37 oC en secouant à 200 tr/min pendant 7 h.
- Mesurer OD600 de la culture de bouillon à l'aide d'un spectrophotomètre. Diluer un aliquot de culture 1 sur 4 en PBS dans une cuvette de 2 ml et mesurer l'absorption à 600 nm. Nous avons constaté que le facteur le plus critique à cette étape était le moment de la croissance. Les valeurs OD sont utilisées pour normaliser les cultures afin de fournir le nombre désiré de cellules à l'étape 1.4.
- Ajouter 1,0 OD600 volume équivalent de la culture cellulaire (c.-à-d. 109 cellules) à un flacon Erlenmeyer contenant 100 ml de 1% de tryptone avec l'antibiotique approprié. Incuber à 28 oC en secouant à 200 tr/min pendant 13 h.
Remarque : Les cellules de biofilm apparaîtront sous forme de flocons agrégés et les cellules planctoniques uniques se trouvent dans les médias nuageux.
2. Collecte sans cellules conditionnée 1% tryptone
- Recueillir la culture flacon pour sans cellules conditionné 1% tryptone. Pipette flacon culture plusieurs fois à mélanger avant d'ajouter à un tube de centrifugeuse.
- Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 10 oC pour granuler toutes les cellules.
- Décant supernatant dans une unité de filtre de 0,2 m, filtre à vide, et distribuer dans un nouveau tube.
Remarque : Les agrégats de biofilms adhèrent aux solutions conventionnelles (p. ex. PBS) et s'en tiennent aux côtés des tubes et des pointes de pipette. Étant donné qu'il permet une manipulation plus facile, nous utilisons des supports conditionnés (1% tryptone) pour déplacer le biofilm d'abord et utiliser PBS chaud immédiatement avant de recouper (étape 4.5) pour enlever les substrats de liaison transversale de protéines qui pourraient être présents dans les médias.
3. Séparer le biofilm et les cellules planctoniques des cultures flasques2
- À l'aide d'une pipette stérile de 25 ml, la culture de flacon d'aliquot en tubes de 15 ml. Centrifugeuse à vitesse lente (210 x g) pendant 2 min, pour séparer les deux types de cellules.
Remarque : Les cellules biofilm doivent former une pastille lâche au fond du tube - Pipette le supernatant contenant des cellules planctoniques dans deux tubes de centrifugeuse de 40 ml pour plus tard (étape 5). Retirer tout le liquide restant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Répétez l'opération jusqu'à ce que les types de cellules aient été séparés de tous les supports de culture flacon.
4. Préparation des agrégats de biofilms
Remarque : Le biofilm est récolté par poids humide pour produire 25 g d'ADN, le matériau de départ minimum recommandé pour le ChIP. Le facteur de conversion biofilm (BCF) de S. Typhimurium est 1,73 x 108 CFU/mg2. Les chercheurs qui préparent d'autres types de biofilms devront définir empiriquement le nombre de cellules par unité de poids du biofilm, qui est utilisé pour trouver le poids du biofilm requis pour 25 g de matériel de démarrage de l'ADN à l'aide de cette équation :
- Pesez avec précision un bouchon de 2 ml ou un tube à capuchon à vis.
- Resuspendre la pastille de biofilm dans 1 ml de tryptone conditionné. Déplacez le biofilm en suspension dans un bouchon de 2 ml pré-pesé ou un tube à capuchon à vis.
- Centrifugeuse de 1 min à 11 000 x g à 20 oC
- Retirez soigneusement tous les supernatants du tube et pesez le tube avec précision. Soustrayez le poids du tube du poids du tube avec du biofilm pour trouver le poids du biofilm. Il devrait être de 10 % du poids cible du biofilm.
- Laver les cellules pour enlever le reste de tryptone conditionné. Ajouter 1 ml de PBS chaud au tube et vortex doucement pour resuspendre la pastille. Centrifugeuse pendant 3 min à 8 000 x g de biofilm de granulés et retirer le supernatant. Ajouter 1 ml de PBS au tube et au vortex pour resuspendre la pastille.
5. Préparation des cellules planctoniques
- Enregistrez le volume et l'OD600 du supernatant planctonique à partir d'une centrifugation à vitesse lente (étape 3.2) à l'aide d'un spectrophotomètre
- Calculez le volume requis pour un OD600 final de 6,0 :
- Refroidir la centrifugeuse à 10 oC et sédimenter les cellules planctoniques par centrifugation (10 000 x g, 10 min à 10 oC)
- Retirez le supernatant et suspendez à nouveau le granule cellulaire dans le volume final de PBS calculé à l'étape 5.2.
- Re-mesurez OD600 des cellules planctoniques à l'aide d'un spectrophotomètre et distribuez le volume de 6,0 OD600 cellules planctoniques dans un bouchon de 2 ml ou un tube à capuchon à vis.
- Porter le volume à 1 ml avec PBS.
6. Cellules homogénéisantes
- Ajouter une perle en acier inoxydable stérilisée de 5 mm à chacun des tubes.
- Homogérisez à l'aide d'un moulin à mélangeur pendant 5 min à 30 Hz. Observez les tubes agrégés pour confirmer que le biofilm a été brisé.
- Transférer les cellules homogénéisées dans un nouveau tube de 1,5 ml, en évitant la perle métallique. Porter le volume à 1 ml avec PBS.
Remarque : Effectuez des dilutions en série pour énumérer les cellules d'entrée et vérifiez que le numéro de cellule final est proche du nombre souhaité ou prévu.
7. Liaison croisée des protéines à l'ADN
- Distribuer du formaldéhyde frais dans des tubes d'échantillon jusqu'à une concentration finale de 1 %. Incuber 30 min à température ambiante sur une roue tournante.
Attention : Le formaldéhyde est corrosif, irritant pour la peau, les yeux et les yeux, et inflammable. Distribuer dans une hotte de fumée. - Ajouter 1 M de glycine à une concentration finale de 125 mm pour arrêter les traverses. Incuber 5 min à température ambiante sur une roue tournante.
8. Laver les cellules pour enlever l'excès de liaison transversale
- Sédimenter les cellules à 8 000 x g pendant 3 min et retirer le supernatant
- Resuspendre la pastille dans 20 'L des inhibiteurs de la protéase 25x et 500 'L de filtre stérilisé PBS.
- Tube centrifugeuse pendant 3 min à 8000 x g et retirez le supernatant.
9. Cellules de lysing
- Resuspendre la pastille dans un tampon de Lyse de 600 l (voir le tableau 1) et incuber sur la glace pendant 10 min.
- Ajouter 1,4 ml de tampon de dilution IP (voir le tableau 1) à un tube stérile de 15 ml et déplacer les cellules lysées vers le tube de 15 ml. Gardez le tube sur la glace pendant 1,5 à 2 h, et vortexz doucement et occasionnellement.
Remarque : Certains matériaux cellulaires résistants peuvent rester dans des tubes. Une longue période d'incubation sur glace avec des tourbillons occasionnels brisera le matériau. Le reste sera démantelé par sonication.
10. Fragmenter l'ADN par sonication
- Placez le tube de 15 ml dans un bécher de glace et placez la sonde de 3 mm à l'intérieur du tube.
- Effectuer 5 tours de sonication de 30 s à 20-40% de 400 W avec 2 min de refroidissement sur la glace entre les rafales.
- Matériel précipité de sédiments par centrifugation (8000 x g, 10 min à 4 oC). Transférer le supernatant dans un nouveau tube.
- En option, effectuer le décroisementage à 65 oC pendant 30 à 60 min et digérer l'ARN et les protéines à 45 oC pendant 30 à 60 min avant de fonctionner sur un gel agarose de 2 % pour vérifier s'il y a des fragments de bonne taille.
Remarque : Immerger la sonde dans le lysate cellulaire. Gardez la solution sur la glace tout en sonicisant et en vous reposant. N'enlevez pas le tube pendant que la sonde sonicator pulse. La solution doit apparaître pré-sonication trouble et claire post-sonication.
11. Immunoprécipitating DNA-protein-anticorps complexes
- Préparation
- Distribuer un aliquot de 1,35 ml pour l'immunoprécipitation et un aliquot de 200 l comme contrôle des intrants. Entreposer le contrôle d'entrée à -80 oC jusqu'à ce que les étapes de décroisement et de digestion soient effectuées.
- Immunoprécipitation avec anticorps primaires
- Ajouter 10 g d'anticorps primaires purifiés spécifiques aux protéines à l'aliquot de 1,35 l. Incuber toute la nuit à 4 oC sur une roue tournante.
Remarque : L'anticorps primaire peut être un anticorps monoclonal, un sérum polyclonal de haute qualité ou un anticorps épitopte commercial (c.-à-d. anti-FLAG). - Ajouter 50 l de perles magnétiques Protég aux tubes à partir de l'étape 11.2.1 et incuber à 4 oC pendant 3 h sur une roue tournante.
- Placer le tampon de lavage IP 1, le tampon de lavage IP 2 et le pH TE 8.0 (voir le tableau 1) dans un seau à glace. Tampon d'élution chaude à 65 oC.
Remarque : Ne mettez pas de solution contenant un tampon d'élution sur la glace. - Lier les perles magnétiques De protéines G sur le côté des tubes à l'aide d'un support magnétique
- Effectuer les lavages : lavez 2x avec 750 l de tampon de lavage IP froid 1, lavez 1x avec 750 'L tampon de lavage IP froid 2, et lavez 2x avec 750 'L TE froid au pH 8.0. Gardez les tubes sur le support magnétique pendant les lavages.
- Ajouter 450 l de tampon d'élution IP (voir le tableau 1) à chaque tube et incuber à 65 oC pendant 30 min avec un vortex doux toutes les 5 minutes.
- Lier les perles sur le côté des tubes à l'aide d'un support magnétique. Attendez au moins 2 min jusqu'à ce que la solution soit claire.
- Distribuez le supernatant dégagé dans un nouveau tube de 1,5 ml, en prenant soin de ne pas déranger la pastille de perles magnétiques.
- Ajouter 10 g d'anticorps primaires purifiés spécifiques aux protéines à l'aliquot de 1,35 l. Incuber toute la nuit à 4 oC sur une roue tournante.
12. Décroisement des complexes ADN-protéines et digestion de l'ARN et des protéines copurifiants
- Ajouter 2 G RNase A et NaCl à une concentration finale de 0,3 M à chaque tube.
- Incuber à 65 oC, pour 6 h, ou toute la nuit.
- Terminer la digestion des protéines en ajoutant 180 g de protéinase K à chaque tube, puis en couve à 45 oC pendant 3 à 5 h.
13. Préparation et séquençage de la bibliothèque
- Purifier l'ADN à l'aide de perles magnétiques
Note : Les perles magnétiques sont préférées pour isoler les petites quantités d'ADN habituellement récupérées pendant le ChIP avec des cellules bactériennes. - Préparez les bibliothèques à l'aide d'un kit compatible avec la plate-forme de séquençage sélectionnée.
- Vérifiez la concentration de la bibliothèque à l'aide d'un fluoromètre et d'un kit d'ADN à large portée ou d'une trousse de quantification de la bibliothèque qRT-PCR.
Remarque : D'après notre expérience, les mesures du fluoromètre peuvent surestimer la concentration d'ADN. - Pool bibliothèques, en tenant compte d'une couverture adéquate pour chaque échantillon de bibliothèque. Pour le séquençage d'Illumina avec Salmonella, nous avons mis en commun 10 à 12 bibliothèques. Ajouter le pH 8.0 de Tris-HCl à une concentration finale de 1 mM.
- Séquence selon les spécifications de la plate-forme sélectionnée.
Representative Results
La préparation d'échantillons d'immunoprécipitation de chromatine à partir de biofilms bactériens comporte plusieurs étapes, comme le montre la figure 1. Il s'agit notamment de la culture du biofilm dans la culture flasque, la collecte des médias conditionnés, la collecte d'une quantité suffisante de biofilms et de cellules planctoniques comme contrôle, le lavage des cellules dans PBS, l'homogénéisation, le lien croisé des protéines à l'ADN, la lysation des cellules, la fragmentation de l'ADN par sonication, l'immunoprécipitation de l'ADN avec les anticorps et les perles de protéines appropriées, le lavage et l'élutation de l'ADN immunocipitated, et la purification de l'ADN pour la préparation de la bibliothèque.
Les cellules de Typhimurium cultivées dans la culture liquide sous des conditions biofilm-induisantes subissent le passage de phénotype pour former des agrégats multicellulaires de biofilm et des cellules planctoniques. Cette population contiendra environ 40 % d'agrégats de biofilms, qui expriment des niveaux plus élevés de cyclases de diguanylate (DGC) et de régulateurs de biofilms, et 60 % de cellules planctoniques, qui expriment des niveaux plus élevés de gènes associés à la virulence2,4 (Figure 2A). Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour récolter les deux types de cellules pour comparer des emplacements de transcription par ChIP-seq ; cependant, ce protocole peut être adapté à d'autres types de biofilms formés par d'autres espèces bactériennes. Les agrégats de biofilms et les cellules planctoniques sont séparés par centrifugation à vitesse lente, qui granule le biofilm et laisse les cellules planctoniques dans le supernatant2 (Figure 2B). Les types de cellules sont ensuite traités séparément pour les étapes ultérieures du protocole.
La quantité recommandée d'entrée d'ADN pour ChIP-seq est de 10-25 g20. En S. Typhimurium flacon culture, 30 mg de biofilm donne environ 25 g d'ADN. Puisque les agrégats de biofilm ont une abondance de matériel extracellulaire protéiné, nous avons émis l'hypothèse que cela interfèrerait avec l'efficacité des liaisons croisées. Si nous devions simplement normaliser les différents types de cellules par nombre cellulaire, le traitement des cellules planctoniques peut entraîner une quantité inégale de produit interconnecté présenté pour l'immunoprécipitation. Un analyse des protéines a été effectué pour déterminer la quantité équivalente de matière cellulaire planctonique correspondant à 30 mg de biofilm (figure 3). 6.0 OD600 des cellules planctoniques ont été moissonnées pour assortir le biofilm de 30 mg.
Les agrégats de biofilms doivent d'abord être décomposés pour permettre un accès égal des liens croisés à toutes les cellules. Nous avons constaté que la façon la plus uniforme et la plus rentable d'homogénéiser les cellules était d'utiliser un moulin à mélangeurs et une perle en acier inoxydable de 5 mm(figure 4A). Les cellules planctoniques sont traitées de la même façon pour réduire les variables de l'expérience ChIP-seq (Figure 4B).
Une fois que l'ADN a été fragmenté par sonication, relié s'entrecroisé, et traité avec RNase et Proteinase K, il peut être visualisé sur un gel d'agarose de 2%. L'ADN sonicated est décomposé en une collection de fragments qui apparaissent comme un frottis sur le gel d'agarose. La taille moyenne du fragment diminue avec un nombre croissant d'éclats de sonication (Figure 5). Le transfert d'énergie varie selon les unités sonicator, de sorte qu'un test de sonication est recommandé pour déterminer le nombre d'éclats de sonication nécessaires pour fragmenter l'ADN à une moyenne de moins de 1 kb. Pour notre expérience ChIP-seq, nous avons choisi 5 rafales.
Les lignes directrices enCODE recommandent la confirmation de l'activité de liaison des anticorps avec un immunoblot21. Dans ce cas, nous avons mesuré la spécificité et la force de notre anticorps de liaison par immunoblot sur des lysates de cellules entières préparés pour ChIP (Figure 6). Nous avons confirmé que l'anticorps se lie à CsgD-3xFLAG; les signaux anti-FLAG et anti-CsgD colocalisent au poids moléculaire prévu (28 kDa)22.
Les procédures ChIP donnent souvent de faibles concentrations d'ADN. Par conséquent, une méthode de purification qui élimine les contaminants et conserve une forte proportion de l'ADN a été choisie. La purification des perles magnétiques a été choisie plutôt que la purification à base de colonnes parce qu'elle a mieux conservé de faibles concentrations d'ADN ChIP d'entrée (figure 7) et éliminé les contaminants (données non présentées).
En raison de la réduction des quantités de départ de l'ADN, la préparation de bibliothèque de l'ADN ChIP peut nécessiter des adaptateurs dilués et l'enrichissement PCR. Avant le séquençage, les bibliothèques peuvent être visualisées par trace Bioanalyzer pour confirmer la distribution de taille correcte avant et après l'enrichissement de PCR (figure 8). En outre, s'il existe une cible réglementaire connue du facteur de transcription, qPCR devrait être utilisé pour confirmer l'enrichissement des régions de liaison en comparant le changement de pli (Ct) entre l'abondance connue de la cible et de la séquence de gène de référence dans l'ADN d'entrée immunoprécipité et sonicated.
Les données de séquençage du ChIP doivent être analysées en attribuant des scores de qualité, en coupant les bases de faible qualité, en alignant les lectures avant et vers l'arrière (dans le séquençage final apparié), en s'assemblant à un génome de référence de haute qualité, en trouvant des pics au-dessus de l'arrière-plan et en effectuant une analyse en aval (figure 9A). L'analyse en aval devrait inclure la visualisation et l'annotation des pics, la cohérence avec les échantillons de repli biologiques, et l'analyse des motifs, et pourrait inclure l'analyse de liaison différentielle entre les conditions ou les types de cellules, et l'intégration des données avec l'expression des gènes à partir de voies connues. Pour les données ChIP-seq comme la nôtre, les pics doivent être identifiés comme nettement supérieurs à l'arrière-plan(figure 9B,C,barres rouges) avec une détermination de la valeur p, et non pas simplement par changement de pli. En dernière analyse, les lectures cartographiées sont visualisées par rapport à l'annotation du génome de référence (Figure 9D). Un mauvais résultat ChIP-seq apparaîtrait comme input-seq sans aucun pic significatif au-dessus de l'arrière-plan.
Figure 1 : Illustration des étapes de ChIP-seq avec des biofilms bactériens. Dans la procédure décrite, S. Les cellules de Typhimurium sont cultivées dans la culture de flacon de Tryptone de 1% à 28 oC avec secousse (1), les médias conditionnés sans cellules sont recueillis pour la manipulation des types de cellules de biofilm (2), qui est utilisé pour recueillir une quantité suffisante de biofilm et de cellules planctoniques (3). Ces cellules sont lavées avec PBS et homogénéisées pour briser le biofilm (4). Les protéines sont reliées à l'ADN avec un lien de formaldéhyde, après quoi les cellules sont lysées pour libérer le contenu cellulaire (5). L'ADN dans le lysate cellulaire est fragmenté par sonication (6). L'ADN relié à la protéine cible est sélectionné par immunoprécipitation avec un anticorps qui se lie à la protéine cible et aux perles magnétiques de protéine G (7). L'ADN sélectionné est lavé et éludé à partir de perles magnétiques Protég (8) et purifié pour la préparation et le séquençage de la bibliothèque (9). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Modèle de flacon in vitro pour l'étude de S. Développement de biofilms Typhimurium. (A) S. Les cellules de typhimurium cultivées dans 1% tryptone pendant 13 h à 28 oC subissent le passage de phénotype pour former des agrégats de biofilm et des cellules planctoniques dans la phase liquide de la culture de flacon. (B) Les agrégats de biofilm et les cellules planctoniques de la culture flasque dans (A) ont été séparés par centrifugation à 210 x g pendant 2 min. Le supernatant a été récolté pour les préparations de cellules planctoniques et le granule a été récolté pour les préparations de cellules de biofilm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Concentrations totales de protéines pour les cellules planctoniques et les échantillons de cellules biofilm prélevés sur S. Typhimurium flask culture. Des essais coloriaux de protéine ont été exécutés et des quantités de protéine par rapport à une courbe standard de BSA ont été mesurées à 750 nm. La teneur en protéines des échantillons de cellules planctoniques lysées à 4,0, 6,0 et 8,0 OD600 ont été comparées à 30 mg d'agrégats de biofilm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Homogénéisation des échantillons de cellules de S. Cultures de flacons de biofilm de Typhimurium. (A) Les agrégats de biofilms de la culture du flacon resuspendus dans PBS (à gauche) ont été homogénéisés à l'aide d'un moulin à mélangeur à 30 Hz pendant 5 min (à droite). (B) Les cellules planctoniques de la culture de flacon s'est rechargée dans le PBS ont été traitées par moulin à mélangeur à 30 Hz pendant 5 min pour assurer la cohérence entre les échantillons de type cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : L'asstodonte de sonication avec des lysates de cellules pré-ChIP. Les échantillons d'agrégats de biofilms et de cellules planctoniques ont été séparés, homogénéisés, croisés et lysés. Les complexes ADN-protéines ont été sonicisés jusqu'à 8 fois à 30 s et 2 min sur la glace pour briser l'ADN en petits fragments. Une partie du lysate sonicated a été séparée sur un gel d'agarose de 2%. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Spécificité de liaison ciblée de l'anticorps anti-FLAG utilisé dans ChIP-seq. La spécificité d'anticorps a été évaluée par immunoblotting contre les lysates entiers de cellules préparés à partir des cultures de flacon du S. Typhimurium souches comme indiqué. Les échantillons de biofilms de la souche ' csgD 'p3xFLAG/csgD' et du WT représentent les agrégats de biofilms récoltés à partir de flacons, tandis que les souches 'csgD ' p3xFLAG et Les cellules planctoniques WT représentent les cellules planctoniques. Purifié Son CsgD étiqueté a été chargé comme un contrôle. Des lysates de cellules entières ont été normalisés de sorte que 30 g de protéines totales ont été analysés dans chaque voie. Les nombres sur la gauche se réfèrent à la taille (en kDa) des marqueurs de poids moléculaires présagés. L'anticorps primaire utilisé pour la tache supérieure était l'anticorps polyclonal lapin-anti-FLAG (Sigma-Aldrich #F7425), tandis que la tache inférieure a été incubée avec le lapin-anti-FLAG avec un anticorps monoclonal csgD-spécifique2. Goat anti-rabbit IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) et chèvre anti-souris IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) ont été utilisés comme anticorps secondaires. Les signaux fluorescents ont été visualisés à l'aide du système d'imagerie Odyssey CLx et du logiciel Image Studio 4.0 (Li-Cor Biosciences). Des images représentatives sont affichées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Stratégies de purification à base de colonnes ou de perles magnétiques pour de petites quantités d'ADN résultant d'expériences ChIP-seq. Des échantillons de quantités connues d'ADN ont été purifiés à l'aide de kits à colonne s'appuient sur des kits ou de perles magnétiques et la concentration de l'éluate a été mesurée après la purification. Les perles magnétiques ont montré une meilleure récupération à de faibles niveaux d'ADN, semblables aux faibles quantités d'ADN typiquement rencontrées à la fin du protocole ChIP-seq, mais avant la préparation de la bibliothèque NGS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Préparations à l'ADN ChIP et bibliothèques subséquentes visualisées par Bioanalyzer. (A) La taille moyenne de fragment de l'ADN génomique après la lyse et la sonication cellulaires était de 1000 pb, avec une majorité de fragments de l'ordre de 200 à 500 pb. (B) Le matériel de démarrage pour la préparation de la bibliothèque était inférieur à la détection. (C) La ligature de l'adaptateur et l'enrichissement PCR permet l'amplification des fragments de bibliothèque. (D) Une mauvaise préparation de bibliothèque a de faibles pics d'ADN, des pics de poids moléculaire s'envolé ou de poids moléculaire élevé, ou des pics d'adaptateur abondants à environ 100 pb. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9 : Les données ChIP-seq sont analysées à l'aide d'outils bioinformatiques et visualisées sur un navigateur génomique. A. Flowchart pour l'analyse bioinformatique typique des données de ChIP-seq. Les lectures brutes pour les biofilms (souchecsgD et p3xFLAG/csgD)et les cellules planctoniques(csgD et p3xFLAG) ont été nettoyées pour des lectures et des adaptateurs de mauvaise qualité, et cartographiées en S. Typhimurium 14028s génomes (NC_016856.1 pour le chromosome et NC_016855.1 pour le plasmide) par Bowtie2 (v2.3.3.1) avec paramètres par défaut23. MACS2 (v2.1.2) a été utilisé pour appeler les pics avec des paramètres de '-q 0.01 -- nomodel', en prenant des répliques de biofilms comme ensembles de données d'essai et planctoniques comme contrôle24. Le module MACS2 bdgcmp a été également utilisé pour générer une piste d'enrichissement des plis avec des paramètres de '-m FE'. Le fichier de pointe significatif avec la piste d'enrichissement de pli a été transformé en un fichier de perruque utilisant des outils de lit/bedClip/bedGraphToBigWig25 et visualisé sur le génome de référence utilisant le visualiseur de génomique intégrative v2.5.126. Des pics représentatifs sont affichés (barres rouges). (B) Une grande région de 40 kbp, qui contient plusieurs pics, est un résultat atypique, mais toujours potentiellement utile. (C) Il s'agit d'un résultat plus typique, montrant deux régions de pointe significatives. (D) Zoom sur le pic gauche en C, montrant lit la cartographie à la région du S. Typhimurium 14028s génome contenant des promoteurs divergents pour uspA et uspB. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tampons de lyse cellulaire |
| Tampon De Lysis |
| 50 mM Tris-HCl pH 8,1 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| inhibiteurs de la protéase |
| Tampon de dilution IP |
| 20 mM Tris-HCl pH 8,1 |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,01 % SDS |
| Tampons d'immunoprécipitation |
| Tampon de lavage IP 1 |
| 20 mM Tris-HCl pH 8,1 |
| 2 mM EDTA |
| 50 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,1 % DeSA |
| Tampon de lavage IP 2 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8,1 |
| 250 mM LiCl |
| 1 mM EDTA |
| 1% NP-40 |
| 1% d'acide désoxycholique |
| TE (T10E1) pH 8,0 |
| 10 mM Tris-HCl |
| 1 mM EDTA |
| Tampon d'élution |
| 1% SDS |
| 100 mM NaHCO3 |
Tableau 1. Recettes tampon.
Discussion
Ce protocole décrit une technique pour effectuer ChIP-seq avec Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm et cellules planctoniques de la culture pure, pour trouver des cibles réglementaires du régulateur maître biofilm, CsgD. Nous nous attendons à des informations de liaison différentielles en raison de la bi-stabilité de csgD dans les deux types de cellules, avec des niveaux élevés dans les agrégats de biofilms et de faibles niveaux dans les cellules planctoniques2,3. Cependant, cette technique peut également être appliquée à d'autres facteurs de transcription bactérienne, types de cellules, ou des conditions de croissance. En particulier, cette technique peut être adaptée à d'autres biofilms bactériens à l'aide d'un facteur de conversion déterminé expérimentalement pour le poids cFU par unité de cellules biofilm.
ChIP-seq peut être sujette à l'amplification de l'erreur technique par le séquençage ; cependant, la confirmation à des étapes critiques peut empêcher ce27. La spécificité primaire des anticorps est importante pour sélectionner uniquement le facteur de transcription cible et l'ADN qu'il contrôle pendant l'immunoprécipitation7. Dans cette expérience, csgD a été fusionné à un plasmide-encodé 3xFLAG tag à l'extrémité 3' du gène, correspondant au C-terminus de CsgD22. Le plasmide p3xFLAG sans csgD a été utilisé comme un «contrôle» (S. Typhimurium 14028 csgD et p3xFLAG). Les lignes directrices enCODE recommandent d'effectuer des immunoblots avec des anticorps primaires contre la protéine d'intérêt, et des lysates des souches chIP et souches de suppression21. Il est important de s'assurer que les conditions de croissance sont uniformes entre les répliques afin de réduire la variabilité des résultats de liaison des facteurs de transcription et de séquençage en aval. Si l'on prend soin de s'assurer que les tailles d'inoculum et les conditions de croissance pré-inoculum sont cohérentes, la croissance du biofilm dans la culture des flacons est cohérente4. Il est important de confirmer que tous les biofilms ont été brisés après l'homogénéisation, afin d'assurer l'égalité d'accès des réactifs, en particulier le liaison croisée de formaldéhyde, à toutes les cellules.
Plusieurs modifications peuvent permettre aux chercheurs d'utiliser ce protocole pour d'autres protéines liant l'ADN, les types de cellules, les souches, les conditions de croissance ou l'équipement de laboratoire. S'il est utilisé pour des espèces de biofilms autres que S. Le typhimurium, le facteur de conversion des unités de formation de colonies par unité de poids du biofilm doit être déterminé expérimentalement en récoltant différentes quantités de biofilm, en homogénéisant le biofilm à fond, et en effectuant des dilutions en série et le comptage des plaques pour créer une courbe standard, qui peut ne pas être exacte à des poids biofilm inférieurs2. Le transfert d'énergie sonicator et la résistance de type cellulaire peuvent différer ; par conséquent, un essai de sonication est recommandé pour trouver le nombre d'éclats de sonication qui produiront la gamme de taille de fragment requise pour la préparation et le séquençage de bibliothèque en aval11. La fragmentation de chromatine par nucléase micrococcique est une alternative à la sonication qui produit la haute résolution des emplacements d'occupation ; cependant, cette méthode peut introduire le biais de fragmentation7,28. La plage de taille de l'ADN peut être modifiée en fonction des trousses de préparation des bibliothèques en aval et des plates-formes de séquençage. D'autres méthodes d'homogénéisation peuvent être utilisées à la place de l'usine de mélangeur. Par exemple, un homogénéisateur de tissu en verre peut être substitué, mais il peut aérosol ou briser incomplètement le biofilm. En termes de contrôles, l'ADN pré-immunoprécipité peut être normalisé dans le traitement et l'analyse post-séquençage. Un contrôle de la propriété intellectuelle simulé e avec un sérum d'anticorps normal assorti à l'espèce peut être utilisé comme un contrôle ainsi13.
Les chercheurs doivent tenir compte des limites de cette méthode lorsqu'ils envisagent une expérience ChIP-seq. Des modifications importantes peuvent être nécessaires pour l'adapter à d'autres types de biofilms. Par exemple, avec Salmonella Typhimurium, la résuspension immédiate du biofilm dans le PBS entraîne une perte mesurable d'agrégats de biofilms. L'immunoprécipitation ciblant les cibles réglementaires des facteurs de transcription dans les bactéries peut entraîner de très petites quantités d'ADN, ce qui est un défi pour la purification et la détection à des étapes ultérieures. Les biais peuvent être introduits lors de la tonte et de la manipulation en aval lors de la détection de la bibliothèque9. En outre, cette méthode ne révèle pas les niveaux d'expression in vivo en réponse à la liaison facteur de transcription. Les chercheurs qui ont peu d'expérience en bioinformatique peuvent être mis au défi par le pipeline d'analyse. Cette méthode peut être longue et coûteuse; cependant, le coût du séquençage est souvent inférieur à un microréseau et diminue avec le temps à mesure que des améliorations technologiques continuent d'être apportées.
Peu de méthodes dans la littérature décrivent ChIP avec des bactéries, et la plupart des expériences bactériennes commencent par une condition de croissance simple13,14,15,17,18. La préparation de l'échantillon ChIP avec des cellules individuelles est simple et présente moins de défis que la préparation de l'échantillon ChIP avec des agrégats de biofilms. En ce qui concerne Le ChIP-seq, les méthodes précédentes d'étude des circuits cis-régulateurs, y compris l'évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX), les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA), la suppression de la puce ChIP, la suppression des promoteurs et l'analyse des journalistes ont été complétées ou remplacées par ChIP-seq29. ChIP-seq remplace la puce ChIP en raison de l'avancement des technologies et de la disponibilité du séquençage. Le séquençage profond fournit aux chercheurs des quantités massives de données qui peuvent identifier des sites avec une affinité de liaison plus faible et une résolution de paire de base plus élevée avec moins de matériel de départ que ChIP-chip11,30. L'analyse des données ChIP provenant d'organismes dont les génomes de référence de haute qualité est généralement rapide et spécifique. En outre, ChIP-seq est une méthode approfondie pour découvrir dans les sites de liaison prévus silico qui peuvent ne pas être occupés dans tous les types de cellules, la phase de croissance, ou les conditions environnementales31.
À l'avenir, ce protocole pourra être utilisé pour faciliter la compréhension de la pathogénie bactérienne, en particulier des organismes qui forment des biofilms. L'adoption générale de cette technique et la disponibilité de nouveaux ensembles de données peuvent mener à l'intégration des données afin d'identifier les groupes de protéines qui colocalisent pour contrôler les processus cellulaires dans les micro-organismes de formation de biofilms32. En outre, les données ChIP-seq et RNA-seq peuvent être intégrées pour construire des modèles de systèmes de réglementation33.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Cette recherche a été appuyée par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) (#2017-05737) à AW et par l'entremise de la Chaire Jarislowsky en biotechnologie. Le député a reçu l'appui d'une bourse du CRSN-CREATE dans le cadre du Programme intégré de formation sur les maladies infectieuses, la salubrité des aliments et les politiques publiques (ITraP) de l'Université de la Saskatchewan.
Les auteurs souhaitent remercier Dani Dale pour le tournage et le montage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
| Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
| Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
| BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
| Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
| Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
| Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
| Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
| Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
| Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
| LB media | VWR | 90000-808 | |
| Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Mixer mill | Retsch | MM400 | |
| Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
| NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
| Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
| Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
| Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
| Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
| Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
| Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
| Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
| Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
| Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |
References
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