Summary
Qui descriviamo i metodi usando la microscopia a contrasto temporale e a contrasto di fase per immagini di macrofagi peritoneici residenti nel gradiente C5a di complemento chemiotattico. I protocolli possono essere estesi ad altre cellule immunitarie.
Abstract
La chemiotassi è una guida mediata dal recettore delle cellule lungo un gradiente chimico, mentre la chemiocinesi è la stimolazione della motilità cellulare casuale da parte di una sostanza chimica. La chemiocinesi e la chemiotassi sono fondamentali per la mobilitazione e l'impiego di cellule immunitarie. Ad esempio, le chemiochine (citochine chemiotattiche) possono reclutare rapidamente neutrofili circolanti e monociti in siti extravascolari di infiammazione. I recettori chemoattraenti appartengono alla grande famiglia di recettori accoppiati a proteine G. Il modo in cui i gradienti chemoattraenti (cioè ligando) la migrazione diretta delle cellule tramite la segnalazione del recettore accoppiato con proteina G non è ancora completamente compreso. Nel campo dell'immunologia, i neutrofili sono cellule modello popolari per lo studio della chemiotassi in vitro. Qui descriviamo un saggio di chemiotassia bidimensionale (2D) in tempo reale su misura per i macrofagi residenti nei topi, che sono stati tradizionalmente più difficili da studiare. I macrofagi si muovono a un ritmo lento di 1 m/min su una superficie 2D e sono meno adatti per i saggi di migrazione point-source (ad esempio, la migrazione verso la punta di una micropipetta piena di chemoattractant) rispetto ai neutrofili o al dictyostelium discoideum, che spostano un ordine di grandezza più velocemente. I saggi Transwell ampiamente utilizzati sono utili per studiare l'attività chemiotattica di diverse sostanze, ma non forniscono informazioni sulla morfologia cellulare, la velocità o la navigazione chemiotattica. Qui descriviamo un saggio di chemiotassico a base di microscopia a tempo che permette la quantificazione della velocità cellulare e l'efficienza chemiotattica e fornisce una piattaforma per delineare i trasduttori, i percorsi di segnale e gli efazionisti della chemiotassi.
Introduction
Le cellule immunitarie in genere migrano su una superficie 2D in modo ameboide1,2, che comporta cicli ripetuti di protrusione della parte anteriore, adesione cellulare mediata dall'integrina e retrazione della parte posteriore. Un passaggio preliminare è la polarizzazione cellulare, in cui le cellule formano le estremità anteriori e posteriori3. La chemiotassila inizia con il rilevamento di chemioattraenti da parte dei recettori accoppiati alle proteine G e da una complessa rete di segnalazione mediata da proteine G eterotrimerici a membrana e piccole proteine G monomericche, nonché fattori di scambio nucleotide dei nucleotidi del guanino legati al fosfolipidide (GEF)4,5. L'attivazione di Rho GTPases delle sottofamiglie Cdc42 e Rac inducono sporche nella parte anteriore6 e i membri della sottofamiglia Rho, in particolare RhoA, attivano la contrazione del posteriore5,7. In un ambiente tridimensionale (3D), le integrine sono in gran parte ridondanti per la migrazione del leucocito e RhoA diventa più importante per spremere le cellule attraverso passaggi stretti8, mentre l'attivazione Arp2/3 indotta da Cdc42 o Rac rimane importante per lo sterzo chemiotattico9,10.
Le cellule immunitarie possono affrontare diversi chemioattraenti, soprattutto nelle impostazioni di lesioni tissutali, invasione di agenti patogeni e infiammazione. I chemiodoni endogeni espressi sui fagociti completano C3a e C5a, sono rapidamente generati dall'attivazione della cascata di complemento e sono riconosciuti dai recettori C3a e C5a. Allo stesso modo, le cellule necrotiche reclutano fagociti tramite recettori di peptidi formyl, che riconoscono i mitocondri derivati e i batteri derivati dai peptidi11. Le cellule immunitarie esprimono anche i recettori accoppiati alle proteine G per le chemiochine, una grande famiglia di peptidi chemoattraenti coinvolti nella regolazione del traffico di cellule immunitarie durante l'omeostasi e l'infiammazione. Le chemiochine sono classificate in quattro gruppi a seconda della spaziatura dei primi due residui di cisteina (C): citochine C, CC, CXC e CX3C, dove X è un amminoacido. Pertanto, le cellule immunitarie in vivo devono rispondere in modo appropriato a segnali spaziali e temporali altamente complessi, rendendo lo studio della chemotaxis un compito scoraggiante. Qui di seguito forniamo una breve storia di chemiotassi, che ha iniziato con approcci di imaging intravitale.
Lo studio del leukocito chemiotassi risale al 188812, quando l'oftalmologo Theodor Karl Gustav Leber descrisse chiaramente la migrazione diretta dei leucociti e l'accumulo in siti di infiammazione in un modello di cheratite micotica (fungina). Leber ha sottolineato che l'attrazione di leucociti in eccesso da sostanze derivate da agenti patogeni è importante per l'eliminazione di microrganismi nocivi tramite la fagocitosi, che era stata descritta da Metchnikoff (noto anche come Metschnikoff) all'inizio dello stesso decennio13. Negli anni '20 Clark e Clark14,15,che hanno approfittato della trasparenza dei girini e hanno dimostrato che l'infiammazione sterile indotta dall'olio di croton14 o da altri irritanti15 ha causato l'aderenza dei leucociti ai vasi sanguigni, seguita dalla diapedesi (migrazione transettheliale) e dalla rapida migrazione attraverso gli spazi di tessuto verso l'irritante. Gli esperimenti in vitro con il metodo di microfotografia sviluppato da Jean Comandon16 hanno mostrato che i leucociti migravano verso una fonte chemoattractante di particolato come i batteri17. A quel tempo, le identità molecolari dei fattori chemiotattici erano sconosciute. Negli anni sessanta, Stephen Boyden18 riconobbe che mancavano le tecniche per studiare l'attività chemiotattica delle sostanze solubili. Ha ideato una camera, successivamente conosciuta come la camera di Boyden, con due compartimenti separati da una membrana di carta filtrante. Una sospensione cellulare viene aggiunta al vano superiore e la sostanza di prova viene aggiunta a entrambi i compartimenti o solo al compartimento inferiore. Dopo un periodo di incubazione, la membrana del filtro viene rimossa e le cellule vengono fissate e macchiate. Confrontando quante cellule migrano attraverso la membrana del filtro verso il pozzo inferiore con la sostanza di prova in entrambi i compartimenti, in entrambi i compartimenti, o solo nel compartimento inferiore, è possibile determinare l'attività chemiotattica. I saggi transwell sono ancora popolari oggi e sono stati modificati in vari modi, tra cui l'uso di diverse membrane di policarbonato con dimensioni e densità dei pori definiti19,20. Uno dei principali svantaggi dei saggi Transwell è che non è pratico visualizzare direttamente le cellule che migrano e il percorso di migrazione attraverso la membrana in genere non supera il diametro di una cellula immunitaria.
Sally H. zoggil ha sviluppato una camera chemiotassista21 che ha permesso la visualizzazione sia della formazione di gradienti che della morfologia cellulare utilizzando coloranti fluorescenti. La camera è costituita da uno scivolo in plexiglass (acrilico) con due pozzetti lineari paralleli, ciascuno con un volume di 100 dollari l, separato da un ponte largo 1 mm 3-10 m sotto il piano superiore del vetrino. Un seme di coverslip con cellule viene invertito e posto sul vetrino in modo che si estende sui due pozzi. Dopo l'aggiunta di una chemioattractant a uno dei pozzi, una ripida sfumatura chemioculante si forma attraverso il ponte, tipicamente entro 30-90 m. leucociti polimorfonucleari (granulociti) nella camera di zigzago sono osservati orientarsi verso il chemioattraente. Sono state segnalate variazioni della camera di zigmond, tra cui le camere Dunn22 e Insall23, entrambe utilizzate una vessità di copertura con celle posizionate su due pozzi separati da un ponte largo 1 mm. La camera Dunn è costituita da pozzi concentrici separati da un ponte circolare, mentre la camera Insall è più strettamente correlata alla camera di zigzag, ma fornisce ponti di due diverse larghezze, 0,5 mm e 1 mm. Una nuova camera di chemiotassi, chiamata Chemotassi di scivolata e prodotta mediante stampaggio24a iniezione di plastica, è stata descritta da . La camera chemiotaxis è costituita da due serbatoi da 40 litri separati da un canale largo 1 mm con una lunghezza di 2 mm e un'altezza di 70 m. Il fondo della camera è formato da un foglio di plastica sottile e permeabile a gas con lo stesso spessore e le proprietà ottiche di una copertura di vetro n. 1.524. Qui descriviamo un saggio chemiotassico usando la camera chemiotassis a z-Slide per visualizzare la migrazione dei macrofagi peritoneali residenti del mouse fino a 14 h in un gradiente chemiotattico (complemento C5a).
Protocol
I protocolli seguono le linee guida del nostro comitato etico locale per la ricerca, così come le linee guida per la cura degli animali.
NOTA: la figura 1 mostra un flusso di lavoro dell'angente chemiotassi.
1. Prefilling Chemotaxis Diapositive
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Precompilare i canali di collegamento lunghi 1 mm e 2 mm di uno o due vetrini chemiotaxi utilizzando il mezzo MODIFICATO RPMI 1640 HEPES medio, costituito da bicarbonato di libero RPMI 1640 mezzo contenente 20 mM 4-(2-idrossistina)-1-piperazinethanethanesulnic acid (HE PES, 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e antibiotici come la penicillina (100 U/mL) e la streptomicina (100 g/mL), preparati diluindo 100x penicillina/streptomicina, e 1 lipopolissaccharide (da E. coli) e un recettore a pedaggio 4 ligando utilizzato per attivare le celle.
- Collocare una diapositiva chemiotaxis (Figura 2A) in un piatto di coltura cellulare rotondo (10 cm di diametro), entrambi preriscaldati a 37 gradi centigradi, e impostare il piatto su un blocco di alluminio riscaldato (37 gradi centigradi). Inserire le spine nelle porte 1 e 4 (Figura 2B).
NOT: Un blocco di alluminio mantenuto a 37 gradi centigradi e posto all'interno del cofano di flusso laminare è utile per la preparazione di camere di chemiotassi. Idealmente, il blocco riscaldato dovrebbe fornire un'area di lavoro piatta e pozzi per vari tubi, come tubi da 50 mL e tubi di microcentrifuga da 2 mL. - Utilizzando una punta di pipetta 10–200 - L con una punta svelata, depositare 15 -L di supporto RPMI 1640 HEPES modificato nella porta di riempimento 3 (Figura 2B). Successivamente, con il volume ancora impostato a 15 , l e il pulsante di controllo della pipetta (2–20 volume) premuto, inserire la punta della pipetta nella porta 2 e aspirare 15 L ad una velocità moderatamente veloce (Figura 2B). In questo modo sarà necessario precompilare il canale di collegamento di 1 mm x 2 mm (area di osservazione), nonché i due canali di alimentazione del fianco (tra l'area di osservazione centrale e le porte 2 e 3, rispettivamente). Coprire le porte di riempimento 2 e 3 con tappi.
- Dopo il preriempimento, posizionare i vetrini chemiotaxis su un rack tenuto in una camera di umidità chiusa all'interno di un'incubatrice altrimenti asciutta e senza CO2a 37 gradi centigradi.
NOT: È importante utilizzare la punta corretta pipetta per riempire la diapositiva chemiotaxis. Una punta di pipetta svelata si intacca nella parte superiore della porta di riempimento, mentre le punte di pipetta appuntite comunemente utilizzate possono essere inserite più profondamente nella porta di riempimento e possono aumentare notevolmente la resistenza al flusso del fluido.
- Collocare una diapositiva chemiotaxis (Figura 2A) in un piatto di coltura cellulare rotondo (10 cm di diametro), entrambi preriscaldati a 37 gradi centigradi, e impostare il piatto su un blocco di alluminio riscaldato (37 gradi centigradi). Inserire le spine nelle porte 1 e 4 (Figura 2B).
2. Isolamento dei macrofagi peritoneali residenti del mouse
- Sacrificare un topo di 3-4 mesi utilizzando un'alta concentrazione dell'isoflurano anestetico volatile (>5% nell'aria) o di anidride carbonica25, seguita da lussazione cervicale. La perdita del riflesso di raddicamento nei roditori è correlata alla perdita di coscienza negli esseri umani26. Pulire l'addome del topo con l'80% di etanolo in acqua e poi fare un'incisione cutanea di 1-2 cm di linea mediana utilizzando forbici chirurgiche con punte smussate. Sbucciare la pelle per esporre la parete addominale sottostante.
- Inserire un catetere di plastica da 24 G nella cavità peritoneale. Utilizzando una siringa di plastica da 5 mL, lavala con 2 x 4,5 ml di soluzione di sale tampone (HBSS) ghiacciata (HBSS), senza Ca2 e Mg2. Lasciare circa 0,5 mL di HBSS residua nella siringa in modo che il tessuto inavvertitamente aspirato sulla punta del catetere possa essere espulso.
- Trasferire il mezzo lavaged, tipicamente 8–8,5 mL in totale, in un tubo rotondo in polipropilene da 14 mL. Centrifugare il tubo a 300 x g per 6,5 min a temperatura ambiente.
NOT: Il tubo rotondo inferiore permette al supernatante di essere completamente decantato e riduce l'agglomerazione delle cellule. - Eliminare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule peritoneali (tipicamente 4 x 106 cellule per mouse) in 200 - L del mezzo RPMI 1640 HEPES modificato. Diluire un campione della sospensione cellulare 1:20 e utilizzare un dispositivo di conteggio, come un Neubauer migliorato camera di conteggio, per contare le celle. Successivamente, diluire la sospensione cellulare a una concentrazione finale di 10 x 106 cellule/mL e mantenere le cellule in un tubo di microcentrifuga di polipropilene rotondo da 2 mL a 37 gradi centigradi utilizzando un blocco di alluminio riscaldato (vedere NOTA nel passaggio 1.1.1).
3. Seeding di cellule peritoneali in diapositive Chemotaxis
- Dopo aver convogliato la sospensione cellulare su e giù 5x con il volume della pipetta fissato a 100 (o a metà del volume della sospensione) per ridurre l'agglomeramento, depositare delicatamente 10 L della sospensione cellulare nella porta 3 di una camera chemiotassi(Figura 2C). Posizionare la punta della pipetta nella porta 2 e disegnare lentamente la sospensione cellulare nel canale di collegamento (Figura 2C). Non appena la sospensione cellulare è stata introdotta, rimuovere le spine alle porte 1 e 4, che contribuirà ad arrestare il flusso della sospensione cellulare. Posizionare i tappi su tutte e quattro le porte di riempimento.
- Ripetere il passaggio 3.1 per tutte le camere chemiotaxis. Utilizzando un piccolo microscopio invertito e una lente obiettivo a contrasto di fase 10x, ispezionare i vetrini chemiotaxis per verificare eventuali bolle d'aria indesiderate.
- Posizionare i semi di semina chemiotaxis con cellule peritoneali in una camera di umidità a 37 gradi centigradi per 2-3 h.
4. Riempire i serbatoi e aggiungere chemoattractant
- Ispezionare l'area di osservazione (canale che collega i due serbatoi da 40 gradi) utilizzando un microscopio invertito.
NOT: In questa fase, la densità cellulare sarà superiore a quella dopo aver riempito i serbatoi, perché le cellule debolmente aderenti, prevalentemente CD19- cellule (cellule B1), saranno lavate fuori dall'area di osservazione durante la procedura di riempimento (Figura 2C–E). - Posizionare le spine nelle porte di riempimento 1 e 2 (Figura 2D). Assicurarsi che la porta di riempimento 3 sia riempita fino in cima con bolle d'aria medie e prive di bolle d'aria. Utilizzare un ago di siringa sterile da 27 G per spostare le bolle d'aria indesiderate, se necessario.
- Utilizzando una pipetta meccanica di volume da 10-100 litri, aspirare 60 dollari di supporto RPMI 1640 HEPES modificato e posizionare la punta della pipetta nella porta di riempimento 3. Utilizzare l'anello di impostazione del volume della pipetta per iniettare lentamente e costantemente il mezzo nel serbatoio in modo tale che il mezzo raggiunga la parte superiore della porta di riempimento 4 dopo 1–2 min (Figura 2D).
- Riempire il secondo serbatoio. Spostare la spina dalla porta 1 e inserirla lentamente nella porta 3 (Figura 2D). Successivamente, aspirare 50 dollari di RPMI 1640 HEPES modificato medio e posizionare la punta della pipetta nella porta di riempimento 4. Utilizzare l'anello di impostazione del volume della pipetta di volume da 10 a 1000 ll per iniettare lentamente e costantemente il supporto nel secondo serbatoio in modo che il mezzo raggiunga la parte superiore della porta di riempimento 1 dopo 1–2 min (Figura 2D).
- Posizionare 495 -L di RPMI 1640 HEPES medio modificato in un tubo di microcentrifuga (rotondo inferiore) 2 mL e aggiungere 5 L di Brevetto Blu V (soluzione di stock: 10 mg/mL in fosfato-buffered salina [PBS]), un colorante blu utilizzato come indicatore visivo della formazione del gradiente di concentrazione. Mescolare con breve vortice. Aggiungere 5,4 ll di complemento murino ricombinante C5a (soluzione di riserva: 50 g/mL in PBS con 0,1% di albumina di siero bovina) e mescolare con breve vortice.
- Deposito 15 - L di blu, complemento C5a-contenente mezzo nella porta di riempimento 1 (Figura 3A), dopo aver fatto in modo che la depressione superficiale nella parte superiore della porta è mediamente libero (altrimenti la goccia può fuoriuscire).
- Inserire una punta di pipetta da 10-200 ll nella porta di riempimento 4 e ruotare lentamente e costantemente l'anello di impostazione del volume della pipetta di volume da 10-100l per disegnare la goccia di mezzo blu contenente C5a nel serbatoio opposto (Figura 3B). L'aria inizierà a entrare nella breve colonna verticale della porta di riempimento 1. Disegnare aria fino a quando l'interfaccia fluido-aria è a metà della colonna verticale, quindi inserire lentamente una spina nella porta.
- Sollevare delicatamente la pipetta dalla porta 4, utilizzando l'altra mano per assicurarsi che il vetrino rimanga fisso in posizione. Infine, collegare lentamente la porta 4 (Figura 3B).
- Ispezionare il vetrino chemiotaxis su un microscopio invertito.
NOT: Le restanti cellule aderenti nell'area di osservazione dovrebbero essere prevalentemente macrofagi. Questo può essere confermato utilizzando anticorpi anti-F4/80 marcati fluorescentmente (F4/80 è un marcatore specifico per i macrofagi murini). Le cellule B possono essere identificate utilizzando anticorpi anti-CD19 fluorescenti e F4/80-/CD19- le cellule possono essere rilevate utilizzando una macchia di acido nucleico fluorescente blu (Figura 4).
5. Migrazione di macrofago di imaging per microscopia time-lapse, a contrasto di fase
- Posizionare uno scivolo chemiotaxis sullo stadio di un microscopio invertito dotato di un'incubatrice da palcoscenico. Mantenere la temperatura a 37 gradi centigradi.
- Immagine dell'area di osservazione di 1 mm x 2 mm utilizzando una lente obiettivo a contrasto di fase 10x e messa a fuoco sulla lamellipopodia macrofasca: sporgenze sottili e simili a lami. Cattura immagini per 14 h alla velocità di 1 fotogramma ogni 2 min.
6. Analisi delle immagini time-lapse
- Analizzare le immagini time-lapse e a contrasto di fase utilizzando il software di analisi automatica delle immagini o il plugin Manual Tracking, prodotto da Fabrice P. Cordelières, per ImageJ.
NOT: I programmi di tracciamento automatizzati possono essere utilizzati per analizzare le cellule imaged mediante microscopia a tempo, a contrasto di fase o a fluorescenza. Ad esempio, il software basato su Java iTrack4U prodotto da Cordelières et al.27 può essere utilizzato per il tracciamento e l'analisi automatizzati delle celle utilizzando immagini time-lapse, phase-contrast o fluorescence come input. Il monitoraggio manuale richiede più tempo, ma le tracce generate dal plugin ImageJ Manual Tracking possono essere importate direttamente e analizzate automaticamente dal plugin ImageJ Chemotaxis e Migration Tool28,29.
Representative Results
Nella figura 2Aè illustrato un diagramma schematico della diapositiva chemiotassiva utilizzata per la microscopia video time-lapse dei macrofagi peritoneali del mouse che eseguono la migrazione in un gradiente chemiotattico. La diapositiva contiene tre camere chemiotaxis, ognuna delle quali ha quattro porti di riempimento. Le porte possono essere chiuse singolarmente utilizzando i tappi mostrati sopra la diapositiva. In alternativa, un tappo non di sblocco può essere posizionato su una porta scollegata per mantenere la sterilità. Dopo aver collegato le porte 1 e 4, l'area di osservazione (1 mm di larghezza x 2 mm di lunghezza x 70 m di altezza che collega i due serbatoi) tra le porte 2 e 3 può essere preriempita con mezzo posizionando una goccia di 15 L nella porta 3 e aspirando con una pipetta di volume 2–20 l alla porta 2(Figura 2B). Una sospensione delle cellule peritoneali residenti nel topo (10 x 106 cellule/mL) è stata seminata nell'area di osservazione posizionando una goccia di 10 ll di sospensione nella porta 3 e aspirando lentamente alla porta 2 (Figura 2C). Un'immagine tipica delle cellule semisemeini nell'area di osservazione presa dalla microscopia a contrasto di fase utilizzando un obiettivo 10x è mostrata nella Figura 2C. Dopo l'incubazione per 2-3 h, lo scivolo chemiotaxis è stato lentamente riempito con media (Figura 2D). Dopo aver collegato le porte 1 e 2, il supporto è stato lentamente iniettato tramite la porta 3 fino a quando non è emerso dalla porta 4. Successivamente, la spina è stata commutata dalla porta 1 alla porta 3, quindi il secondo serbatoio è stato riempito lentamente con il mezzo di iniezione tramite la porta 4 fino a quando non è emerso alla porta 1. In questa fase, le cellule nell'area di osservazione sono state riesaminate utilizzando un microscopio invertito (Figura 2E). Confrontando le immagini poco prima (Figura 2C) e dopo (Figura 2E) il riempimento dei serbatoi, fino a due terzi delle cellule erano state spazzate via dall'area di osservazione. In generale, debolmente aderenti CD19- cellule (cellule B1) sono state sbiadite e le cellule rimanenti erano prevalentemente F4/80- cellule (macrofagi). Ciò è stato dimostrato dalla microscopia a fluorescenza dopo l'etichettatura di ogni tipo di cellula con anticorpi specifici etichettati fluorescentmente (Figura 4). Nella figura 4A,le cellule peritoneiche residenti del topo appena isolate erano etichettate con anticorpi anti-F4/80 fluorofori fluorogori fluorescenti verdi e i nuclei delle cellule erano etichettati con una macchia di acido fluorescente blu fluorescente. F4/80 è un marcatore specifico per i macrofagi del mouse30, mentre CD19 è un marcatore di cella B. La figura 4B mostra F4/80- cellule imaged dalla microscopia confocale a disco rotante nell'area di osservazione di una camera chemiotassi. Le cellule sono state etichettate dopo un saggio chemiotassico durante la notte registrato dalla microscopia a contrasto di tempo e di fase.
Il complemento C5a (chemoattractant) è stato introdotto in uno dei due serbatoi posizionando una caduta di 15 gradi di mezzo contenente 0,54 g/mL (mouse ricombinante) complemento C5a e 10 g/mL Patent Blue V nella porta di riempimento 1 (Figura 3A) dopo aver collegato le porte 2 e 3. Il mezzo chemioattraente è stato lentamente attirato nel serbatoio da una lenta aspirazione con una pipetta tramite la porta 4. La figura 3B mostra la diffusione del colorno blu dopo aver disegnato la goccia di 15 -L in un serbatoio. Brevetto Blu V è stato utilizzato come indicatore visivo indiretto della diffusione chemioattractante. Le molecole di C5a complementari sono notevolmente più grandi di quelle di Brevetto Blu V (9,0 kDa contro 0,57 kDa) e si diffondono più lentamente. Dopo la diffusione del complemento C5a nel serbatoio, la sua concentrazione è stata di 0,2 g/mL (15 gradi l/40 l [volume del serbatoio] x 0,54 g/mL, equivalente a 0,2 g/mL, equivalente a 22,5 nM. Un gradiente modestamente ripido si è formato in tutta l'area di osservazione dopo 3 h e ha continuato ad aumentare, raggiungendo un massimo a circa 12 h31. Figura 3C Mostra le tracce di migrazione dei macrofagi di migrazione in un gradiente C5a di complemento, tra 6-12 h dopo l'aggiunta del chemioattraente. La velocità cellulare e l'efficienza chemiotassica, indicizzate come y-FMI (indice di migrazione y-forward; intervallo: -1 a 1) e x-FMI, dei singoli macrofagi sono state calcolate dai grafici di migrazione (Figura 3D). La figura 3D mostra anche un grafico di migrazione prodotto dopo la normalizzazione del punto iniziale di ogni traccia di migrazione a X , 0 e Y , 0 al di sotto dei grafici dei box. L'elemento di insalto nel grafico di migrazione mostra come è stato calcolato y-FMI per ogni traccia di migrazione.
Figura 1: Il flusso di lavoro del saggio chemiotassi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gestione delle diapositive chemiotaxis. (A) Una vista 3D di una diapositiva chemiotaxis con quattro spine e quattro tappi. La diapositiva contiene tre camere di chemiotassi, ognuna delle quali è costituita da due serbatoi da 40 l collegati da un canale di 1 mm x 2 mm, che è alto 70 m, chiamato area di osservazione. (B) Il canale di collegamento si estende ad entrambe le estremità fino alle porte di riempimento 2 e 3. Dopo aver inserito le spine nelle porte di riempimento 1 e 4, l'area di osservazione è stata precompilata con supporto (rosso) applicando una goccia di medio alla porta 3 e aspirando alla porta 2 con una punta pipetta 10–200 LL. Successivamente, i tappi sono stati applicati alle porte 2 e 3 prima di incubare lo scivolo a 37 gradi centigradi e preparare la sospensione cellulare. (C) L'area di osservazione, in cui si è formato il gradiente chemioattraente, è stata seminata con macrofagi applicando una goccia di 10 -L di cellule peritoneali residenti nel porto 3 e lentamente aspirando alla porta 2. Lo scivolo è stato poi incubato in una camera di umidità a 37 gradi centigradi per 2-3 h. L'immagine a contrasto di fase mostrata a destra, ottenuta tramite un obiettivo 10x, mostra le cellule peritoneali dopo la semina e l'incubazione a 37 gradi centigradi per la barra della scala - 500 m. (D) le camere di Chemotassi ssonorità sono state riempite di media collegando le porte 1 e 2 e poi iniettando lentamente il mezzo tramite la porta 3 fino a quando non è emersa alla porta 4. Il riempimento lento e costante può essere ottenuto ruotando l'anello di impostazione del volume di una pipetta di volume da 20-100 . Dopo aver riempito il primo serbatoio, il secondo serbatoio può essere riempito collegando le porte 2 e 3 e quindi iniettando lentamente il mezzo alla porta 4 fino a quando non emerge alla porta 1. (E) Immagine a contrasto di fase della stessa area di osservazione mostrata sopra (C) dopo aver riempito i due serbatoi. Barra di scala - 500 m. Elementi grafici forniti da Elias Horn. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Saggio di Chemotaxis. (A) Il chemioattraente è stato introdotto in uno dei due serbatoi di una camera chemiotassista applicando una goccia di 15 l di mezzo contenente 0,54 g/mL complemento C5a e 10 g/mL Patent Blue V alla porta di riempimento 1, seguita da una lenta aspirazione alla porta 4. (B) Inizialmente dopo essere stato trascinato nel serbatoio, il mezzo blu, contenente chemoattraenti aveva una forma a goccia grossolanamente invertita, per poi diffondersi lentamente in tutto il serbatoio. (C) Tracce migratorie di macrofagi che migrano in un gradiente chemoattractante (complemento C5a) tra le 6-12 h dopo l'introduzione del chemioattraente in uno dei serbatoi. La direzione del gradiente è indicata a destra. La fine di ogni traccia di migrazione è indicata da un cerchio pieno. (D) Blox traccia di velocità, x-FMI (indice di migrazione x-forward) e y-FMI (indice di migrazione y-forward), un indice di efficienza chemiotattica che varia da -1 a 1 euro. I dati sono stati ottenuti mediante l'analisi di 25 tracce di migrazione dei macrofafi. I macrofagi nella metà inferiore dell'area di osservazione e lo spostamento di almeno una larghezza di cella superiore a 6 h sono stati selezionati in modo casuale per l'analisi. Di seguito è riportato un grafico delle tracce di migrazione dopo la normalizzazione del punto iniziale in X , 0 e Y è 0. L'indice chemiotaxis (y-FMI) è stato calcolato dividendo lo spostamento netto lungo l'asse Y (d) per la lunghezza accumulata (l) del percorso di migrazione, come mostrato schematicamente. Elementi grafici nei pannelli A e B forniti da Elias Horn. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini fluorescenti di cellule peritonei residenti del topo viventi ottenute mediante microscopia confocale a disco rotante. (A) Immagine di messa a fuoco estesa (unione di punti più brillanti di tutti i piani z) di cellule peritoneali di topo appena isolate etichettate con anticorpi anti-F4/80 (marcatore macrofalo) fluorescenti rossi e una macchia acida nucleica fluorescente blu. Barra di scala : 10 m. (B) Istantanea (singolo piano z) di F4/80: celle (macrofagi) nell'area di osservazione di una camera chemiotassica scattata dopo un'ondata di chemiotassiche durante la notte. Le cellule sono state etichettate con anticorpi anti-F4/80 fluorescenti verdi e una macchia di acido nucleico fluorescente blu. I gradienti complementari C5a e Patent Blue V sono stati lavati dalla procedura di etichettatura cellulare, il che spiega perché il serbatoio superiore nel diagramma schematico della camera chemiotassinon non è blu. Barra di scala : 10 m. Elemento grafico fornito da Elias Horn. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
L'imaging intravitale risale al XIX secolo e fornisce un mezzo per studiare il comportamento delle cellule immunitarie viventi nel loro ambiente naturale. Tuttavia, anche con le tecniche genetiche e di microscopia avanzate di oggi è difficile studiare la risposta delle cellule a specifici chemioattraenti in vivo. Per aggirare questo problema, Boyden18 sviluppò saggi Transwell negli anni '60, ma questi saggi del punto finale non fornivano la visualizzazione di come le cellule migravano effettivamente verso i chemioattraenti, rendendo difficile distinguere la chemiochina, stimolando la migrazione casuale da un segnale chimico32e chemiotassi, la migrazione verso concentrazioni più elevate di stimoli chimici da ciascuno altri33. Questo problema è stato risolto progettando varie camere aperte con un ponte, tipicamente largo 1 mm, situato tra due serbatoi e accessibile da un obiettivoobiettivo 21,22,23. L'applicazione di uno slittamento di copertura invertito, seme con cellule aderenti, chiude le camere e chemioattraente aggiunto a uno dei serbatoi si diffonde attraverso il ponte al serbatoio opposto, creando un gradiente di concentrazione. Qui descriviamo un saggio chemiotassi usando lo stesso principio ma usando una camera chiusa con quattro porte di riempimento. Utilizzando questo sistema e la microscopia a contrasto di fase, abbiamo sviluppato un saggio di immagine dei macrofagi peritonei residenti nel mouse che migrano in un complemento chemiotattico C5a gradiente31,34,35,36. Questo saggio, combinato con modelli murini knockout, si è rivelato strumentale nello studio dei ruoli di vari Rho GTPases e proteine motorie nella morfologia macrofalo, motilità e chemiotassi31,34,35,36,37. Abbiamo anche usato questo approccio per immaginare monociti del sangue periferico umano che migrano su una superficie 2D o in una matrice I di collagene 3D38. Inoltre, il saggio è adatto per macrofagi derivati dal midollo osseo del topo del topo o dai macrofagi derivati dalle cellule precursori mieloidi ordinalmente39,40. In precedenza abbiamo utilizzato sacchetti in politetrafluoroetilene (PTFE) con adattatori di luer per coltivare cellule del midollo osseo e ottenere macrofagi34. Il vantaggio dei sacchetti PTFE è che le cellule possono essere prontamente risospese e pronte per l'uso dopo aver posizionato la borsa sul ghiaccio per 20-30 min. Si noti che abbiamo precompilato l'area di osservazione della diapositiva chemotaxis prima di introdurre le cellule. Questo approccio ha il vantaggio che le bolle d'aria indesiderate possono essere successivamente scaricate (con successo variabile) e l'area di osservazione delle presocche consente la lenta introduzione di una sospensione cellulare mediante pipettaggio. Il preriempimento, tuttavia, aumenta la probabilità che il mezzo fluisca parzialmente in uno o entrambi i serbatoi di fianco, il che promuoverà la semina di cellule al di fuori dell'area di osservazione. In alternativa, la sospensione cellulare può essere convogliata direttamente in un'area di osservazione secca, ma le bolle d'aria indesiderate non possono essere successivamente espulse.
La cavità peritoneale del mouse contiene due popolazioni principali di cellule: F4/80: macrofagi e (più piccole) cellule CD19e B, con un rapporto di circa 1:2 (Figura 4A). Queste due popolazioni cellulari rappresentano oltre il 95% delle cellule della cavità peritoneale, mentre le cellule F4/80rimanenti -/CD19- di solito possono essere identificate come CD11c: cellule (cellule dendritiche) oCD3 (cellule T). Le cellule B aderenti vengono lavate fuori dall'area di osservazione durante il riempimento dei serbatoi con il mezzo (Figura 2). Dopo aver aggiunto il chemioattraente a uno dei due serbatoi, la microscopia a contrasto di fase può essere utilizzata per l'immagine delle cellule rimanenti (macrofagi) che migrano in un gradiente chemoattractante in evoluzione. La formazione del gradiente di C5a complementare nell'area di osservazione, tramite la diffusione da un serbatoio all'altro, può essere simulata utilizzando un coloranti fluorescente con un peso molecolare simile. Un buon sostituto del complemento murino ricombinante C5a (peso molecolare previsto, 9.0 kDa) è fluorescente etichettato dextran (10 kDa)31. Utilizzando la microscopia confocale, il gradiente di fluorescenza nel canale stretto (area di osservazione) che collega i due serbatoi del vetrino chemiotaxis può essere misurato a intervalli fissi e i profili di concentrazione ai diversi punti temporali possono essere tracciati24,31. Aggiungiamo regolarmente un colorante blu non fluorescente (Patent Blue V) al mezzo chemoaculante per fornire un comodo indicatore visivo di diffusione e formazione di gradienti. Entro 1 h dall'introduzione di 15 l- di blu, chemoattraente mezzo contenente in un serbatoio, il serbatoio appare uniformemente blu e, secondo le leggi di diffusione di Fick, si formerà un gradiente attraverso la stretta area di osservazione che collega i serbatoi (Figura 3B). Sono necessari diversi giorni affinché il soluto (colorante blu o chemoaattrazione) diventi distribuito uniformemente.
La microscopia a fluorescenza può essere sostituita con la microscopia a contrasto di fase, che offre vantaggi per il tracciamento automatico delle cellule, perché le cellule etichettate fluorescenti possono essere facilmente distinte dallo sfondo. Un altro vantaggio è che specifiche popolazioni di cellule immunitarie possono essere tracciate selettivamente dopo l'etichettatura dei marcatori superficiali con anticorpi fluorescenti. Abbiamo usato questo approccio per immaginare il sangue immiato umano CD14- cellule (monociti) che migrano in un fMLP chemiotattico (N-formylmethionine-leucyl-phenylanine) gradiente38. Allo stesso modo, gli anticorpi fluorescenti anti-F4/80 potrebbero essere usati per immaginare i macrofagi dei topi che migrano in un gradiente C5a di complemento chemiotattico. La fototossicità è un potenziale svantaggio dell'uso dell'imaging a fluorescenza41. Questo può essere ridotto con vari mezzi42, tra cui l'utilizzo di fluorofori eccitati con lunghezze d'onda più lunghe e l'aggiunta di antiossidanti al mezzo. In alternativa, le cellule etichettate potrebbero inizialmente essere identificate mediante microscopia a fluorescenza e successivamente immagini mediante microscopia a contrasto di fase e in caduta. Tuttavia, in pratica, le cellule che si muovono a velocità moderatamente basse, come ad esempio 1 mm/min (macrofagi) o 4 min (monociti), possono essere immagini a intermittenza dalla microscopia a fluorescenza a intervalli di minuti, che è tollerata ben38 . In precedenza abbiamo usato la microscopia a fluorescenza e la diapositiva chemiotaxis descritta qui per i saggi 3D chemiotaxis38,43. In questo caso, entrambi i serbatoi sono stati preriempiti con mezzo e 15 l. chemioattraente-contenente mezzo è stato prelevato in uno dei serbatoi immediatamente prima di pipettare lentamente celle fluorescenti etichettate in modo uniforme sospesa in mezzo contenente collagene di tipo I nell'area di osservazione. La parte difficile di questa procedura è la gestione del collagene di tipo I, che è concentrato nella soluzione acida. Il pH della soluzione di collagene deve essere neutralizzato mediante l'aggiunta di una soluzione alcalina prima di mescolare la soluzione di collagene ghiacciato con la sospensione cellulare. Il trasferimento della miscela di collagene-cellula a un'incubatrice a 37 gradi centigradi avvierà la polimerizzazione del collagene. Durante l'incubazione, il vetrino deve essere ruotato lentamente intorno al suo lungo asse in modo che le cellule rimangano distribuite uniformemente nelle direzioni dell'asse X, Y e z mentre il collagene polimerizza in un gel. Un relativo scivolo chiuso chemiotaxis adatto per i saggi chemiotassi 3D, con sei spine invece di quattro spine, è stato recentemente descritto29. Questo sistema consente di introdurre la miscela di cellule di collagene nell'area di osservazione prima di riempire in modo indipendente ciascuno dei serbatoi di fianco, perché ogni serbatoio ha due porte di riempimento, piuttosto che una singola porta.
In sintesi, descriviamo un saggio chemiotassico in tempo reale che consente la visualizzazione delle cellule che navigano in un gradiente chemiotattico per un periodo di 6 o più ore. Qui ci concentriamo sui macrofagi, che svolgono un ruolo importante nelle malattie infiammatorie, ma sono stati sottorappresentati nei saggi chemiotassi in tempo reale rispetto alle cellule in movimento più veloci come i neutrofili e il Dictyostelium amoebae.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione (HA 3271/3-2) del DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
| 10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| 405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
| C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
| ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
| Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |
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