Summary
Denne rapporten beskriver screening av ulike vaskemidler for å forberede den visuelle GPCR, rhodopsin, og dens kompleks med mini-Go. Biokjemiske metoder som karakteriserer kvaliteten på komplekset på forskjellige stadier under rensing er demonstrert. Denne protokollen kan generaliseres til andre membranproteinkomplekser for deres fremtidige strukturelle studier.
Abstract
Nøkkelen til å bestemme krystallstrukturer av membranproteinkomplekser er kvaliteten på prøven før krystallisering. Spesielt er valget av vaskemiddel kritisk, fordi det påvirker både stabiliteten og monodispersiteten til komplekset. Vi har nylig bestemt krystallstrukturen til en aktiv tilstand av storfe rhodopsin kombinert med et konstruert G-protein, mini-Go, på 3.1 Å oppløsning. Her beskriver vi prosedyren for å optimalisere utarbeidelsen av rhodopsin-mini-Go-komplekset. Mørktilstand rhodopsin ble tilberedt i klassiske og neopentylglykol (NPG) vaskemidler, etterfulgt av kompleks dannelse med mini-Go under lyseksponering. Stabiliteten til rhodopsin ble vurdert av ultrafiolett synlig (UV-VIS) spektroskopi, som overvåker rekonstitueringen til rhodopsin av den lysfølsomme liganden, 9-cis retinal. Automatisert størrelseseksklonografi (SEC) ble brukt til å karakterisere polydopsinets monifikelse og rhodopsin-mini-Go-komplekset. SDS-polyakrylamidelektroforese (SDS-PAGE) bekreftet dannelsen av komplekset ved å identifisere et 1:1 molar-forhold mellom rhodopsin og mini-Go etter farging av gelen med Coomassie blå. Etter å ha kryssvalidert alle disse analytiske dataene, eliminerte vi uegnede vaskemidler og fortsatte med det beste kandidatvaskemiddelet for storskala forberedelse og krystallisering. Et ekstra problem oppsto fra heterogeniteten av N-glykosylering. Heterologously-uttrykt rhodopsin ble observert på SDS-PAGE å ha to forskjellige N-glycosylated populasjoner, som sannsynligvis ville ha hindret krystallogenes. Derfor ble forskjellige deglykosyleringsenzymer testet, og endoglycosidase F1 (EndoF1) produserte rhodopsin med en enkelt art av N-glykosylering. Med denne strategiske rørledningen for å karakterisere proteinkvalitet, ble utarbeidelsen av rhodopsin-mini-Go-komplekset optimalisert for å levere krystallstrukturen. Dette var bare den tredje krystallstrukturen til et GPCR-G proteinsignalkompleks. Denne tilnærmingen kan også generaliseres for andre membranproteiner og deres komplekser for å lette prøveforberedelse og strukturbestemmelse.
Introduction
Å bestemme krystallstrukturer av membranproteiner og deres komplekser har alltid vært utfordrende på grunn av vanskeligheter med å oppnå velfungerende krystaller. I motsetning til oppløselige proteiner utgjør integrerte membranproteiner en hydrofobe kjerne som strekker seg over cellemembranen. For å fjerne membranproteiner fra cellemembranen i vandig buffer, må vaskemidler brukes til å danne en vaskemiddel-protein micelle, og dermed erstatte lipidene rundt den hydrofobe kjernen av membranproteiner. Stabilitet, aktivitet og integritet av membranproteiner er direkte avhengig av de kjemiske og strukturelle egenskapene tilvaskemiddelet 1, og vaskemiddelets egenskaper bestemmer også størrelsen på micelle. En stor vaskemiddel micelle kan okkupere hydrofile overflater av en liten membran protein, og dermed hindre krystallisering på grunn av mangel på krystallkontakter ved bruk av dampdiffusjonsmetode. En liten vaskemiddelmicelle er en fordel for krystallografi, men korte kjedevaskemidler er vanligvis strengere og fører derfor til destabilisering og aggregering av membranproteinet. Derfor, før krystallisering, en ekstra vaskemiddel screening prosedyre er uunnværlig, vanligvis rettet mot kortere vaskemidler som fortsatt opprettholder protein stabilitet.
G protein-koblet reseptorer (GPCRs) er integrertmembran proteiner som inneholder syv transmembrane a-helices. GPCRs eksisterer i to hovedstater, enten en inaktiv tilstand stabilisert av inverse agonister eller antagonister, eller en aktiv tilstand bundet til en agonist og stabilisert av et G-protein, selv om det er sannsynlig at en rekke understater eksisterer mellom disse to ytterpunktene. Struktur bestemmelse av GPCRs opprinnelig fokusert på inaktive stater bundet til inverse agonister og antagonister på grunn av deres høyere stabilitet enn aktive stater2. Når GPCRs aktiveres ved agonist binding, reseptorene er svært dynamisk, og en kløft dannes midlertidig på cytoplasmatisk ansikt av reseptoren for G proteinkobling. Det antas at denne dynamikken er grunnen til at agonist-bundet GPCRs er ofte mer ustabilenn den inaktive tilstanden. Derfor blir det viktig å screene for vaskemidler som passer for reseptorens konformasjonstilstand under studien, fordi det er sannsynlig at mildere vaskemidler vil være nødvendig for å studere en aktiv tilstand sammenlignet med en inaktiv tilstand.
I denne rapporten bruker vi den visuelle GPCR, storfe rhodopsin3, og dens komplekse med mini-Go protein4,5 for vaskemiddel screening eksperimenter, som representerer inaktiv tilstand og aktiv tilstand, henholdsvis. Vaskemiddelscreeningen fokuserte på de klassiske alkylmaltosid- og glukosidvaskemidlene og neopentylglykol (NPG) vaskemidler. I denne sammenheng en klassisk vaskemiddel er bygget av en sukker hodegruppe og en alkyl kjede, mens NPG type vaskemidler inneholder to identiske klassiske vaskemidler som er smeltet sammen av en kvartær karbon på grensesnittet mellom sukker og alkyl kjeder6,7,8.
En eksperimentell arbeidsflyt ble designet fra rensing av rhodopsin i forskjellige vaskemidler, etterfulgt av dannelse av rhodopsin-mini-Go-komplekset og slutter med karakterisering av komplekset ved hjelp av flere metoder (Figur 1). For den inaktive tilstanden til rhodopsin ble rekonstituering av lysfølsom ligand 9-cis retinal overvåket av ultrafiolett synlig (UV-VIS) spektroskopi. Spekteret avslører den fysikalske tilstanden til netthinnen og indikerer miljøet i retinal bindingslommen av rhodopsin. Størrelse eksklusjon kromatografi (SEC) ble ansatt for å vurdere monodispersitet av renset rhodopsin samt dannelse av rhodopsin-mini-Go kompleks. Som SEC skiller proteinmolekyler etter størrelse og form, kan aggregert proteinpopulasjon identifiseres som de elute i tomrommet volum. For å bekrefte kompleks dannelse ble fraksjoner fra SEC vurdert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) for å bekrefte tilstedeværelsen av både rhodopsin og mini-Go.
En annen faktor som må vurderes er post-translational modifikasjoner (PTM) på membranproteiner. PTM som N-glykosylering observeres ofte på eukaryyotiske membranproteiner produsert i pattedyr- og insektcelleuttrykkssystemer. En begrenset N-glykosyleringstamme av humane embryonale nyre293 (HEK293) celler ble utviklet ved sletting av genkodingn N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI), noe som resulterte i homogen N-glykosylering av GlcNAc2Man5 på konsensusstedet Asn-X-Ser/Thr. Selv om N-glykosylering kan forhindres ved å mutere en aminosyrerester i konsensusområdet, kan dette også endre funksjonen til proteinet eller effektiviteten av folding. I storfe rhodopsin fører mutasjon av N-glykosylerte rester Asn15 til feil folding og redusert G proteinaktivering9,10. Rhodopsin en gang i denne rapporten ble uttrykt i HEK 293 GnTI-mangelfull cellelinje. SDS-PAGE viste imidlertid tilstedeværelsen av to arter av rhodopsin. Denne heterogeniteten kan forhindre krystalldannelse og derfor deglykosylering ved hjelp av peptid-N-glykosidase F (PNGase F) og endoglycosidase F1 (Endo F1) ble testet. Det deglykosylerte produktet var preget av SDS-PAGE og flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) for å identifisere nivået av glykosylering og homogenitet.
Protocol
MERK: Denne protokollen for vaskemiddelscreening er beskrevet for 30 g HEK293 cellepellet som startmateriale.
1. Materialer, kjemikalier og reagenser
MERK: Alle løsninger fremstilles ved hjelp av analytiske reagenser og ultrarent vann, som renses fra deionisert vann for å nå en resistivitet på 18,2 MΩ∙cm ved 25 °C.
- Bufferlagerløsninger
- Forbered 10x fosfat bufret saltvann (10x PBS).
- Forbered HEPES buffer: 1 M, titreret til pH 7.5 med NaOH.
- Forbered 5 M NaCl.
- Forbered 2 M MgCl2.
MERK: Alle lagerløsninger sendes gjennom et 0,22 μm filter for å opprettholde steriliteten.
- Løsninger for vaskemiddellager
- Forbered dodecylmaltoside (DDM), 10 % (w/v).
- Forbered decylmaltoside (DM), 10 % (w/v).
- Forbered 6-cykloheksyl-hexylmaltosid (Cymal-6), 10 % (w/v).
- Forbered 5-cykloheksyl-pentyl maltoside (Cymal-5), 10% (w / v).
- Forbered nonylglukosid (C9G), 10 % (w/v).
- Forbered laurylmaltose neopentylglykol (LMNG), 5 % (w/v).
- Forbered decylmaltose neopentylglykol (DMNG), 10 % (w/v).
- Forbered cymal-6 neopentylglykol (C6NG), 10 % (w/v).
- Forbered cymal-5 neopentylglykol (C5NG), 10 % (w/v).
- Forbered oktylglukose neopentylglykol (OGNG), 10 % (w/v).
MERK: For 10 % vaskemiddellagerløsning oppløses 1 g vaskemiddelpulver i ultrarent vann med skånsom gynge, og juster deretter det endelige volumet til 10 ml. Vaskemiddellageroppløsning bør oppbevares ved -20 °C for langtidslagring og på is mens du arbeider.
FORSIKTIG: Vaskemidler med flaske anbefales vanligvis å oppbevare ved fryseren -20 °C. Flaskene som inneholder vaskemiddelpulver skal varmes opp til romtemperatur før åpning. Vaskemiddelpulver er hygroskopisk, så temperaturkalibrering vil forhindre dannelse av kondens som vil fukte vaskemiddelet.
- Andre kjemikalier og reagenser
- Forbered 1D4 immunaffinitet agarose harpiks: 10 ml av 50% slurry.
MERK: 1D4 immunoaffinitet agarose er agarose perler knyttet til monoklonal Rho1D4 antistoff, som binder de siste 9 aminosyrer av storfe rhodopsin TETSQVAPA som epitop. 1D4 immunoaffinitet agarose fungerer som affinitet rensemateriale for å fange proteiner som inneholder en C-terminal 1D4 sekvens. Dette rensematerialet kan tilberedes9,,11 eller kjøpes. - Forbered 9-cis retinal løsning: 1 mM, oppløst i 100% etanol.
MERK: Unngå lyseksponering for netthinne under tilberedning og oppbevaring. - Forbered 1D4 peptid (sekvens TETSQVAPA): 800 μM, oppløst i vann.
- Forbered 1D4 immunaffinitet agarose harpiks: 10 ml av 50% slurry.
- Buffere
MERK: Alle buffere blandes fra lagerløsningene til ønsket konsentrasjon. Alle buffere er kjølt ned til 4 °C før bruk.- Klargjør buffer A: PBS, 0,04% DDM.
- Forbered buffer B: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,04% DDM.
- Forbered buffer C: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl og vaskemiddel ved arbeidskonsentrasjonen som er oppført i tabell 1.
- Forbered buffer D: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl.
- Forbered Elution buffer: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 80 μM 1D4 peptid og vaskemiddel ved arbeidskonsentrasjon.
- Forbered SEC-buffer: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,025% DDM; gjennom et filter på 0,22 μm.
- Løsningsmiddel for LC-MS
- Forbered løsningsmiddel A: acetonitrile som inneholder 0,1 % maursyre.
- Forbered løsemiddel B: ultrarent vann som inneholder 0,1 % maursyre.
- Forbered løsemiddel C: iso-propanol.
2. Cellemembranløselighet og proteinekstraksjon
- Tin 30 g HEK293 GnTI- cellepellet som uttrykker storfe rhodopsin mutant N2C /M257Y/D282C3,,9 til romtemperatur, tilsett 120 ml 1x PBS buffer som inneholder proteasehemmer cocktail og homogenisere ved hjelp av en Dounce homogenisator eller en elektrisk homogenisator (13000 rpm for 30 s). Samle den homogeniserte cellesuspensjonen i et beger og juster volumet til 150 ml.
MERK: 30 g cellepellet tilsvarer 3 L cellekultur ved 2 x 106 celle/ml tetthet. - Tilsett forsiktig 10% DDM til de homogeniserte cellene for å gi en endelig konsentrasjon på 1,25%. Rør på is i 1 t.
- Sentrifugerer cellen lysat ved 4 °C og 150 000 x g i 45 min for å fjerne det løsere avfallet.
- Overfør supernatanten til en 500 ml flaske og tilsett 10 ml av 1D4 immunaffinitetagaroseharpiks (50% slurry). Bland forsiktig den løsebiliserte cellelysaten og harpiksen i 4 timer eller over natten ved 4 °C.
- Last lysate/harpiksblandingen til en åpen kolonne for å samle harpiksen.
- Vask harpiksen med 10 kolonnevolumer (CV) av vaskbuffer A.
MERK: Kolonnevolumet er volumet på pakket (100%) agarose harpiks brukt. I dette tilfellet er 1 CV 5 ml. - Resuspender harpiksen med 2 CV med buffer A.
FORSIKTIG: Fra trinn 2.8 og utover er trinn som må utføres under dim rødlys tilstand merket med "[Dark]" i begynnelsen av beskrivelsen. - -Jeg har ikke noe valg. Tilsett 9-cis retinal til resuspendert harpiks til den endelige konsentrasjonen på 50 μM. Bland forsiktig ved 4 °C i 4-16 timer i mørket.
MERK: En kortere inkubasjonstid kan føre til ufullstendig rekonstituering av retinal. - -Jeg har ikke noe valg. Fjern flyten gjennom fra kolonnen. Vask harpiks med 20 CV Buffer A, etterfulgt av 15 CV Buffer B.
- -Jeg har ikke noe valg. Resuspender harpiksen i 2 CV Buffer B, og del deretter harpikssuspensjonen likt til 10 10 ml avhendingskolonner.
- -Jeg har ikke noe valg. Fjern strømmen gjennom fra kolonnen, og deretter resuspendere harpiksen i 1 ml buffer C. Inkuber i 1 time ved 4 °C.
- -Jeg har ikke noe valg. Gjenta trinn 2.11.
- -Jeg har ikke noe valg. Fjern flyten gjennom fra kolonnen, og deretter resuspendere harpiksen i 0,8 ml Elution Buffer for hver kolonne. Bland forsiktig i 2 h.
- -Jeg har ikke noe valg. Samle elution fra kolonnen i en 2 ml rør.
- -Jeg har ikke noe valg. Resuspender harpiksen i 0,7 ml Elution Buffer for hver kolonne. Bland forsiktig i 1 h.
- -Jeg har ikke noe valg. Samle elution fra kolonnen i samme rør.
3. UV-VIS spektroskopi
- Forbered spektrotometeret for å dekke måleområdet på 250-650 nm. Registrer grunnlinjen ved hjelp av vann eller Elution Buffer.
- -Jeg har ikke noe valg. Last det eluted proteinet til kvartscuvette. Mål spekteret av proteinprøven.
- -Jeg har ikke noe valg. Belys proteinet direkte i cuvette i 2 min med lys passert gjennom et 495 nm langpassfilter.
- Mål spekteret av den opplyste prøven.
- Utfør samme måling for alle proteinprøvene som renses i de andre 9 vaskemidler, både mørke og opplyste tilstander.
- Tegn kurvene (absorbans versus bølgelengde) i X-Y-punktdiagram.
4. Automatisert størrelse-eksklusjon kromatografi av rhodopsin og rhodopsin-mini-Go kompleks
- -Jeg har ikke noe valg. Konsentratprotein til 100 μL ved sentrifugering ved hjelp av en spinkonsentrator med en molekylvektcut-off (MWCO) på 30 kDa ved 4 °C. Overkonsentrerte prøver kan fortynnes ved hjelp av strømmen gjennom fra konsentratoren eller buffer C. For å bestemme proteinprøvekonsentrasjon, mål absorbans ved 280 nm ved hjelp av et spektrotometer.
MERK: Fra trinn 4.2 og utover krever ikke eksperimentet et mørkt miljø, og derfor kan prøver tilberedes under normalt lys. - Forbered 100 μL rhodopsin ved 0,7 mg/ml for hver vaskemiddeltilstand.
- Forbered 100 μL rhodopsin (0,7 mg/ml) og mini-Go4,,12 (0,2 mg/ml) blanding for hver vaskemiddeltilstand. Supplere blandingen med 1 mM MgCl2. Belys blandingen med lys fra et 495 nm langpassfilter og inkuber i 30 min.
- Monter en 24 ml gelfiltreringskolonne med et fraksjonsområde på 10-600 kDa av et globulært protein på en flytende kromatografirenser. Equilibrated kolonnen med SEC-buffer.
MERK: Væskekromatografirenseren er utstyrt med en autosampler, en detektor med flere bølgelengder og en fraksjonssamler. - Overfør prøvene til hetteglassene med autosampler og plasser dem i prøveskuffen. Programmer en metodefil for å automatisere sekvensielle SEC-kjøringer for hver prøve, med autosampleren som laster inn 77 μL av prøven til kolonnen, og renseren som eluting 24 ml SEC-buffer med en strømningshastighet på 0,5 ml / min per kjøring. Registrer absorbansen på 280 nm og 380 nm.
- Samle topp fraksjoner av rhodopsin og rhodopsin-mini-Go kompleks på oppbevaring volum rundt 12,9 ml.
- Analyser venstre rhodopsinprøver fra trinn 4.2 og toppfraksjonene av rhodopsin-mini-Go-kompleks på 4-12% SDS-denaturering gradient geler med Coomassie blå farging.
- Plott elutionkromatogramet (A280 eller A380 versus oppbevaringsvolum).
5. Deglycosylation og LC-MS studie
- For LC-MS-studien må du kun bruke rhodopsinprøven som er renset i LMNG-vaskemiddel.
- Forbered en 200 μL blanding av rhodopsin ved 1 mg/ml og PNGase F13 ved 0,01 mg/ml. Bland godt og inkuber ved 4 °C over natten.
- Forbered en 200 μL blanding av rhodopsin ved 1 mg/ml og Endo F113 ved 0,01 mg/ml. Bland godt og inkuber ved 4 °C over natten.
- Analyser fordøyelsesresultatet ved hjelp av SDS-PAGE og Coomassie blå farging.
- Konsentrer ubehandlet og Endo F1-behandlede rhodopsinprøver og underlagt SEC-rensing i buffer D.
MERK: Dette er for å forberede prøven med minimal mengde vaskemiddel for LC-MS-studien. Buffer D inneholder ikke vaskemiddel, men på grunn av den langsomme avhastigheten til LMNG fra et membranprotein14,vil rhodopsin ikke aggregeres. - Samle toppfraksjonen ved oppbevaringsvolum rundt 12,9 ml. Konsentrat til 1 mg/ml ved bruk av en spinkonsentrator (MWCO 30 kDa).
- Injiser 10 μg av proteinet i en Reprosil 200 C18-AQ-kolonne og elute kolonnen ved hjelp av den lineære gradientmetoden med løsemiddelsammensetningen og innstillingene som er oppført i tabell 2. Strømmen er delt til 25% for massespektrometer og 75% for UV-deteksjon.
Representative Results
Den eksperimentelle arbeidsflyten for prøveforberedelse og analyse er oppsummert i figur 1. Ved hjelp av åpne kolonner for småskala affinitetsrensing tillot oss å forberede prøver i mange forskjellige vaskemiddelforhold parallelt (figur 1A). Et slikt oppsett av rensing i liten skala ga tilstrekkelig protein for ytterligere analyser ved bruk av UV-VIS-spektroskopi, SEC og SDS-PAGE (figur 1B-C).
UV-VIS spektroskopi avslørte rhodopsin stabilitet
Stabiliteten til retinal-rekonstituert rhodopsin ble vurdert av denoptiske absorbansen (figur 2). I den mørke tilstanden er 9-cis retinal kovalent knyttet til Lys296 som en protonert Schiff base. Etter belysning er 9-cis retinal isomerisert til all-trans isoform og Schiff base linken er deprotonert. Den protonerte 9-cis retinal gir en absorpsjon topp på 488 nm, mens deprotonert all-trans retinal har en topp på 380 nm. UV-VIS-spektra av rhodopsin i DDM viste den typiske absorpsjonen av 9-cis retinal-bundet og lysaktivert rhodopsin, hvor et blått skifte på 108 nm med omtrent samme optiske tetthet ble tydelig observert (Figur 2A, øvre venstre panel). Når rhodopsin er destabilisert, og deretter bindingslommen for retinal endringer, noe som resulterer i retinal deprotonasjon og muligens dissosiasjon. Hvis dette skjer, og deretter spekteret viser bidraget fra deprotonasjon samt fri form for retinal15. Derfor bestemte vi effektiviteten av retinal rekonstituering i rhodopsin ved absorbansforholdet mellom proteinet (280 nm) og retinal (488 nm for protonert 9-cis retinal, 380 nm for deprotonert all-trans retinal) (Figur 2B). Rhodopsin prøver renset i de klassiske vaskemidler (DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, C9G) viser samme optiske profil. Prøvene som er renset i NPG-vaskemidler (LMNG, DMNG, Cymal-6NG, Cymal-5NG) viser imidlertid optiske profiler som antyder et suboptimalt bindingsmiljø for retinal med unntak av OGNG-prøven, som ga samme optiske profil som DDM-prøven.
Størrelse-eksklusjon kromatografi viste prøve renhet og protein monodispersitet.
SEC er et effektivt og robust analytisk verktøy for evaluering av proteinprøver under forberedelse og screening. Det validerer prøverenhet fra det forrige rensetrinnet samt monodispersiteten til proteinmolekylene. For rhodopsin og mini-Go-komplekset ble prøvekvaliteten tolket fra absorpsjonskurvene ved 280 nm og 380 nm (Figur 3A). De 280 nm-sporene viste tilstedeværelse av protein, og 380 nm-sporet viste tilstedeværelsen av retinal. Eventuelle signaler som vises i tomrommet volum (rundt 8 ml når du bruker denne kolonnen) ble tilskrevet proteinaggregater. Resultatene viste derfor at prøvene som ble utarbeidet i de klassiske vaskemidlene, var i monodisperstilstand med unntak av C9G, hvor en del av aggregatet dukket opp. I motsetning inneholdt prøver tilberedt ved hjelp av NPG-type vaskemidler mye mer aggregater enn C9G-prøven; LMNG og Cymal-6NG førte til den mest samlede formasjonen, men mindre aggregater ble observert i DMNG og Cymal-5NG. Unntaket var OGNG, som viste en lignende profil som DDM. Proteinaggregater som eluting på tomrommet volum hadde også dårligere retinal belegg, som vist av A280/ A380 ratio som hadde økt i forhold til toppen på oppbevaring volum på ~ 12,9 ml tilsvarende 135 kDa. En annen funksjon vi observerte var at både rhodopsin og rhodopsin-mini-Go eluted rundt samme oppbevaringvolum (Figur 3B). Dette er ikke overraskende, fordi den tilsynelatende molekylvekten av vaskemiddelbundet rhodopsin var 120 kDa og rhodopsin-mini-Go 144 kDa. Vi kunne derfor ikke fastslå kompleks dannelse bare fra SEC-dataene, så SDS-PAGE ble brukt til å analysere SEC-renset prøve.
SDS-PAGE bekreftet kompleks formasjon
SDS-PAGE er en standardmetode for å identifisere proteinkomponentene i en prøve. Konsentrert rhodopsin (før SEC rensing) ble analysert av SDS-PAGE for å bekrefte sin renhet, og viste to band nær 37 kDa og et smurt bånd over 50 kDa (Figur 4A). De to nedre bandene ble senere bekreftet å ha forskjellige N-glycosylation stater. Båndet over 50 kDa ble tolket som aggregerte rhodopsinoligomere indusert av SDS-PAGE-prøvebufferen fordi disse aggregatene ikke ble observert i SEC eller andre deteksjonsmetoder. Siden SEC-data ikke kunne bekrefte kompleks dannelse, ble SEC-eluted fraksjoner fra rhodopsin-mini-Go-prøver analysert ved hjelp av SDS-PAGE. SDS-PAGE viste proteinbånd av både rhodopsin og mini-Go under alle vaskemiddelforhold, noe som tyder på at komplekset ble dannet uavhengig av valg av vaskemiddel (Figur 4B).
LC-MS-spektrometri identifiserte N-glykosyleringsmønsteret i rhodopsin
Rhodopsin-prøver fra både affinitetsrensing og SEC viste to proteinbånd som migrerte med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 37 kDa på en SDS-PAGE-gel, som ikke kunne skilles av SEC ved bruk av en 24-ml kolonne. Ulike mønstre av N-glykosylering på heterologøst uttrykt rhodopsin fra HEK 293 GnTI- celler var den mest sannsynlige forklaringen. Derfor ble to enzymer, PNGase F og Endo F1, testet for deres evne til å deglycosylate rhodopsin. Fra SDS-PAGE-dataene reduserte Endo F1 molekylvekten til begge proteinbåndene til et enkelt produkt, mens PNGase F-fordøyelsen fortsatt ga to populasjoner (figur 5A). De ufordøyd og Endo F1-behandlede prøvene ble analysert ved hjelp av LC-MS-spektrometri for å identifisere massene av forskjellige arter. Dataene viste at rhodopsin produsert i HEK 293 GnTI- celler inneholdt enten en eller to N-glykaner, med en forskjell i masse på 1014 ± 1 Da. Endo F1-behandlet rhodopsin inneholdt ingen N-glycans og hadde en masseforskjell på 2027 ± 1 Da sammenlignet med rhodopsin som inneholder to N-glykaner. Disse resultatene er i samsvar med fraværet av enzymet N-acetylglucosaminyltransferase I i cellelinjen som brukes til å uttrykke rhodopsin, noe som resulterer i at alle N-glykaner har strukturen GlcNAc2Man5, (masse 1014 Da).
Figur 1: Prøveforberedelse og karakterisering for vaskemiddelscreeningseksperiment. (A) Tilberedning av rhodopsinprøver i forskjellige vaskemidler under rensing. (B) Metoder som brukes i protokollen: UV-VIS spektroskopi, størrelsesekskluderingkromatografi (SEC), SDS-PAGE og flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). (C) Eksperimentell arbeidsflyt for karakterisering av rhodopsin, rhodopsin-mini-Go, og deglycosylation produkt av rhodopsin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: UV-VIS spektroskopi av rhodopsin. (A) UV-VIS spektra av rhodopsin. Spektra av mørk tilstand, 9-cis retinal-bundet rhodopsin er vist i blå kurver. Etter belysning, 9-cis retinal er deprotonert og isomerizes i all-trans retinal, og spektra av opplyst rhodopsin er vist som røde kurver. Den kjemiske strukturen til hvert vaskemiddel er vist som et innfelt. (B) Forholdet mellom Henholdsvis A280/A488 (blå bar) og A280/A380 (rød bar). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kromatografiprofiler av rhodopsin og rhodopsin–mini-Go kompleks renset i 10 forskjellige vaskemidler. (A) Venstre panel viser SEC-profilene til prøver som er renset i de klassiske vaskemidlene. Det høyre panelet representerer SEC-profilene til prøver som er renset i NPG-typevaskemidler. Profilen til standard markørproteiner vises som overlegg sammen med DDM-prøven. Tolkningen av toppprofilene er vist for DMNG, med det ideelle scenariet (ingen aggregater) sett for DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 og OGNG. (B) Den forstørrede profilen til OGNG-prøven i oppbevaringsvolumet på 12-14 ml. Alle prøvene ble analysert ved hjelp av en Superdex200 Increase 10/300 GL kolonne. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: SDS-SIDE analyse av rhodopsin og rhodopsin/mini-Go kompleks. (A) Rhodopsin prøver renset i vaskemidler. Det smurte båndet over 50 kDa tilskrives de aggregerte rhodopsinoligomerne indusert av SDS-PAGE-prøvebufferen. (B) SEC-rensede prøver av rhodopsin / mini-Go kompleks. Rhodopsin med 1 og 2 N-glycan og mini-Go er avbildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Identifikasjon av glykosylering i rhodopsin. (A) SDS-PAGE analyse av deglycosylated rhodopsin ved hjelp av PNGase F og Endo F1. (B) LC-MS-spektra av rhodopsin uten (øvre panel) og med deglycosylation av Endo F1 (nedre panel). For å forberede rhodopsin-mini-Go-komplekset for krystallisering, valgte vi Endo F1 over PNGase F fordi Endo F1 leverte en enkelt homogen art av rhodopsin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Vaskemiddel | Arbeidskonsentrasjon (%) | Kritisk micellekonsentrasjon (%) |
| DDM (andre er i seg selv) | 0.025 | 0.0087 |
| Dm | 0.12 | 0.087 |
| Cymal-6 (andre kan være på vei mot | 0.05 | 0.028 |
| Cymal-5 (Andre) | 0.2 | 0.12 |
| C9G (andre er i 2009 | 0.5 | 0.2 |
| Lmng (andre er i verden) | 0.01 | 0.001 |
| DMNG (andre er i verden) | 0.01 | 0.0034 |
| Cymal-6NG (andre kan være på vei mot | 0.015 | Ikke tilgjengelig; bør være lavere enn 0,056 |
| Cymal-5NG (andre er i verden) | 0.02 | 0.0056 |
| OGNG (ANDRE ER I | 0.15 | 0.058 |
Tabell 1: Konsentrasjoner av buffer C-vaskemiddel.
| Tid (min) | Løsemiddel A (%) | Løsemiddel B (%) | Løsningsmiddel C (%) | Strømningshastighet (ml/min) |
| 0 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 1 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 5 | 20 | 75 | 5 | 0.6 |
| 25 | 85 | 10 | 5 | 0.6 |
| 26 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
| 30 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
Tabell 2: Kolonneelution-parametere.
Discussion
Suksessen i proteinkrystallisering er sterkt avhengig av proteinprøven, spesielt membranproteiner og deres komplekser på grunn av komplikasjonen forårsaket av vaskemidler. Denne rapporten demonstrerer vaskemiddelscreening og evaluering av prøvekvaliteten for GPCR-mini-G proteinsignalkomplekser. En rekke metoder har blitt mye brukt til å studere den biokjemiske egenskapen til membranproteiner, for eksempel termostabilitetsanalyse ved hjelp av fluorescerende fargestoffer16,17, bindende analyse for å oppdage kompleks dannelse ved å måle endringen i tryptofanfluorescenssignal18 eller resonansenergioverføring med biosensorer19. Imidlertid er de kjemiske miljøene som brukes i disse metodene ganske forskjellige fra de for å forberede en krystalliseringsprøve, enten proteiner er på tusen ganger lavere konsentrasjon for fluorescensbasert måling, eller proteiner er innebygd i lipidbilag eller i en fast vaskemiddeltilstand. I denne protokollen er de brukte metodene også standardisert i storskala prøveforberedelse før krystallisering. Derfor kan de optimaliserte parametrene enkelt overføres for krystalliseringsskalaforberedelse uten ytterligere større screening og optimalisering.
Målet med denne protokollen er å optimalisere utarbeidelsen av et stabilt og homogent GPCR-mini-G proteinkompleks for dampdiffusjonkrystallisering og strukturbestemmelse ved røntgenkrystallografi. Protokollen integrerer et sett med metoder for å kvalitativt evaluere virkningen av vaskemiddel og deglykosylering under fremstilling av rhodopsin-mini-Go-komplekset. Rhodopsin ved inaktiv tilstand og lysaktivert tilstand bundet med og uten transducinpeptidet har blitt krystallisert når renset i vaskemiddelet octyl glukosid (C8G)20,,21,,22 og C9G23,24. Siden rhodopsin–mini-Go-komplekset som ble renset i C8G og C9G ikke ga krystaller (data som ikke ble vist), utforsket vi deretter et bredere spekter av andre vaskemidler ved hjelp av den beskrevne strategien (Figur 1). Ved å dra nytte av lysfølsomheten til rhodopsin, kunne vi veldig godt følge rekonstitueringen av retinal ved andre bølgelengder enn 280 nm. I både UV-VIS spektroskopi og SEC oppdaget vi retinal på enten 380 nm eller 488 nm. Imidlertid har de fleste membranproteiner ikke en så praktisk kromofor å følge funksjonalitetunder rensing. Andre alternativer ville være å gjøre en ligand påviselig ved å legge til en lys-påviselig kromofor eller ved hjelp av radioligand-bindende og termisk skift analyser25.
Rhodopsin har en molekylvekt på 40 kDa. På grunn av massen av vaskemiddel det binder, er den tilsynelatende molekylvekten på SEC ca 120 kDa. Det er dermed ingen overraskelse at bindingen av mini-Go (24 kDa) ikke lett ble oppdaget på SEC, da dette ville nødvendiggjøre differensiering av proteiner med tilsynelatende masser på 120 kDa og 144 kDa. Analyse av SEC-fraksjoner ved SDS-PAGE ble derfor brukt til å bekrefte prøverenhet og kompleks dannelse. Selv om SEC-profiler viser et klart skifte ved kompleks dannelse, anbefales det fortsatt å utføre SDS-PAGE-analyse for å bekrefte den komplekse formasjonen med korrekte bindende partnere i stedet for andre co-renset proteinforurensninger.
Både rhodopsin og mini-Go ble renset i mg mengder, noe som tillot bruk av lav følsomhet deteksjon av komplekser, som UV-VIS absorpsjon under SEC og Commassie Blue farging av SDS-PAGE geler. Der prøvene er begrenset, bør mer følsom deteksjon brukes, for eksempel en LC-renser utstyrt med en fluorescensdetektor for å spore tryptofansignaler fra proteinet (280 nm eksitasjon, 350 nm utslipp) og sølvfarging for SDS-PAGE geler. En annen tilnærming ville være å smelte et fluorescerende protein, for eksempel grønt fluorescensprotein (GFP) til proteinet av interesse, noe som også ville tillate deteksjon selv under proteinuttrykk26, men det bør fjernes før krystallisering.
Det er viktig å sikre at det rensede proteinet også er fritt for heterogenitet som oppstår fra variable PTMs. I saken som er beskrevet her, ble de to populasjonene av rhodopsin observert på SDS-PAGE geler karakterisert som å ha enten en eller to N-glykaner. Variabel endring av et protein vil potensielt forhindre dannelse av godt diffracting krystaller, så vi derfor deglycosylated rhodopsin. Endoglycosidase Endo F1 var den mest effekt endoglycosidase testet og behandling førte til en enkelt art av unglykosylert reseptor, mens PNGase F bare delvis fjernet glykaner på rhodopsin og resulterte i en blanding av rhodopsin fullt unglycosylated eller med en N-glycan forble. Rhodopsin uten deglycosylase behandling har blitt vellykket krystallisert3,27,28, og N-glycan på rhodopsin Asn15 er viktig å danne krystallkontakt i disse tilfellene. I tilfelle av rhodopsin-mini-Go, er det nødvendig å fjerne N-glykaner av Endo F1 for å få krystaller. Det er ingen standardisert regel for å deglykolate proteiner av interesse før krystallisering, men fjerning av heterogene PTMs bør vurderes når proteiner ikke klarer å krystallisere etter omfattende krystalliseringsstudier.
Dataene og metodikken som er beskrevet her, førte oss til å velge OGNG som det mest foretrukne vaskemiddelet for krystallisering av rhodopsin-mini-Go-komplekset på grunn av sin lille micellestørrelse og dens evne til å stabilisere komplekset. Vi brukte også Endo F1 for å sikre at renset rhodopsin var en homogen art. Krystaller ble senere oppnådd, og vi bestemte krystallstrukturen til ~ 3.1 Å4, som bare var den tredje krystallstrukturen til et GPCR-G proteinsignalkompleks14,29.
For membranproteiner bundet med og uten partnerprotein, bør de betraktes som to forskjellige proteiner. Et protein ved forskjellige funksjonelle tilstander har forskjellige konformasjoner og er på forskjellig energinivå. Derfor anbefales det å optimalisere klargjøringsprotokollen for hver funksjonstilstand, da parameteren for inaktiv tilstand kanskje ikke kan overføres helt til aktivert tilstand. Også for ikke å nevne endringen i proteinegenskapen komplisert ved å binde et partnerprotein. Protokollen bruker metoder som er standardisert for å forberede en krystalliseringsprøve for å forberede inaktivt membranprotein i forskjellige vaskemidler, etterfulgt av proteinaktivering og kompleks dannelse, og for å karakterisere proteinkvalitet. Dermed kan denne protokollen lett generaliseres til andre membranproteiner og deres komplekser for strukturelle studier med mindre modifikasjon.
Disclosures
CGT er konsulent og medlem av Scientific Advisory Board of Sosei Heptares. Alle de andre forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker prof. Dr. Gebhard F. X. Schertler for hans langsiktige støtte i dette prosjektet, Dr. Roger J.P. Dawson og Hoffmann La Roche for støtte i cellekultur. Dette arbeidet ble sponset av Swiss National Science Foundation (tilskudd 210030_153145 og 310030B_173335 til GFXS), og finansiering til CGT fra European Research Council (EMPSI, 339995) og Medical Research Council (MRC U105197215). FP anerkjenner ETH Zürich gjennom National Center of Competence in Research Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) og ETH Femtosecond og Attosecond Science and Technology (ETH FAST) programmer. FP, JM, AB og CJT anerkjenner langsiktig økonomisk støtte fra Paul Scherrer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
| 9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
| C9G | Anatrace | N324 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
| Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
| Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
| Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
| Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
| DDM | Anatrace | D310 | |
| DM | Anatrace | D322 | |
| DMNG | Anatrace | NG322 | |
| Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
| Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
| FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
| HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | - | |
| LMNG | Anatrace | NG310 | |
| Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
| Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
| NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
| OGNG | Anatrace | NG311 | |
| PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
| Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
| Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
| Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
| ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
| UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
| Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | - |
References
- Tate, C. G. Practical considerations of membrane protein instability during purification and crystallisation. Methods in Molecular Biology. 601, Clifton, N.J. 187-203 (2010).
- Lebon, G., Bennett, K., Jazayeri, A., Tate, C. G. Thermostabilisation of an agonist-bound conformation of the human adenosine A(2A) receptor. Journal of Molecular Biology. 409 (3), 298-310 (2011).
- Deupi, X., et al. Stabilized G protein binding site in the structure of constitutively active metarhodopsin-II. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (1), 119-124 (2012).
- Tsai, C. -J., et al. Crystal structure of rhodopsin in complex with a mini-G o sheds light on the principles of G protein selectivity. Science Advances. 4 (9), (2018).
- Carpenter, B., Tate, C. G. Engineering a minimal G protein to facilitate crystallisation of G protein-coupled receptors in their active conformation. Protein Engineering Design and Selection. 29 (12), 583-594 (2016).
- Chae, P. S., et al. Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nature Methods. 7 (12), 1003-1008 (2010).
- Loll, P. J. Membrane proteins, detergents and crystals: what is the state of the art. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (12), 1576-1583 (2014).
- Chae, P. S., et al. Glucose-neopentyl glycol (GNG) amphiphiles for membrane protein study. Chemical communications. 49 (23), Cambridge, England. 2287-2289 (2013).
- Standfuss, J., Xie, G., Edwards, P. C., Burghammer, M., Oprian, D. D., Schertler, G. F. X. Crystal structure of a thermally stable rhodopsin mutant. Journal of Molecular Biology. 372 (5), 1179-1188 (2007).
- Kaushal, S., Ridge, K. D., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: the role of asparagine-linked glycosylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (9), 4024-4028 (1994).
- Molday, L. L., Molday, R. S. 1D4: a versatile epitope tag for the purification and characterization of expressed membrane and soluble proteins. Methods in Molecular Biology. 1177 (604), Clifton, N.J. 1-15 (2014).
- Carpenter, B., Tate, C. G. Expression and Purification of Mini G Proteins from Escherichia coli. Bio-Protocol. 7 (8), (2017).
- Grueninger-Leitch, F., D'Arcy, A., D'Arcy, B., Chène, C. Deglycosylation of proteins for crystallization using recombinant fusion protein glycosidases. Protein Science. 5 (12), 2617-2622 (1996).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Loginova, M. Y., Rostovtseva, Y. V., Feldman, T. B., Ostrovsky, M. A. Light damaging action of all-trans-retinal and its derivatives on rhodopsin molecules in the photoreceptor membrane. Biochemistry (Moscow). 73 (2), 130-138 (2008).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking Membrane Protein Detergent Stability for Improving Throughput of High-Resolution X-ray Structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Maeda, S., et al. Crystallization scale preparation of a stable GPCR signaling complex between constitutively active rhodopsin and G-protein. PloS One. 9 (6), 98714 (2014).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
- Singhal, A., Guo, Y., Matkovic, M., Schertler, G., Deupi, X., Yan, E. C. Y. Structural role of the T 94 I rhodopsin mutation in congenital stationary night blindness. EMBO Report. 17 (10), 1-10 (2016).
- Choe, H. -W., et al. Crystal structure of metarhodopsin II. Nature. 471 (7340), 651-655 (2011).
- Mattle, D., et al. Ligand channel in pharmacologically stabilized rhodopsin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3640-3645 (2018).
- Okada, T., Fujiyoshi, Y., Silow, M., Navarro, J., Landau, E. M., Shichida, Y. Functional role of internal water molecules in rhodopsin revealed by X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 5982-5987 (2002).
- Blankenship, E., Vahedi-Faridi, A., Lodowski, D. T. The High-Resolution Structure of Activated Opsin Reveals a Conserved Solvent Network in the Transmembrane Region Essential for Activation. Structure. 23 (12), 2358-2364 (2015).
- Magnani, F., et al. A mutagenesis and screening strategy to generate optimally thermostabilized membrane proteins for structural studies. Nature Protocols. 11 (8), 1554-1571 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), London, England: 1993 673-681 (2006).
- Standfuss, J., et al. The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin. Nature. 471 (7340), 656-660 (2011).
- Singhal, A., et al. Insights into congenital stationary night blindness based on the structure of G90D rhodopsin. EMBO reports. 14 (6), 520-526 (2013).
- Carpenter, B., Nehmé, R., Warne, T., Leslie, A. G. W., Tate, C. G. Structure of the adenosine A(2A) receptor bound to an engineered G protein. Nature. 536 (7614), 104-107 (2016).
