Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het monteren van Drosophila larven om langer dan 10 uur ononderbroken time-lapse beeldvorming bij intacte levende dieren te bereiken. Deze methode kan worden gebruikt om veel biologische processen dicht bij de larve lichaam wand beeld.
Abstract
Live imaging is een waardevolle aanpak voor het onderzoeken van celbiologie vragen. De Drosophila larve is bijzonder geschikt voor in vivo levende beeldvorming omdat de larve body wall en de meeste inwendige organen transparant zijn. Echter, continue live beeldvorming van intacte Drosophila larven voor langer dan 30 min is een uitdaging, omdat het moeilijk is om niet-invasief immobilisatieimmobilizing larven voor een lange tijd. Hier presenteren we een larve montagemethode genaamd LarvaSPA die het mogelijk maakt voor continue beeldvorming van levende Drosophila larven met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie voor langer dan 10 uur. Deze methode omvat het gedeeltelijk bevestigen van larven aan de coverslip met behulp van een UV-reactieve lijm en bovendien het beperken van larve beweging met behulp van een polydimethylsiloxane (PDMS) blok. Deze methode is compatibel met larven in ontwikkelingsstadia van tweede instar tot zwervende derde instar. We tonen toepassingen van deze methode bij het bestuderen van dynamische processen van Drosophila somatosensorische neuronen, waaronder dendrietgroei en door verwondingen veroorzaakte dendrite degeneratie. Deze methode kan ook worden toegepast om vele andere cellulaire processen die gebeuren in de buurt van de larve body wall te bestuderen.
Introduction
Time-lapse live imaging is een krachtige methode voor het bestuderen van dynamische cellulaire processen. De ruimtelijke en tijdelijke informatie die door time-lapse films kan onthullen belangrijke details voor het beantwoorden van celbiologie vragen. De Drosophila larve is een populair in vivo model voor onderzoeken met behulp van live imaging, omdat de transparante carrosserie zorgt voor niet-invasieve beeldvorming van interne structuren1,2. Daarnaast zijn tal van genetische hulpmiddelen beschikbaar in Drosophila om fluorescerende label anatomische structuren en macromoleculen3. Echter, lange termijn time-lapse beeldvorming van Drosophila larven is een uitdaging. In tegenstelling tot stationaire vroege embryo's of poppen bewegen Drosophila-larven voortdurend, waardoor immobilisatie nodig is voor live beeldvorming. Effectieve manieren om levende Drosophila-larven te immobiliseren zijn het monteren in halocarbon olie met chloroform4,verdoven met behulp van isoflurane of Dichlorvos oplossing5, en comprimeren tussen de coverslip en de microscoopdia6. Hoewel sommige van deze methoden zijn gebruikt voor microscopie, geen van hen is effectief voor de lange termijn live imaging. Andere methoden werden ontwikkeld voor beeldvorming body wall neuronen in kruipende larven met behulp van conventionele confocale microscopie of licht-sheet microscopie7,8,9. Deze methoden zijn echter niet ideaal voor het monitoren van cellulaire dynamiek als gevolg van de beweging van de larven.
Er zijn nieuwe methoden ontwikkeld om langdurige time-lapse beeldvorming van Drosophila-larven te bereiken. Met behulp van een polydimethylsiloxane (PDMS) "larve chip" kunnen Drosophila larven effectief worden geïmmobiliseerd door vacuümgegenereerde zuigkracht in een gespecialiseerde microkamer zonder verdoving. Deze methode biedt echter geen hoge temporele resolutie voor celbiologiestudies en heeft strikte beperkingen op diergrootte10. Een andere methode met behulp van een verdovingsapparaat bereikte live beeldvorming van Drosophila larven op meerdere tijdpunten en is toegepast om neuromusculaire knooppunten11,12,13,14,15,16te bestuderen. Deze methode maakt echter ook geen continue beeldvorming langer dan 30 min mogelijk en vereist herhaaldelijk gebruik van desflurane, wat neurale activiteit kan remmen en het onderzochte biologische proces kan beïnvloeden17,18. Onlangs is een nieuwe methode die microfluïdeen en cryoanesthesie combineert gebruikt om larven van verschillende groottes te immobiliseren voor korte tijd (minuten)19. Deze methode vereist echter gespecialiseerde apparaten zoals een koelsysteem en langere perioden van immobilisatie vereisen herhaalde koeling van de larven.
Hier presenteren we een veelzijdige methode om Drosophila larven te immobiliseren die langer dan 10 uur compatibel is met ononderbroken time-lapse beeldvorming. Deze methode, die we "Larva Stabilization by Partial Attachment" (LarvaSPA) noemen, houdt in dat de larvecuticula wordt vastgemaakt aan een coverslip voor beeldvorming in een op maat gemaakte beeldkamer. Dit protocol beschrijft hoe de beeldkamer te maken en hoe larven te monteren in een verscheidenheid van ontwikkelingsstadia. In de LarvaSPA-methode worden de gewenste lichaamssegmenten met behulp van een UV-reactieve lijm op de coverslip aangebracht. Een PDMS-cuboïde oefent bovendien druk uit op de larven, waardoor ontsnapping wordt voorkomen. De lucht en het vocht in de beeldkamer zorgen voor het overleven van de gedeeltelijk geïmmobiliseerde larven tijdens beeldvorming. Voordelen van LarvaSPA ten opzichte van andere technieken zijn het volgende: (1) Het is de eerste methode die het mogelijk maakt voor continue live beeldvorming van intacte Drosophila larven voor uren met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie; (2) De methode kent minder beperkingen op de grootte van de larve; (3) De beeldkamer en PDMS-cuboïden kunnen tegen minimale kosten worden vervaardigd en herbruikbaar zijn.
Naast het beschrijven van de larve montage methode, bieden we verschillende voorbeelden van de toepassing ervan voor het bestuderen van dendriet ontwikkeling en dendriet degeneratie van Drosophila dendritic arborization (da) neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het maken van de beeldkamer
- Het metalen frame kan worden opgebouwd uit een aluminium blok in een typische machinewinkel. De specificaties van het frame zijn geïllustreerd in figuur 1A.
- Voor de constructie van de beeldkamer sluit u de onderkant van het metalen frame af met een lange afdekslip (22 mm x 50 mm) en UV-lijm(figuur 1A). Genees de UV-lijm met een hand-held UV-lamp.
2. PdMS-cuboïden maken
- Bereid de mal voor op PDMS-cuboïden.
- Bevestig lagen verpakkingstape aan het binnenoppervlak van een rechthoekige (80 mm x 55 mm) petrischaal of ronde celkweekplaat. Gebruik één laag (0,063 mm dik) voor tweede instar larven, 2 lagen (0,126 mm dik) voor vroege derde instar larven, of drie lagen (0,189 mm dik) voor late derde instar larven (Figuur 1B).
- Snijd de tape in stroken van specifieke breedte met een scheermesje: 1,5 mm voor de 1-laags tape en 2 mm voor 2-laags of 3-laags tape. De breedte en dikte van de strip bepalen de grootte van de larven die de uiteindelijke PDMS-cuboïde kan bevatten. Laat ten minste een 5 mm ruimte tussen de twee stroken. Verwijder de tapelagen die de ruimte bedekken (figuur 1B).
- Verwijder stof van het binnenoppervlak van de plaat met plakband. De mal is klaar voor gebruik.
- Bereid de PDMS-mix voor.
- Meng 7 g PDMS-basis en 0,7 g uithardingsmiddel (10:1 verhouding) grondig in een kleine container.
- Plaats de container minstens 15 min in een vacuümdesiccator om lucht uit het mengsel te verwijderen.
- Giet langzaam ongeveer 5,5 g PDMS-mengsel op de mal om een dikte van 1-2 mm(figuur 1B)te bereiken.
- Plaats het PDMS-mengsel gedurende ten minste 15 minuten opnieuw in de vacuümdesiccator om de resterende luchtbellen uit het mengsel te verwijderen. Breek de laatste paar bubbels met een pipet tip.
- Verhard de PDMS op een vlak oppervlak in een warmteincubator bij 65 °C gedurende 2 uur.
- Gebruik een scheermesje om de genezen PDMS los langs de rand van de mal en los te maken van de mal. Bewaar de PDMS tussen twee stukken grote plakband bij kamertemperatuur.
- Snijd de PDMS voor vroege en late derde insterlarven in 8 mm x 2 x 1 mm cuboïden (langs de stippellijnen in figuur 1B)door de groef van de tapestrip (stap 2.1.2) in het midden van de lange zijde van de cuboïde(figuur 1B,C) teplaatsen. Snijd voor tweede instar larven de cuboïde tot 8 mm x 1 mm x 1 mm.
3. Het monteren van larven voor langdurige time-lapse beeldvorming
- Bereid de bovenste coverslip voor op montage.
- Kies zes PDMS-cuboïden met groeven die overeenkomen met de grootte van de larven. Volg de aanbevolen groef en grootte van PDMS op basis van de stappen 2.1.1, 2.1.2 en 2.2.7.
- Verwijder stof van het oppervlak van de PDMS met plakband.
- Bevestig vier stukken dubbelzijdige tape (12 mm x 5 mm) op een lange coverslip (22 mm x 50 mm) voor het later bevestigen van PDMS-kuboïden. De ruimten tussen de twee stukken dubbelzijdige tape moeten dezelfde zijn als de breedte van de PDMS-groef.
- Breng een kleine druppel (~ 1,2 μL) UV-lijm aan in de groef van elke PDMS-cuboïde en voeg zes kleine druppels UV-lijm toe in de ruimte tussen de dubbelzijdige tape op de coverslip.
- Bereid de larven voor op de montage.
- Met behulp van een paar tangen, reinig de larven in water om voedsel te verwijderen uit het lichaamsoppervlak.
- Plaats schone larven op een klein stukje bevochtigd tissuepapier in een kleine (35 mm) petrischaal zonder deksel. Plaats de kleine petrischaal in een grote (60 mm) petrischaal met een stuk droog tissuepapier. Breng in een chemische kap 8-12 druppels (160-240 μL) isoflurane aan op het droge weefselpapier met behulp van een plastic overbrengende pipet en sluit het deksel van de grote petrischaal.
- Wacht 2-3 min tijdens het bewaken van de larven. Haal de larven uit de grote petrischaal zodra hun mondhaken stoppen met bewegen.
- Zet de dieren op.
- Om beeldstructuren aan de rugzijde van het dier te plaatsen, plaatst u de geïmmobiliseerde larven op de UV-lijm tussen de dubbelzijdige tape op de coverslip met de rugnageldie naar de coverslip gericht is.
- Bedek elke larve met een PDMS-blok en plaats de romp van de larve in de groef van de PDMS. Laat het hoofd en de staart van de larve buiten de PDMS-groef. Vermijd het blokkeren van de spiracles van de larve door de lijm.
- Druk op de uiteinden van het PDMS-blok op de dubbelzijdige tape zonder kracht op de groef toe te passen. Trek voorzichtig aan de staart van de larve om de nagelriem onder de PDMS plat te maken.
- Cure de UV-lijm gedurende 4 min met behulp van een hand-held UV-lamp op de hoge instelling (op ongeveer 0,07 mW/mm2).
LET OP: Bescherm de ogen met een veiligheidsbril tijdens het gebruik van de UV-lamp. - Draai de coverslip ondersteboven en herhaal stap 3.3.4.
- Bevochtig een klein stukje lenspapier (15 mm x 30 mm) met 20 μL–30 μL water. Plaats het bevochtigde lenspapier onder aan de beeldkamer(figuur 1A,D).
- Plaats de coverslip op de kamer, zodat de larven zijn geconfronteerd met de binnenkant van de kamer. Sluit beide uiteinden van de coverslip aan het metalen oppervlak met behulp van UV-lijm(figuur 1A,D). De dorsale kant van de larven is klaar voor beeldvorming onder confocale microscoop(figuur 1E).
4. Beeldvorming
- Beeldlarven met een aangewezen microscoop. Alle resultaten in dit protocol (Figuur 2, Figuur 3, Video S2, Video S3en Video S4) werden verkregen met behulp van een confocale systeem met een 40x (1.30 NA) oliedoelstelling.
5. Herstel van de beeldkamer en PDMS-cuboïden
- Verwijder na beeldvorming de olie op de bovenste coverslip met behulp van een lenspapier. Maak de bovenste coverslip los van het metalen frame door met een scheermesje in de ruimte tussen de coverslip en het metalen frame te snijden. De beeldkamer is klaar voor hergebruik.
- Maak de PDMS-cuboïden met tangen los van de bovenste coverslip. Rol de PDMS-cuboïden op plakband om lijmresten en stof te verwijderen. De PDMS-cuboïden zijn klaar voor hergebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De larve imaging kamer is opgebouwd door het lijmen van een op maat gemaakt metalen frame en twee coverslips aan elkaar. Het ontwerp van het metalen frame is gespecificeerd in figuur 1A. Drosophila larven in de kamer worden aan de bovenste coverslip met behulp van UV-lijm en PDMS-cuboïden gehecht. De groef op de PDMS-cuboïde en de dubbelzijdige tape de cuboïde is bevestigd om de ruimte te creëren om de larven vast te houden (Figuur 1B,C). De PDMS oefent ook zachte druk toe om de larve bodywall plat te maken en de larvebeweging fysiek te beperken. Ten slotte wordt een klein stukje nat lenspapier aan de onderkant van de kamer geplaatst om vocht te leveren. Deze opstelling kan Drosophila larven langer dan 10 uur immobiliseren voor continue beeldvorming. De meeste dieren leven na 10 uur en kunnen worden teruggewonnen om uit te groeien tot het popstadium. De beeldkamer biedt plaats aan maximaal negen larven tegelijk. Figuur 1D toont zes late derde instar larven gemonteerd in de kamer. De stammen van de larven worden bevestigd terwijl hun kop en staart vrij zijn om te bewegen (Figuur 1E en Video S1). Deze methode is met succes gebruikt om beeld tweede instar naar dwalenderde derde instar larven met continue hoge resolutie beeldvorming voor maximaal 15 uur. De kamer is ontworpen voor beeldvorming met behulp van rechtopstaande microscopen, maar de setup werkt ook voor omgekeerde microscopen door simpelweg de kamer om te draaien.
Hier tonen we de toepassing van LarvaSPA in het bestuderen van neuronale dendriet dynamiek en dendriet degeneratie met behulp van klasse IV da (C4 da) neuronen als een model(Figuur 2, Figuur 3, Video's S2-S4). C4 da neuronen zijn somatosensorische nociceptors gelegen op de larve body wall, waarvan de dendrieten innervate de larve epidermis1,20,21,22. C4 da dendrieten vertonen zeer dynamisch groeigedrag gedurende de larveontwikkeling, wat resulteert in volledige dekking van het lichaamsoppervlak of ruimtevullende23. C4 da neuronen zijn ook met succes gebruikt om dendrite degeneratie en regeneratie te bestuderen na lichamelijk letsel24,25,26,27.
Voor beeldvorming dendrite dynamica, larven variërend van 48 uur na het leggen van eieren (AEL) op de tweede instar tot 120 uur AEL bij zwervende derde instar werden gemonteerd in de beeldkamer voor time-lapse beeldvorming met behulp van point-scanning confocale microscopie. Time-lapse films werden genomen met een interval van 3 min om het groeigedrag van C4 da denndrites gelabeld door ppk-CD4-tdTom of UAS-CD4-tdTom aangedreven door ppk-Gal46vast te leggen . Gedurende de imaging periode (tot 12 uur), de hoge orde dendriet takken van C4 da neuronen vertoondcomplex groeigedrag, met inbegrip van uitbreiding, intrekking, takvorming, en tak eliminatie(figuur 2A-2F), met vermelding van de gezondheid van de neuronen. Onze films ook gevangen homotypic dendro-dendriet repulsions waarin dendriet tips ingetrokken na contact met andere dendrieten (Figuur 2F). Over het algemeen tonen deze resultaten aan dat time-lapse beeldvorming met LarvaSPA effectief is voor het bestuderen van neuroontwikkeling.
Om dedendrierite degeneratie beeld, gebruikten we een MaiTai laser om primaire dendrieten in de buurt van C4 da neuronale cel lichamen te verbreken. De larven werden teruggevonden en gemonteerd in de kamer voor beeldvorming vanaf 1,5 uur na letsel (AI) (Figuur 3, Video S4). De films opgenomen belangrijke gebeurtenissen tijdens dedenrite degeneratie, met inbegrip van dendriet zwelling, dendriet fragmentatie, en de klaring van dendriet puin. In hetzelfde experiment werd het larvevetlichaam ook ontworpen om Annexin V-GFP (AV-GFP) te afscheiden, een sensor die externalized fosphatidylserine (PS) op het celoppervlaklabelt 27. We hebben specifieke etikettering van de denddrieten door AV-GFP(figuur 3)waargenomen, wat suggereert dat PS werd blootgesteld op het oppervlak van dendrieten om te dienen als een eet-me signaal voor latere klaring door phagocytose27.
Figuur 1: De beeldkamer voor LarvaSPA montage. (A) Diagrammen van de beeldkamer met gedetailleerde specificaties, met zowel de bovenste weergave als het zijaanzicht. De lichtblauwe arcering in de bovenste weergave geeft het bevochtigde lenspapier aan. De kamer is verzegeld door een top coverslip en een onderste coverslip. De positie van een gemonteerde larve wordt geïllustreerd. (B) Diagrammen van de PDMS mal (de bovenste weergave) en de mal na het vullen met het PDMS mengsel (zijaanzicht). Stroken in grijs geven respectievelijk twee 1-laags, twee 2-laags en twee 3-laags tapestrips aan. De gele arcering in de zijaanzicht geeft het PDMS-mengsel in de mal aan. De stippellijnen geven aan waar de uitgeharde PDMS moeten worden gesneden. De zijaanzicht van het diagram wordt niet op schaal getekend. (C) Foto's met een bovenzicht en een zijaanzicht van een PDMS-cuboïde. Schaalbalk = 1 mm. (D) Foto's met een beeldkamer voor montage, en een beeldkamer met zes geïmmobiliseerde laatderde instar Drosophila larven gemonteerd dorsale kant omhoog. Schaalbalk = 10 mm. (E) Een nadere weergave van een larve in (D). Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Time-lapse beeldvorming van dedenritdynamiek. (A-F) Geselecteerde frames uit time-lapse films van klasse IV da neuron dendrieten op specifieke tijdpunten na het begin van de beeldvorming. Beelden van de larven werden genomen 48 uur AEL (A en F), 72 h AEL (B), 96 h AEL (C), en 120 uur AEL (D). De neuronen zijn gelabeld door ppk>CD4-tdTom (A, D, Een F) of ppk >CD4-tdTom (B en C). Blauwe pijlen geven dendrite intrekkingen in vergelijking met het vorige tijdspunt. Gele pijlen geven dendrite extensies in vergelijking met het vorige tijdpunt. (E) Dendrite morfologie aan het einde van 12 uur van beeldvorming. (F) Opeenvolgende frames met 3 minuten intervallen in een film illustreren hoe een dendriet tak in een tweede instar larve uitgebreid (gele pijlen) en vervolgens ingetrokken (blauwe pijlen) nadat het contact gemaakt met een andere dendriet. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Time-lapse beeldvorming van dendrite degeneratie en blootstelling van een eet-me signaal. Geselecteerde frames uit een time-lapse film van dendrites van een klasse IV da neuron na laserblessure. Dendrites werden gelabeld door ppk>CD4-tdTom. Het eet-me signaal PS op dendrites degenereren werd gedetecteerd door Annexin-GFP (AV-GFP), die wordt uitgescheiden door het vetlichaam. Gele pijlen wijzen naar de takken met AV-GFP-etikettering. Blauwe pijlen wijzen op dendrieten die fragmentatie ondergaan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video S1: Een derde instar larve is geïmmobiliseerd in de inkeping van een PDMS cuboid. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video S2: Dendrites breiden zich uit en trekken zich dynamisch terug in een tweede sterlarve. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video S3: Dendrites breiden zich uit en trekken zich dynamisch terug in een zwervende derde instar larve. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video S4: Dendrites ontaarden en ontmaskeren fosphatidylserine na laserblessure in een derde sterlarve. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we LarvaSPA, een veelzijdige methode om levende Drosophila larven te monteren voor langdurige time-lapse beeldvorming. Deze methode vereist geen herstellende of opnieuw monterende larven, waardoor ononderbroken beeldvorming mogelijk is. Het is daarom ideaal voor het bijhouden van biologische processen die uren in beslag nemen, zoals dedenrite degeneratie en regeneratie. Deze methode kan ook worden gebruikt voor beeldvorming intracellulaire calciumdynamica en subcellulaire gebeurtenissen zoals microtubuli groei. Aangezien de larve body wall stabiel is tijdens de beeldvorming, kan de ruimtelijke en temporele resolutie worden aangepast aan de beeldvormingstoepassing bij de hand (bijvoorbeeld om snelle subcellulaire blaasbeweging te volgen of om langzame globale veranderingen van neuronale takpatronen te volgen). Bovendien is deze methode compatibel met larven in verschillende ontwikkelingsstadia en vereist geen speciale apparatuur. Zo kan LarvaSPA mogelijk door veel Drosophila-laboratoria worden gebruikt om uiteenlopende vragen aan te pakken.
Factoren die het succes van de methode beïnvloeden, waaronder de aard van de PDMS-cuboïde en het ontwikkelingsstadium van de larven
De grootte van de PDMS-cuboïde en de diepte van de groef moeten overeenkomen met de grootte van de larven. Een PDMS-cuboïde die te breed is voor de larven kan het hoofd en de staart bedekken en hypoxie veroorzaken. Een smalle PDMS-cuboïde kan echter niet effectief zijn om te voorkomen dat de larven bewegen. Een te diepe groef zou ook niet genoeg druk genereren om de beweging van de larven te beperken. Een te ondiepe groef zou niet genoeg lijm bevatten om de larven aan de coverslip te hechten. Op basis van onze ervaring worden de volgende afmetingen van de PDMS en de groef aanbevolen voor verschillende stadia van larven: 8 mm x 1 mm x 1 mm PDMS-cuboïden met 1,5 mm x 1 mm x 0,063 mm groeven voor tweede instar larven (~ 48 h AEL); 8 mm x 2 mm PDMS-cuboïden met 2 mm x 2 mm x 0,126 mm groeven voor vroege derde instar larven (~72 h AEL); 8 mm x 2 mm PDMS-cuboïden met 2 mm x 2 mm x 0,189 mm groeven voor laatderde instar larven (~96 h AEL of ouder).
Zwervende derde instar larven (op of ouder dan 120 uur AEL) bewegen minder in vergelijking met jongere en vereisen minder vocht om te overleven eenmaal gemonteerd in de kamer. Ze hebben ook een dikkere cuticula en kunnen verdragen meer fysieke stress. Daarom hebben experimenten met zwervende derde instar larven het hoogste slagingspercentage. In onze handen overleefde meer dan 80% van de zwervende derde instar larven en bleef 12 uur na montage onbeweeglijk. Om te voorkomen dat larven verpoppen tijdens beeldvorming, raden we aan om de larven tussen 96 uur en 120 uur AEL te monteren. Jongere derde instar larven hebben een grotere kans op ontsnapping of dood tijdens beeldvorming. Typisch, ten minste 2 van de 6 jonge derde instar larven gemonteerd in dezelfde kamer zou overleven en blijven onbeweeglijk 10 uur na montage. Onze ervaring met tweede instar larven is beperkt en de overlevingskans is moeilijk in te schatten. Toch hebben we met succes tweede instar larven voor 7 uur met behulp van deze methode.
Mogelijke zorgen van beeldvorming op lange termijn
Hoewel LarvaSPA is zeer nuttig voor beeldvorming dendriet groei dynamiek en degeneratie, zijn er een paar potentiële kanttekeningen te overwegen. Ten eerste, in onze huidige methode, worden de larven beroofd van voedsel voor de gehele duur van beeldvorming, wat kan leiden tot honger-geïnduceerde reacties in veel weefsels. We hebben de vorming van korrelige structuren in epidermale cellen rond 10 uur na montage waargenomen, wat het gevolg kan zijn van autofagie. Daarom moeten de resultaten verkregen in de eerste paar uur van beeldvorming meer fysiologisch relevant zijn. Resultaten over langere tijdschalen vereisen een voorzichtigere interpretatie. Om deze bezorgdheid te minimaliseren, kan onze procedure mogelijk worden aangepast om larvenvoeding mogelijk te maken. Ten tweede kan onze methode interfereren met de snelle groei van jongere larven als gevolg van de fysieke beperking en het gebrek aan inname van voedingsstoffen. Dit probleem is echter mogelijk niet van toepassing op oudere dieren. Bijvoorbeeld, zwervenderde derde instar larven kunnen veranderen in poppen, zelfs na 12 uur van continue beeldvorming, waardoor deze methode ideaal is voor onderzoeken van vroege metamorfose. Ten derde, beeldvorming van diepere structuren zoals het vet lichaam en de darm presenteert een aantal uitdagingen. Een belangrijke reden is dat diepere weefsels vaak bewegen tijdens beeldvorming en daarom bewegingscorrectie vereisen bij nabewerking. Bovendien kunnen mismatches van brekingsindexen in het lichtpad sferische aberratie veroorzaken bij het imagingen van diepere weefsels. Terwijl oliedoelstellingen geschikt zijn voor beeldvorming da neuronen omdat hun dendrieten zijn binnen 15 μm van het lichaamsoppervlak, water onderdompeling doelstellingen kunnen betere keuzes zijn om refractieve-index mismatches voor beeldvorming dieper in de larven te corrigeren. Ten vierde, omdat C4 da neuronen kunnen worden geactiveerd door UV-licht28,met behulp van UV-licht tijdens de larve montage kan potentieel veranderen C4 da neuron fysiologie. Hoewel de lichtintensiteit die we aanbevelen ver onder de niveaus ligt die C4da neuronen28robuust activeren, moeten resultaten met betrekking tot C4da neuronale activiteit voorzichtig worden geïnterpreteerd. De UV-lijm is gebruikt voor beeldvorming van een breed scala aan biologische monsters29,30,31 en veroorzaakt geen duidelijke toxiciteit voor de larven in onze handen. Ten slotte moet men overwegen de juiste microscoop setup voor in vivo live imaging. Resonantiescanners en draaiende schijfconfocale microscopen zijn bijvoorbeeld betere opties voor langdurige live beeldvorming omdat ze minder fototoxiciteit en fotobleken veroorzaken; multi-foton microscopie is effectiever voor het beeldvorming van diepere interne structuren in de larven; beeldvorming op lange termijn kan vatbaar zijn voor monster- of focusdrifting, wat mogelijk kan worden gecorrigeerd door verwerking na beeldvorming.
De meest voorkomende oorzaken van falen voor LarvaSPA en de aanbevolen oplossingen om ze aan te pakken
- Larven bewegen te veel of ontsnappen: Twee veel voorkomende redenen kunnen bijdragen aan dit probleem. De eerste is dat de PDMS groef te ondiep of te diep kan zijn voor de larven. Het proberen van een andere PDMS cuboid met een andere groefdiepte kan het probleem oplossen. De tweede reden is dat er te veel vocht in de kamer zit, waardoor de UV-lijm verzwakt. Het verminderen van het volume van het water toegevoegd aan de lens papier in de kamer kan helpen immobiliseren van de larven. Probeer bovendien alleen de segmenten van de PDMS-cuboïde in beeld te brengen, omdat de kop en de staart vrij zijn om te bewegen.
- Larven sterven tijdens beeldvorming: Als een larve kort na beeldvorming sterft, is het waarschijnlijk dat het werd blootgesteld aan te veel verdoving. Goed verdoofde larven moeten wakker worden na montage en tonen bewegingen, waaronder mondhaakverlenging en intrekking en samentrekking van het rugvat. Om dit probleem op te lossen, kan minder isoflurane worden gebruikt om larven te verdoven. Breng een larve uit de anesthesie petrischaal onmiddellijk na de mond haak stopt met bewegen. Als de larve sterft ongeveer een uur na beeldvorming, het is meestal als gevolg van uitdroging. Vergeet niet om een stuk bevochtigd lenspapier in de beeldkamer te plaatsen voordat u wordt afgesloten. Een andere veel voorkomende reden van letaliteit is dat de UV-lijm de spiracles blokkeert. Probeer UV-lijm te beperken tot de middelste segmenten van de larve en vermijd het bedekken van het hoofd en de staart. Een overdreven brede PDMS-cuboïde kan er ook gemakkelijk voor zorgen dat de UV-lijm de spiracles blokkeert.
- Plooien op de lichaamswand interfereren met beeldvorming: Om te voorkomen dat het genereren van plooien tijdens de montage, is het belangrijk om volledig te immobiliseren de larven tijdens de anesthesie stap. Wanneer een larve verlamd is, is het gemakkelijker om het lichaam recht te trekken en te strekken. Voor dieren ouder dan 96 uur AEL, voorzichtig slepen van de staarten voor het genezen van de UV-lijm kan effectief verminderen plooivorming. Het slepen van de staarten van jonge larven wordt niet aanbevolen omdat hun lichaamswanden kwetsbaar zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Wij danken Lingfeng Tang voor het opzetten van een eerdere versie van de LarvaSPA methode; Glenn Swan bij Cornell Olin Hall Machine shop voor het maken van eerdere prototypes van de imaging kamer; Philipp Isermann voor het bouwen van metalen frames en het geven van suggesties over het maken van PDMS-cuboïden; Cornell BRC Imaging faciliteit voor toegang tot microscopen (gefinancierd door NIH subsidie S10OD018516); Maria Sapar voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Cornell Fellowship toegekend aan H.J.; een Cornell start-up fonds en NIH subsidies (R01NS099125 en R21OD023824) toegekend aan C.H. H.J. en C.H. bedacht het project en ontwierp de experimenten. H.J. voerde de experimenten uit. H.J. en C.H. schreven het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
