Summary
Kromatin immunoprecipitation tillsammans med nästa generations sekvensering (ChIP-SEQ) är en metod som används för att etablera interaktioner mellan transkriptionsfaktorerna och de genomiska sekvenser de styr. Detta protokoll beskriver tekniker för att utföra ChIP-SEQ med bakteriella biofilmer, med hjälp av salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium bakteriell biofilm som ett exempel.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation följt av sekvensering (ChIP-SEQ) är en teknik som kan användas för att upptäcka de regulatoriska målen för transkriptionsfaktorer, histonmodifieringar och andra DNA-associerade proteiner. ChIP-SEQ-data kan också användas för att hitta differentiell bindning av transkriptionsfaktorer i olika miljöförhållanden eller celltyper. Inledningsvis, ChIP utfördes genom hybridisering på en microarray (ChIP-chip); ChIP-SEQ har dock blivit den bästa metoden genom tekniska framsteg, minskande ekonomiska hinder för sekvensering och stora mängder högkvalitativa data. Tekniker för att utföra ChIP-SEQ med bakteriella biofilmer, en viktig källa till ihållande och kroniska infektioner, beskrivs i detta protokoll. ChIP-SEQ utförs på salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium biofilm och plankton celler, med inriktning på Master biofilm regulator, csgd, att bestämma differential bindning i de två celltyper. Här visar vi lämplig mängd biofilm att skörda, normalisera till en plankton kontrollprov, homogenisering biofilm för Cross-Linker tillgång, och utföra rutinmässig chip-SEQ steg för att få högkvalitativa sekvensering resultat.
Introduction
Bakteriella biofilmer, strukturella aggregat av celler inbäddade i en egenproducerad matris, är resistenta mot uttorkning, antibiotika, och värd immunsvar1. Som sådan, de orsakar ihållande och kroniska infektioner och presentera unika utmaningar för forskare på grund av deras lösningar för överlevnad och överföring. Salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium (S. Typhimurium) har befunnits etablera fenotypiskt heterogena populationer av biofilm aggregat som är resistenta mot uttorkning och antibiotika, och plankton celler som uttrycker virulensfaktorer i renkultur när de utsätts för miljö stress (28 ° c, begränsa näringsämnen)2. Dessa två celltyper uppstår på grund av bistabila uttryck av befälhavaren biofilm regulator, csgd3. Vi har en hypotes om att detta kan vara en bet-hedging strategi för salmonella, där plankton celler deltar i kortsiktiga överföring och biofilm celler kan kvarstå långsiktigt i miljön tills en möjlighet att infektera en ny värd uppstår2,4. Många av de reglerande element som styr CSG operon uttryck är väl kännetecknas5. Men bortsett från ADRA och CSG operon6, några regulatoriska mål av csgd är kända. Identifiera CsgD reglerings nätverket skulle hjälpa oss att bättre förstå salmonella livscykel och den roll som bio Films spela i transmission.
Kromatin immunoprecipitation följt av hög genomströmning sekvensering (ChIP-SEQ) är en kraftfull in vivo teknik för genomomfattande identifiering av protein-DNA interaktioner och ger information om regleringsprocesser som inbegriper transkriptionsfaktorer, histonmodifieringar, eller nukleosomer7. Nyare studier har använt denna teknik för att bedöma differentiell proteinbindning mellan tillväxtförhållanden och celltyper8. I kromatin immunoprecipitation (chip), DNA-fragment med samverkande proteiner berikas genom antikropps val av målproteiner. Celler skördas och DNA-bindande proteiner korslänkas till DNA in vivo genom behandling med formaldehydcross-Linker. Celler lyseras, frigöra cellinnehållet, och kromatin är klippt i cirka 200 – 600 BP fragment7. DNA-fragment bundna till målproteinet immunopreciteras med hjälp av antikroppar, och isoleras genom de-crosslinking följt av proteinnedbrytning9. Dessa DNA-fragment representerar proteinbindnings ställen matchas av hybridisering till en microarray (ChIP-chip) eller genom djupsekvensering och kartläggning till genomsekvensen10,11. Även om ChIP-chip experiment ger adekvat reglerande data, de är begränsade på grund av användningen av dyra sonder, samt hybridisering och array bias12. ChIP-SEQ har ett större dynamiskt omfång med ökad nukleotid upplösning och täckning, förbättrad signal-brus-förhållande, och färre artefakter jämfört med ChIP-chip7.
ChIP har använts för att analysera SFH och ompr förordning i salmonella serovar typhimurium13,14, kvorum-Sensing APHA förordning i Vibrio alginolyticus15, RPOS förordning i Escherichia coli16, virulens regulator espr förordning i Mycobacterium tuberculosis17, potentiella diguanylate cyklaser genom amrz förordning i Pseudomonas aeruginosa18, samt vrasr reglering i Staphylococcus aureus19. De bakteriella ChIP-SEQ-experiment som har beskrivits börjar med växande celler i flytande media och skörd i encellig form. Analys av biofilmer och motsvarande genreglering är dock en ny uppsättning utmaningar för att skapa ett lyckat ChIP-SEQ-protokoll. I detta protokoll används ChIP-SEQ för att hitta differentiella regleringsmål för CsgD, S. Typhimurium Master biofilm regulator i biofilm och plankton celltyper. Detta protokoll beskriver metoder som används för att fastställa lämpliga mängder biofilm för ChIP-SEQ, Harvest biofilm från Flask kultur, normalisera biofilm och Single cell kontroll prover, homogenisera biofilm, och fullständig immunoprecipitation. Detta kommer att vara användbart för att studera regulatoriska mål i bakteriella biofilmer och kan anpassas för många arter.
Protocol
1. Flask odlings celltillväxt
- Från frysta bestånd, strimma salmonella serovar typhimurium stammar på lb agar (20 ml fast media i 100 mm petriskål) med lämplig antibiotika och inkubera vid 37 ° c i 16 – 20 h för att få isolerade kolonier.
- Inokulera 5 mL LB-buljong som innehåller lämpligt antibiotikum i ett 25 mm x 150 mm borosilikatkulturrör med 1 – 3 kolonier från strimma plattor från steg 1,1. Inkubera vid 37 ° c med skakning vid 200 rpm i 7 timmar.
- Mät OD600 av buljong kultur med hjälp av en spektrofotometer. Späd en alikvot av kultur 1 i 4 i PBS i en 2 mL kuvette och Mät absorbansen vid 600 Nm. Vi har funnit den mest kritiska faktorn i detta steg att vara den tid av tillväxt. OD-värdena används för att normalisera kulturerna för att leverera önskat antal celler i steg 1,4.
- Tillsätt 1,0 OD600 volymekvivalent med cellodling (dvs. ~ 109 celler) till en Erlenmeyerkolv innehållande 100 ml 1% trypton med lämpligt antibiotikum. Inkubera vid 28 ° c med skakning vid 200 rpm under 13 timmar.
Obs: biofilm celler kommer att visas som aggregerade flingor och enstaka plankton celler är i molnigt media.
2. samla cell-Free betingat 1% trypton
- Samla kolven kultur för cell-Free betingat 1% Tryptone. Pipettera kolven flera gånger för att blandas innan den läggs till i ett centrifugerör.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 10 min vid 10 ° c för att pelleten alla celler.
- Dekanera supernatanten i en 0,2 μm filterenhet, vakuum filter, och fördela i ett nytt rör.
Obs: biofilm aggregat är anhängare i konventionella lösningar (t. ex. PBS) och kommer att hålla sig till sidorna av rör och pipettspetsar. Eftersom det möjliggör enklare manipulation, använder vi konditionerade media (1% Tryptone) för att flytta biofilm initialt och använda varm PBS omedelbart innan cross-linking (steg 4,5) för att ta bort eventuella protein crosslinking substrat som kan förekomma i medierna.
3. separera biofilm och plankton celler från Flask kulturer2
- Med hjälp av en steril 25 mL pipett, alikvot-kultur i 15 mL-rör. Centrifugera vid låg hastighet (210 x g) i 2 minuter för att separera de två celltyperna.
Obs: biofilm celler bör bilda en lös pellet på botten av röret - Pipettera över supernatanten som innehåller Planktoniska celler till 2 40 mL centrifugrör för senare (steg 5). Ta bort all kvarvarande vätska, var noga med att inte störa pelleten. Upprepa tills celltyperna har separerats från alla Flask odlingsmedier.
4. förbereda biofilm aggregat
Anmärkning: biofilm skördas med våt vikt för att ge 25 μg DNA, det rekommenderade minimistartmaterialet för ChIP. Biofilms konverteringsfaktor (BCF) för S. Typhimurium är 1,73 x 108 CFU/mg2. Forskare som förbereder andra biofilm typer kommer att behöva empiriskt definiera antalet celler per viktenhet biofilm, som används för att hitta vikten av biofilm krävs för 25 μg DNA utgångsmaterial med hjälp av denna ekvation:
- Väg en 2 mL Snap Cap eller skruvlocket röret korrekt.
- Omsuspendera biofilmpelleten i 1 mL betingat Tryptone. Flytta den återsuspenderade biofilmen till ett förvägt 2 mL Snap Cap eller skruvlock röret.
- Centrifugera i 1 min vid 11 000 x g vid 20 ° c
- Ta försiktigt bort alla supernatanten från röret och väg röret korrekt. Subtrahera röret vikt från vikten av röret med biofilm att hitta vikten av biofilm. Det bör vara ± 10% av mål biofilm vikt.
- Tvätta celler för att ta bort kvarvarande konditionerade Tryptone. Tillsätt 1 mL varm PBS till röret och skaka försiktigt för att Omsuspendera pelleten. Centrifugera i 3 min vid 8 000 x g till pellets biofilm och ta bort supernatanten. Tillsätt 1 mL PBS till röret och virvel för att Omsuspendera pelleten.
5. förbereda Planktoniska celler
- Anteckna volymen och OD600 för plankton supernatanten från centrifugering med långsam hastighet (steg 3,2) med en spektrofotometer
- Beräkna den volym som krävs för en slutlig OD600 på 6,0:
- Kyl centrifugen till 10 ° c och sediment Planktoniska celler genom centrifugering (10 000 x g, 10 min vid 10 ° c)
- Ta bort supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i den slutliga volymen PBS beräknad i steg 5,2.
- Mät om OD600 av de Planktoniska cellerna med en spektrofotometer och fördela volymen 6,0 OD600 Planktoniska celler i ett 2 ml Snap Cap-eller skruvlock rör.
- Ta volym till 1 mL med PBS.
6. homogenisering celler
- Tillsätt en steriliserad 5 mm rostfrittstål pärla till var och en av rören.
- Homogenisera med en mixer kvarn i 5 min vid 30 Hz. Observera Samlingsrören för att bekräfta att biofilm har brutits isär.
- Överför de homogeniserade cellerna till en ny 1,5 mL tub, undvika Metallpärla. Flytta volymen till 1 mL med PBS.
Anmärkning: utför seriella utspädningar för att räkna upp inkommande celler och kontrollera att det slutliga cellnumret ligger nära det önskade eller förutsagda numret.
7. tvärbindning av proteiner till DNA
- Fördela färsk formaldehyd i provrör till en slutlig koncentration på 1%. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur på ett roterande hjul.
Försiktighet: formaldehyd är frätande, en hud, ögon, och respiratoriska irriterande, och brandfarlig. Fördela i ett draghuv. - Tillsätt 1 M glycin till en slutlig koncentration av 125 mM för att stoppa crosslinking. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur på ett roterande hjul.
8. Tvätta celler för att avlägsna överflödig crosslinker
- Sediment cellerna vid 8 000 x g i 3 min och ta bort supernatanten
- Omsuspendera pelleten i 20 μL 25x proteashämmare och 500 μL filtersteriliserad PBS.
- Centrifugera röret i 3 min vid 8000 x g och ta bort supernatanten.
9. lysing celler
- Omsuspendera pelleten i 600 μL lyseringsbuffert (se tabell 1) och inkubera på is i 10 min.
- Tillsätt 1,4 mL av IP-utspädnings bufferten (se tabell 1) till ett sterilt 15 ml rör och flytta lyserade celler till 15 ml-röret. Håll röret på is för 1.5-2 h, och Vortex försiktigt och ibland.
Anmärkning: vissa resistenta cell material kan finnas kvar i rören. En lång inkubationstid på is med enstaka vortexa kommer att bryta sönder material. Resten kommer att brytas upp genom ultraljudsbehandling.
10. fragmentera DNA genom ultraljudsbehandling
- Placera 15 mL-röret i en glasbägare och placera 3 mm-sonden inuti röret.
- Utför 5 ultraljudsbehandling rundor av 30 s på vid 20 – 40% av 400 W med 2 min kylning på is mellan skurar.
- Sedimentfällt material genom centrifugering (8000 x g, 10 min vid 4 ° c). Överför supernatanten till ett nytt rör.
- Alternativt utföra decrosslinking vid 65 ° c för 30 – 60 min och smälta RNA och protein vid 45 ° c för 30-60 min innan du kör på en 2% aguppstod gel för att kontrollera om rätt storlek fragment.
Obs: Sänk sonden i cellen lysate. Hålla lösningen på is medan sonikering och vila. Ta inte bort röret medan sonikatorn pulserar. Lösningen bör visas grumlig pre-ultraljudsbehandling och tydliga post-ultraljudsbehandling.
11. immunoprecipitating DNA-protein-antikroppskomplex
- Förberedelse
- Fördela en 1,35 mL alikvot för immunoprecipitation och 1 200 μL alikvot som en inmatningskontroll. Förvara inmatnings kontrollen vid-80 ° c tills decrosslinking och smälta steg utförs.
- Immunoprecipitation med primär antikropp
- Tillsätt 10 μg renad proteinspecifik primär antikropp till 1,35 μL alikvot. Inkubera över natten vid 4 ° c på ett roterande hjul.
Obs: den primära antikroppen kan vara en monoklonal antikropp, högkvalitativ polyklonala serum eller kommersiell epitop-antikropp (dvs. anti-flagga). - Tillsätt 50 μL protein G magnetiska pärlor i rören från steg 11.2.1 och inkubera vid 4 ° c i 3 h på ett roterande hjul.
- Placera IP tvättbuffert 1, IP tvättbuffert 2 och TE pH 8,0 (se tabell 1) i en ishink. Varm elueringbuffert till 65 ° c.
Placera inte lösningen som innehåller elueringbuffert på is. - Bind proteinet G magnetiska pärlor till sidan av rören med hjälp av ett magnetiskt stativ
- Utför tvättar: tvätta 2x med 750 μL kallt IP tvättbuffert 1, tvätta 1x med 750 μL kallt IP tvättbuffert 2, och tvätta 2x med 750 μL kallt TE vid pH 8,0. Håll rören på magnet stativet under tvättar.
- Tillsätt 450 μl IP-elutionsbuffert (se tabell 1) på varje tub och inkubera vid 65 ° c i 30 minuter med mild vortexa var 5: e minut.
- Bind pärlor till sidan av rören med hjälp av ett magnetiskt stativ. Vänta minst 2 minuter tills lösningen är klar.
- Fördela den rensade supernatanten till ett nytt 1,5 mL-rör, var noga med att inte störa den magnetiska pärlpelleten.
- Tillsätt 10 μg renad proteinspecifik primär antikropp till 1,35 μL alikvot. Inkubera över natten vid 4 ° c på ett roterande hjul.
12. decrosslinking DNA-proteinkomplex och smälta Co-Purifying RNA och protein
- Tillsätt 2 μg RNase A och NaCl till en slutlig koncentration på 0,3 M till varje tub.
- Inkubera vid 65 ° c, i ≥ 6 timmar eller över natten.
- Fullständig proteinnedbrytning genom att tillsätta 180 μg Proteinase K till varje tub och inkuberas vid 45 ° c i 3 – 5 h.
13. förberedelse av bibliotek och sekvensering
- Rena DNA med magnetiska pärlor
Obs: magnetiska pärlor är att föredra för att isolera de små mängder av DNA som vanligtvis återvinns under ChIP med bakterieceller. - Förbered bibliotek med hjälp av ett paket som är kompatibelt med den valda sekvenserings plattformen.
- Kontrollera biblioteks koncentrationen med en fluorometer och ett brett sortiment dsDNA-Kit eller en qRT-PCR-biblioteks kvantifieringssats.
Notera: enligt vår erfarenhet kan fluorometermätningar överskatta DNA-koncentrationen. - Poolbibliotek, som står för adekvat täckning för varje biblioteks prov. För Illumina sekvensering med salmonella, poolade vi 10 – 12 bibliotek. Tillsätt Tris-HCl pH 8,0 till en slutlig koncentration av 1 mM.
- Sekvens enligt den valda plattformens specifikationer.
Representative Results
Beredning av kromatin immunoprecipitation prover från bakteriell biofilm innebär flera steg, som visas i figur 1. Dessa inkluderar växande biofilm i Flask kultur, samla konditionerade medier, samla in en adekvat mängd biofilm och plankton celler som kontroll, tvätta celler i PBS, homogenisering, tvärbindning proteiner till DNA, lyseringslösning celler, Fragmentera DNA genom ultraljudsbehandling, immunopreciterande DNA med lämpliga antikroppar och protein G pärlor, tvättning och elminerande immunoprecipitated DNA, och renande DNA för bibliotek beredning och sekvensering.
S. typhimurium celler som odlas i flytande kultur under biofilm-inducerande villkor genomgå fenotyp byta till form flercelliga biofilm aggregat och plankton celler. Denna population kommer att innehålla cirka 40% biofilm aggregat, som uttrycker högre nivåer av diguanylate cyklaser (dgcs) och biofilm regulatorer, och 60% plankton celler, som uttrycker högre nivåer av virulens-associerade gener2,4 (figur 2A). I detta protokoll beskriver vi en metod för att skörda både celltyper att jämföra transkription platser genom ChIP-SEQ; Detta protokoll kan dock anpassas för andra typer av biofilmer som bildas av andra bakteriearter. Biofilm aggregat och plankton celler separeras med långsam hastighet centrifugering, som pellets biofilm och lämnar plankton celler i supernatanten2 (figur 2B). Celltyperna behandlas sedan separat för efterföljande steg i protokollet.
Den rekommenderade mängden DNA-indata för ChIP-SEQ är 10-25 μg20. I S. Typhimurium Flask kultur, 30 mg biofilm ger cirka 25 μg DNA. Eftersom biofilm aggregat har ett överflöd av proteinhaltiga extracellulära material, vi hypotesen att detta skulle störa effektiviteten i cross-linking. Om vi helt enkelt att normalisera de olika celltyper av cell nummer, behandling av plankton celler kan resultera i en ojämlik mängd tvärbunden produkt som presenteras för immunoprecipitation. En proteinanalys utfördes för att bestämma motsvarande mängd plankton cell material för att matcha 30 mg biofilm (figur 3). 6,0 OD600 av Planktoniska celler skördades för att matcha 30 mg biofilm.
Biofilm aggregat måste först brytas isär för att tillåta lika tillgång till Cross-Linker till alla celler. Vi fann att den mest enhetliga och hög genomströmning sätt att homogenisera cellerna var med hjälp av en mixer kvarn och 5 mm rostfrittstål pärla (figur 4a). Planktoniska celler behandlas på samma sätt för att minska variablerna i ChIP-SEQ-experimentet (figur 4B).
När DNA har fragmenterats av ultraljudsbehandling, tvärbunden, och behandlas med RNase och Proteinase K, det kan visualiseras på en 2% aguppstod gel. Sonicated DNA bryts ner i en samling fragment som visas som ett utstryk på agaros gel. Den genomsnittliga fragment storlek minskar med ett ökande antal ultraljudsbehandling skurar (figur 5). Energiöverföring varierar för olika sonikator enheter, så en ultraljudsbehandling assay rekommenderas att fastställa antalet ultraljudsbehandling skurar som krävs för att fragmentera DNA till ett genomsnitt av mindre än 1 KB. För vårt ChIP-SEQ experiment valde vi 5 skurar.
KODA riktlinjer rekommenderar en bekräftelse av antikropps mål bindning aktivitet med en immunoblot21. I detta fall mätte vi vår antikropp specificitet och styrka av bindning av immunoblot på hela cellen celllysat beredd för chip (figur 6). Vi bekräftade att antikroppen binder till CsgD-3xFLAG; anti-FLAG och anti-CsgD signaler colocalize vid den förväntade molekylvikten (28 kDa)22.
Spånprocedurer ger ofta låga koncentrationer av DNA. Därför valdes en reningsmetod som avlägsnar föroreningar och behåller en hög andel av DNA. Magnetisk pärla rening valdes över kolonnbaserade rening eftersom det behöll låga koncentrationer av indata ChIP DNA bättre (figur 7) och avlägsnade föroreningar (data visas inte).
På grund av reducerade start mängder av DNA kan biblioteks beredning av ChIP DNA kräva utspädda adaptrar och PCR-berikning. Före sekvensering kan biblioteken visualiseras genom Bioanalysator spår för att bekräfta korrekt storleksfördelning före och efter PCR-berikning (figur 8). Dessutom, om det finns ett känt regleringsmål för transkriptionsfaktorn, ska qPCR användas för att bekräfta anrikning av bindnings områden genom att jämföra viknings förändringen (∆ ∆ CT) mellan känd mål-och referengensekvensförekomst i immunoprecipiterat och sonicated indatadna.
Data för Spånsekvensering bör analyseras genom att kvalitetsresultat tilldelas, trimning av låg kvalitets baser, justering av framåt-och bakåtläsningar (vid parning av ihopparade sekvenser), montering till ett referens-genom av hög kvalitet, att man hittar toppar ovanför bakgrunden och utför nedströms analys (figur 9a). Efterföljande analys bör omfatta visualisering och annotering av toppar, överensstämmelse med biologiska replikprover och motiv analys, och kan innefatta differential bindnings analys mellan villkor eller celltyper och dataintegrering med genuttryck från kända vägar. För ChIP-SEQ-data som vår, bör toppar identifieras som väsentligt över bakgrunden (figur 9B, C, röda staplar) med en p värdebestämning, inte bara genom att ändra. I den slutliga analysen visualiseras de mappade läsningarna mot anteckningen om referensgenomet (figur 9D). En dålig ChIP-SEQ resultat skulle visas som input-SEQ utan några signifikanta toppar ovan bakgrund.
Figur 1: illustration av steg i chip-SEQ med bakteriella biofilmer. I den beskrivna proceduren, S. Typhimurium celler odlas i 1% Tryptone kolv kultur vid 28 ° c med skakning (1), cell-fri betingat median är samlat för handlingen biofilm celltypen (2), vilken är använd till samla en tillräcklig mängd av biofilm och plankton cellerna (3). Dessa celler tvättas med PBS och homogeniseras att bryta isär biofilm (4). Proteiner är tvärbunden till DNA med en formaldehyd crosslinker, varefter celler lyseras för att frigöra cellinnehåll (5). DNA i cellen lysate är fragmenterad av ultraljudsbehandling (6). DNA tvärbunden till målproteinet väljs genom immunoprecipitation med en antikropp som binder till målet protein och protein G magnetiska pärlor (7). Valt DNA tvättas och elueras från protein G magnetiska pärlor (8) och renas för biblioteks beredning och sekvensering (9). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: in vitro-kolv modell för studier av S. Typhimurium biofilm utveckling. (a) S. Typhimurium celler som odlas i 1% trypton för 13 h vid 28 ° c genomgår fenotyp byte för att bilda biofilm aggregat och plankton celler i vätskefasen av kolven kulturen. Bbiofilmaggregat och plankton celler från kolven i a separerades genom centrifugering vid 210 x g i 2 minuter. Supernatanten skördades för plankton cell preparat och pelleten skördades för biofilm cell preparat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: totala proteinkoncentrationer för Planktoniska celler och biofilm-cellprover som skördats från S. Typhimurium Flask kultur. Kolorimetriska protein analyser utfördes och protein mängder i förhållande till en standardkurva för BSA mättes vid 750 nm. Proteinhalten i lyserade plankton cellprover vid 4,0, 6,0 och 8,0 OD600 jämfördes med 30 mg bio film aggregat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: homogenisering av cellprov från S. Typhimurium biofilm kolv kulturer. A) biofilm aggregat från Flask kultur som återsuspenderas i PBS (vänster) homogeniserades med hjälp av en mixer fabrik vid 30 Hz i 5 min (höger). BPlanktoniska celler från Flask kulturen som återsuspenderas i PBS bearbetades av mixer fabriken vid 30 Hz i 5 minuter för att säkerställa överensstämmelse mellan cell typs proverna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ultraljudsbehandling analys med pre-chip cell Lysates. Biofilm aggregat och plankton cellprov separerades, homogeniseras, tvärbunden, och lysed. DNA-proteinkomplexen var sonicated upp till 8 gånger vid 30 s på och 2 min på isen för att bryta DNA i mindre fragment. En del av sonicated lysate separerades på en 2% aguppstod gel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: målbindande specificitet för anti-Flag-antikroppar som används i chip-SEQ. Antikropps specificitet bedömdes genom Immunoblotting mot hela cell celllysat beredd från kolv kulturer av S. Typhimurium stammar som visas. Stam ∆ csgd + p3xFLAG/csgd och WT biofilm prover representerar biofilm aggregat som skördats från flaskor, medan stam ∆csgd ± p3xFLAG och WT plankton celler representerar Planktoniska celler. Renade hans taggade CsgD var laddad som en kontroll. Hela cell celllysat normaliserades så att 30 μg totalt protein analyserades i varje körfält. Siffrorna till vänster hänvisar till storleken (i kDa) av de förfärgade molekylvikt markörer. Primär antikropp som används för övre blot var kanin-anti-flagga polyklonala antikroppar (Sigma-Aldrich #F7425), medan den undre blot inkuberades med kanin-anti-flagga tillsammans med en CsgD-specifik monoklonal antikropp2. Get anti-kanin IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) och get anti-mus IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) användes som sekundära antikroppar. Fluorescerande signaler visualiserades med hjälp av Odyssey CLx Imaging system och image Studio 4,0 mjukvarupaket (Li-cor Biosciences). Representativa bilder visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: kolumn-eller magnetisk pärlbaserad rening strategier för små mängder av DNA som följd av chip-SEQ experiment. Prover av kända mängder DNA renades med hjälp av kolonnbaserade satser eller magnetiska pärlor och koncentrationen av eluatet mättes efter rening. Magnetiska pärlor visade bättre återhämtning vid låga DNA-nivåer, liknande de låga mängder av DNA som vanligtvis påträffas i slutet av ChIP-SEQ-protokollet, men innan NGS bibliotek beredning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: chip DNA-preparat och efterföljande bibliotek visualiseras av Bioanalyzer. (A) genomsnittliga fragment storlek av GENOMISKT DNA efter cell Lys och ultraljudsbehandling var < 1000 BP, med en majoritet av fragment i 200 – 500 BP sortiment. (B) utgångsmaterial för biblioteks beredning var under detektering. C) adapterligering och PCR-berikning möjliggör förstärkning av biblioteksfragment. (D) en dålig biblioteks beredning har låg DNA toppar, udda formade eller hög molekylvikt toppar, eller riklig adapter toppar på cirka 100 BP. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: chip-SEQ-data analyseras med hjälp av bioinformatiska verktyg och visualiseras i en genomwebbläsare. A. flödesschema för typisk bioinformatisk analys av chip-SEQ-data. RAW-läsningar för biofilm (∆csgd -stam + p3xFLAG/csgd) och plankton-celler (∆csgd + p3xFLAG) rengörs för läsningar och adaptrar av låg kvalitet och mappas till S. Typhimurium 14028s genomen hos (NC_016856.1 för kromosomen och NC_016855.1 för plasmid) av Bowtie2 (v 2.3.3.1) med standardparametrar23. MACS2 (v 2.1.2) användes för att anropa topparna med parametrarna "-q 0,01--nomodel", med biofilm replikat som testdata mängder och plankton som kontroll24. Den MACS2 bdgcmp modulen användes vidare för att generera Fold-berikande spår med parametrar för "-m FE". Den betydande Peak-fil med fold-berikning spåret förvandlades till en peruk fil med bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 och visualiseras på referensgenomet med integrativ Genomics Viewer v 2.5.126. Representativa toppar visas (röda staplar). (B) stor region av ~ 40 KBP, som innehåller flera toppar, är ett atypiskt resultat men fortfarande potentiellt värdefulla. (C) Detta är ett mer typiskt resultat som visar två betydande toppregioner. (D) zooma in på vänster topp i C, visar läser kartläggning till regionen av S. Typhimurium 14028s genomet innehåller avvikande initiativtagare för USPA och uspb. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Celler lysis buffertar |
| Lysis buffert |
| 50 mM Tris-HCl pH 8,1 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| proteashämmare |
| Buffert för IP-utspädning |
| 20 mM Tris-HCl pH 8,1 |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,01% SDS |
| Buffertar för immunoprecipitation |
| IP tvättbuffert 1 |
| 20 mM Tris-HCl pH 8,1 |
| 2 mM EDTA |
| 50 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,1% SDS |
| IP tvättbuffert 2 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8,1 |
| 250 mM LiCl |
| 1 mM EDTA |
| 1% NP-40 |
| 1% deoxycholsyra |
| TE (T10E1) pH 8,0 |
| 10 mM Tris-HCl |
| 1 mM EDTA |
| Elueringbuffert |
| 1% SDS |
| 100 mM Nahco3 p.a. |
Tabell 1. Buffert recept.
Discussion
Detta protokoll beskriver en teknik för att utföra chip-SEQ med salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium biofilm och plankton celler från renkultur, att hitta regulatoriska mål för befälhavaren biofilm regulator, csgd. Vi förväntar oss differential bindningsinformation på grund av BI-stabiliteten hos csgd i de två celltyperna, med höga halter i bio Films aggregat och låga nivåer i plankton celler2,3. Denna teknik kan dock också tillämpas på andra bakteriella transkriptionsfaktorer, celltyper eller tillväxtförhållanden. I synnerhet kan denna teknik anpassas till andra bakteriella biofilmer med hjälp av en experimentellt bestämd omvandlingsfaktor för CFU per viktenhet biofilm celler.
ChIP-SEQ kan vara benägna att amplifiering av tekniska fel genom sekvensering; dock kan bekräftelse på kritiska steg förhindra detta27. Primär antikropp specificitet är viktigt för att välja endast målet transkription faktorn och DNA den kontroller under immunoprecipitation7. I detta experiment var csgd smält till en Plasmid-kodad 3xflag tagg vid 3 ' slutet av genen, som motsvarar C-terminus av csgd22. P3xFLAG plasmid utan csgD användes som en "kontroll" (S. Typhimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). Koda riktlinjer rekommendera att utföra Immunoblots med primär antikropp mot proteinet av intresse, och celllysat av chip stammar och strykningar stammar21. Det är viktigt att se till att tillväxtvillkoren är konsekventa över replikat för att minska variationer i transkriptionsfaktorbindningen och efterföljande sekvenserings resultat. Om man är noga med att säkerställa inokulum storlekar och pre-inokulum tillväxtvillkor är konsekventa, biofilm tillväxt i Flask kulturen är konsekvent4. Det är viktigt att bekräfta att alla biofilm har brutits sönder efter homogenisering, för att säkerställa lika tillgång till reagenser, särskilt formaldehyd Cross-Linker, till alla celler.
Flera ändringar kan göra det möjligt för forskare att använda detta protokoll för andra DNA-bindande proteiner, celltyper, stammar, tillväxtförhållanden eller laboratorieutrustning. Används för andra biofilmbildande arter än S. Typhimurium, omvandlingsfaktorn för kolonin bildar enheter per viktenhet biofilm måste bestämmas experimentellt genom att skörda olika mängder av biofilm, homogenisering biofilm grundligt, och utföra seriella utspädningar och plattan räkna för att skapa en standardkurva, som inte kan vara korrekt vid lägre biofilm vikter2. Ultraljudsapparat energiöverföring och celltyp resistens kan variera; Därför, en ultraljudsbehandling assay rekommenderas att hitta antalet ultraljudsbehandling skurar som kommer att producera fragment storleksintervall som krävs för nedströms bibliotek beredning och sekvensering11. Kromatin fragmentering av micrococcal Nuclease är ett alternativ till ultraljudsbehandling som ger hög upplösning av beläggning platser; Denna metod kan dock medföra fragmentering bias7,28. DNA-storleksintervall kan ändras beroende på nedströms bibliotek förberedelse kit och sekvensering plattformar. Andra metoder för homogenisering kan användas i stället för blandaren kvarnen. Till exempel kan en glas vävnad Homogenisatorer ersättas, men det kan aerosolize eller ofullständigt bryta upp biofilm. När det gäller kontroller, kan pre-immunoprecipitate DNA normaliseras i efter sekvensering bearbetning och analys. En mock-IP-kontroll med artmatchade normala antikropps serum kan användas som kontroll och13.
Forskare måste överväga begränsningarna för denna metod när man överväger en ChIP-SEQ experiment. Det kan krävas betydande ändringar för att anpassa det till andra typer av biofilmer. Till exempel, med salmonella typhimurium omedelbar resuspension av biofilm i PBS leder till mätbara förlust av biofilm aggregat. Immunoprecipitation inriktning regulatoriska mål av transkriptionsfaktorer i bakterier kan resultera i mycket små mängder av DNA, vilket är en utmaning för rening och detektion vid senare steg. Bias kan introduceras under kapning och nedströms manipulation under biblioteks detektering9. Dessutom avslöjar denna metod inte in vivo uttrycks nivåer som svar på transkriptionsfaktorbindningen. Forskare som har liten erfarenhet av bioinformatik kan utmanas av analyspipelinen. Denna metod kan vara tidskrävande och dyrt; men kostnaden för sekvensering är ofta lägre än en microarray och minskar med tiden som tekniska förbättringar fortsätter att göras.
Få metoder i litteraturen beskriver chip med bakterier, och de flesta bakteriella experiment börjar med en enkel tillväxtvillkor13,14,15,17,18. ChIP provberedning med enstaka celler är enkel och presenterar färre utmaningar än ChIP provberedning med biofilm aggregat. När det gäller ChIP-SEQ, tidigare metoder för att studera CIS-reglerande kretsar, inklusive systematisk utveckling av ligander genom exponentiell berikning (SELEX), elektroforetisk rörlighet Shift analyser (EMSA), ChIP-chip, promotor radering och reporter analys har kompletterats eller ersatts av ChIP-SEQ29. ChIP-SEQ ersätter ChIP-chip på grund av avancerad teknik och tillgång till sekvensering. Djupsekvensering ger forskare stora mängder data som kan identifiera platser med lägre bindnings tillhörighet och högre bas par upplösning med mindre utgångsmaterial än chip-chip11,30. Analys av ChIP data från organismer med hög kvalitet referens genom är i allmänhet snabb och specifik. Dessutom är ChIP-SEQ en grundlig metod för att upptäcka i silico förutspådda bindnings platser som inte kan upptas i alla celltyper, tillväxtfas eller miljöförhållanden31.
I framtiden kan detta protokoll användas för att underlätta förståelsen av bakteriell patogenes, särskilt biofilmbildande organismer. Ett brett antagande av denna teknik och tillgängligheten av nya datauppsättningar kan leda till dataintegrering för att identifiera grupper av proteiner som samlokaliserar för att styra cellulära processer i biofilmbildande mikroorganismer32. Dessutom kan ChIP-SEQ och RNA-SEQ-data integreras för att bygga regelsystem modeller33.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ett bidrag från Naturvetenskaps-och Ingenjörsvetenskaps rådet (NSERC) (#2017-05737) till AW och genom Jarislowsky-stolen i bioteknik. MP stöddes av ett NSERC-CREATE-stipendium genom det integrerade utbildningsprogrammet i infektionssjukdomar, livsmedelssäkerhet och allmän ordning (ITraP) vid University of Saskatchewan.
Författarna skulle vilja tacka Dani Dale för filmning och redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
| Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
| Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
| BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
| Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
| Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
| Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
| Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
| Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
| Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
| LB media | VWR | 90000-808 | |
| Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Mixer mill | Retsch | MM400 | |
| Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
| NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
| Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
| Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
| Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
| Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
| Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
| Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
| Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
| Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
| Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- MacKenzie, K. D., et al. Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence. Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).
- Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).
- MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species. Frontiers in Veterinary Science. 4, 307 (2017).
- Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq. Frontiers in Genetics. 6, 169 (2015).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Lieb, J. D. Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization. Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Kim, T. H., et al. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).
- Dillon, S. C., et al. Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism. Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).
- Perkins, T. T., et al. ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization. Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).
- Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus. Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).
- Peano, C., et al. Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis. Scientific Reports. 5 (1), 10469 (2015).
- Blasco, B., et al. Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein. PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621 (2012).
- Jones, C. J., et al. ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. PLoS pathogens. 10 (3), 1003984 (2014).
- Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus. Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).
- Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- MacKenzie, K. D., et al. Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains. PLoS Genetics. 15 (6), 1008233 (2019).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR. PloS One. 6 (10), 26015 (2011).
- Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes. Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).
- Lee, T. I., et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science. 298 (5594), 799-804 (2002).
- Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization. Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).
- Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. Defining bacterial regulons using ChIP-seq. Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).
