Summary
Hier beschrijven we een protocol om de faryngeale boogslagaders 3, 4 en 6 muisembryo's te visualiseren en te analyseren met behulp van immunofluorescentie, weefselclearing, confocale microscopie en 3D-reconstructie.
Abstract
Onjuiste vorming of remodelleren van de faryngeale boogslagaders (PAA's) 3, 4 en 6 dragen bij aan enkele van de meest ernstige vormen van aangeboren hart-en vaatziekten. Om de vorming van PAA's te bestuderen, ontwikkelden we een protocol met behulp van immunofluorescentie van de hele berg in combinatie met benzylalcohol/benzylbenzoaat (BABB) weefselclearing en confocale microscopie. Dit maakt de visualisatie van de faryngeale boog endotheel op een fijne cellulaire resolutie evenals de 3D-connectiviteit van de vasculatuur. Met behulp van software hebben we een protocol opgesteld om het aantal endotheelcellen (EV's) in PAA's te kwantificeren, evenals het aantal E's in de vasculaire plexus rond de PAA's binnen faryngeale bogen 3, 4 en 6. Wanneer toegepast op het hele embryo, biedt deze methodologie een uitgebreide visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale vasculatuur.
Introduction
Tijdens de embryogenese van de muis ontstaan faryngeale boogslagaders (PAA's) als symmetrische, tweelaterale paren slagaders die het hart verbinden met de dorsaleaorta1. Naarmate het embryo zich ontwikkelt, de eerste en tweede paar PAA's achteruit, terwijl de3e,4e, en 6e PAA's ondergaan een reeks van asymmetrische remodelleren gebeurtenissen om de aortaboog slagaders te vormen2.
Paa's 3, 4 en 6 ontwikkelen zich via vasculogene, dat is de de novo vorming van bloedvaten3. Afwijkingen in de vorming of remodelleren van deze boogslagaders leiden tot verschillende aangeboren hartafwijkingen, zoals die gezien bij patiënten met digeorge syndroom4,5. Daarom kan het begrijpen van mechanismen die de ontwikkeling van PAA's reguleren leiden tot een beter begrip van aangeboren hart-en vaatziekten (CHD) etiologie.
De huidige benaderingen voor het visualiseren en analyseren van PAA-ontwikkeling omvatten immunofluorescentie van weefselsecties, vaatwerpt, India-inktinjectie, hoge resolutie episcopic microscopie en/of immunohistochemie aan de hele berg1,4,5,6,7. Hierin beschrijven we een protocol dat hele immunofluorescentie, confocale microscopie en 3D-beeldweergave combineert om volumetrische gegevens, vasculaire connectiviteit en celidentiteit te verzamelen, analyseren en kwantificeren. Verder detailleren we een methode om de aantallen EC's in elke faryngeale boog te compartimenteren en te kwantificeren als een middel om de vorming van de faryngeale boog vasculaire plexus en de remodelleren ervan in de PAA's te bestuderen. Hoewel dit protocol is ontworpen voor het analyseren van PAA-ontwikkeling, kan het worden gebruikt om andere zich ontwikkelende vasculaire netwerken te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik en de procedures van dieren zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierverzorging en -gebruik van de Rutgers-universiteit.
1. Voorbereiding van oplossingen
- Bereid 1 L fosfaatgebufferde zoutoplossing voor met 0,1% Triton-X-100 (PBST) en filtersteriliseren. Deze oplossing kan minstens een jaar bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard.
- Bereid 600 μL blokkerende buffer voor die bestaat uit 10% van het normale ezelserum in PBST. Maak deze oplossing elke keer vers.
- Bereid 50 mL van de volgende methanol (MeOH) verdunningen in een stroomkap: 25% MeOH in gedeïoniseerd water (dH2O), 50% MeOH in dH2O en 75% MeOH in dH2O. Vortex te mengen. Store bij RT.
- Bereid 50 mL van de volgende benzyl alcohol-benzyl benzoaat (BABB) oplossingen in 50 mL conische buizen.
- Voeg voor 100% BABB 32 mL benzylbenzoaat toe aan 16 mL benzylalcohol (2:1 volume per volumeverhouding).
- Voor 50% BABB, voeg 16 mL benzyl benzoaat en 8 mL benzylalcohol toe aan 24 mL meoh.
- Bedek conische buizen in aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. Deze oplossingen kunnen maximaal een jaar bij RT worden opgeslagen.
LET OP: BABB is giftig en corrosief. Het moet worden behandeld en verwijderd volgens MSDS.
2. Embryodissectie en fixatie
OPMERKING: Dit protocol is geschikt voor E9.5 en E10.5 muisembryo's (mannelijk of vrouwelijk) geïsoleerd van elke muisstam. Voor jongere en oudere embryo's moeten incubatietijden experimenteel worden bepaald om de signaal-ruisverhouding van het fluorescentiesignaal te maximaliseren.
- Vul een 35 mm en een 60 mm petrischaaltjes met 1x PBS en plaats op ijs tot dat nodig is.
- Euthanaseer een zwangere2 muis via CO 2-inhalatie. Voer cervicale dislocatie uit als secundaire maatregel van euthanasie.
- Reinig de buikstreek van de dam met 70% ethanol. Knijp de buikstreek met behulp van tangen en maak een V-achtige incisie met behulp van chirurgische schaar vanaf de basis van de buikwand op de middellijn; blijven openen van de borstholte. Til het buikweefsel op en beweeg de darmen naar de zijkant om de baarmoederhoorns bloot te leggen.
- Maak een snede aan de basis van het vaginale kanaal, en met tangen, trek de baarmoeder uit de buurt van de dam. Maak een extra snede bij elke eierstok om de baarmoeder te bevrijden. Breng de baarmoeder in een van de 60 mm petrischaaltjes met koude 1x PBS.
- Snijd met een rechte schaar de baarmoederwand tussen elke implantatieplaats. Pak een decidua met een glazen pipet en breng over in de 35 mm petrischaal met 1x PBS. Onder een dissectiemicroscoop, steek rechte schaar in de ruimte tussen de decidua en de baarmoederwand. Snijd en verwijder de baarmoederwand.
- Verwijder met fijne tangen de decidua- en Reichert-membranen uit het embryo door zorgvuldig dwarse insnijdingen langs het weefsel te maken en het weefsel uit de dooierzak te trekken. Verwijder dooier zak en vruchtzak door zorgvuldig trekken het weefsel uit de buurt van het embryo en het maken van bezuinigingen op de allantois en navelstrengader.
OPMERKING: Dooierzakjes kunnen worden gebruikt voor genotyperingsembryo's. - Breng elk embryo met een glazen pipet over in individuele 2 mL buizen gevuld met 1 mL van 1x PBS. Label elke buis met een unieke id.
- Om embryo's te fixeren, verwijder je voorzichtig de 1x PBS en voeg je 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing toe in 1x PBS. Incubeer bij 4 °C met zachte agitatie 's nachts.
OPMERKING: 4% PFA fixatie is geschikt voor de antilichamen die in dit protocol worden genoemd. Fixatieprocedures moeten echter worden geoptimaliseerd voor extra antilichamen.
3. Embryokleuring
OPMERKING: In deze sectie worden embryo's permeabiliseerd en gekleurd met primaire en secundaire antilichamen. Omdat de PAA-ontwikkeling snel verloopt, zullen verschillen in embryonale fase de analyse stroomafwaarts sterk beïnvloeden. Daarom moeten embryo's op de leeftijd worden afgestemd door zorgvuldig te tellen somites om controle en mutant paren overeenkomen voorafgaand aan verdere manipulaties.
- Om embryo's te wassen, verwijder voorzichtig 4% PFA en voeg 1x PBS toe. De buis(en) meerdere keren voorzichtig omkeren. Plaats de buis(en) rechts naar boven en laat het embryo(s) zinken. Herhaal wassen 3 keer. Plaats de buis(en) met embryo's op ijs.
OPMERKING: (Optioneel stoppunt) Na de wasbeurten kunnen embryo's worden uitgedroogd in een gesorteerde reeks MeOH gedurende 30 min per verdunning, zoals in punt 1.3, en opgeslagen bij -20 °C in 100% MeOH voor later gebruik gedurende maximaal 6 maanden. - Gebruik voor E10.5 embryo's een glazen pipet om één embryo over te brengen naar een petrischaal van 35 mm gevuld met gekoelde 1x PBS. Knijp het embryo voorzichtig net boven de achterpoot met fijne tangen en maak een dwarse snede om de achterste helft van het embryo te verwijderen. Hierdoor kan het embryo plat liggen in een sagittale positie voor stap 4.2. Plaats het embryo terug in de 2 mL buis met verse 1x PBS.
OPMERKING: Een controle- en gemuteerd embryo kan worden gekoppeld en gekleurd met dezelfde antilichaamoplossing in één buis, voor de stappen 3.3 tot en met 3.8.- Als het bevlekken van twee embryo's samen, snijd het hoofd af van een embryo boven de eerste faryngeale boog door knijpen met fijne tangen om een dwarse snede te maken. Dit zal embryo's van twee verschillende genotypes binnen elke buis onderscheiden.
- Om het embryo(s) te permeabilize, pipet 1x PBS uit de buis, waarbij u oppast dat het embryo(s) niet worden aangeraakt. Voeg 1 mL PBST toe. Plaats de buis op 4 °C met lichte agitatie 's nachts.
LET OP: (Optioneel stoppunt) Embryo's kunnen enkele dagen in PBST-oplossing bij 4 °C worden bewaard. - Om niet-specifieke binding van antilichamen te voorkomen, moet u eerst PBST uit de buis verwijderen, waarbij u ervoor moet zorgen dat het embryo(s) niet worden aangeraakt. Voeg 600 μL blokkerende bufferoplossing toe aan het embryo(s). Blokkeer het embryo(s) bij 4 °C met lichte agitatie 's nachts.
OPMERKING: De blokkeringsoplossing moet vlak voor gebruik op topsnelheid op een benchtopcentrifuge worden gesponnen om vuil te verwijderen. - Gebruik antilichamen tegen VEGFR2 en ERG om EC's te bevlekken en te kwantificeren. Antilichaamoplossingen worden gemaakt in de blokkeerbuffer. Anti-VEGFR2 antilichaam wordt verdund 1:200 en ERG antilichaam wordt verdund 1:1000.
OPMERKING: Antilichaamoplossingen moeten vlak voor gebruik op topsnelheid op een bench-top centrifuge worden gesponnen om deeltjes te verwijderen.- Als u embryo's met primaire antilichamen wilt uitbroeden, verwijdert u de blokkerende bufferoplossing uit de buis, waarbij u ervoor moet zorgen dat het embryo(s) niet worden aangeraakt. Voeg 600 μL primaire antilichaamoplossing toe aan elke buis. Embryo(s) bij 4 °C uitte met lichte agitatie gedurende 4-5 dagen.
- Om het embryo(s) van de antilichaamoplossing te wassen, verwijdert u eerst de primaire antilichaamoplossing uit de buis. Was embryo's elk uur met 1 mL PBST bij kamertemperatuur (RT) met zachte agitatie. Was embryo(s) 4-5 keer gedurende de dag en dan uitbroeden bij 4 °C met zachte agitatie 's nachts. Herhaal wast de volgende dag.
- Maak secundaire antilichaamoplossingen door anti-geit Alexa Fluor 488 en anti-muis Alexa Fluor 555 1:300 in blokkerende buffer te verdunnen. Verdun de voorraad DAPI 1:1000 in het blokkeren van buffer.
OPMERKING: Antilichaamoplossingen moeten vlak voor gebruik op topsnelheid op een bench-top centrifuge worden gesponnen om deeltjes te verwijderen. Daarnaast kunnen andere Alexa Fluor kleurstoffen worden gebruikt in plaats van 488 of 555.- Om het embryo(s) met secundaire antilichamen uit te broeden, verwijdert u PBST uit de buis. Voeg 600 μL secundaire antilichaamoplossing toe aan elke buis. Embryo(s) bij 4 °C uitte met lichte agitatie gedurende 4-5 dagen.
- Om het embryo(s) van de antilichaamoplossing te wassen, moet u eerst de secundaire antilichaamoplossing uit de buis verwijderen. Was het embryo(s) elk uur met 1 mL PBST bij RT met zachte agitatie. Was embryo(s) 4-5 keer gedurende de dag en dan uitbroeden bij 4 °C met zachte agitatie 's nachts. Herhaal wast de volgende dag.
4. Embryo's insluiten in agarose
OPMERKING: In sectie 4 wordt het embryo(s) in agarose ingebed. Dit inbeddingsproces dient twee doelen: het embryo goed oriënteren voorafgaand aan beeldvorming, en helpen bij het lokaliseren van het embryo nadat het in BABB is gewist (stappen 5.2.2 - 5.3.2).
- Bereid 200 mL van 1% agarose oplossing door het toevoegen van 2 g agarose tot 200 mL van dH2O. Magnetron totdat alle agarose is opgelost.
LET OP: Resterende agarose kan worden opgeslagen bij 4 °C en opgewarmd voor later gebruik. - Met behulp van een plastic paraffine mal en glazen pipet, voorzichtig overdracht van een embryo naar de mal. Verwijder PBST voorzichtig uit embryo. Plaats het embryo in een sagittale positie. Voeg snel ongeveer 0,5 mL hete agarose toe aan de mal - net genoeg om het embryo te bedekken en de mal te vullen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen het embryo omringen.
- Plaats de mal op ijs en bedek met aluminiumfolie tot de agarose is gestold.
LET OP: Laat het embryo niet drogen na het verwijderen van PBST. Agarose oplossing moet warm genoeg zijn om vloeibaar te blijven wanneer het wordt toegevoegd aan het embryo. Voeg net genoeg agarose om het embryo te dekken, maar niet te veel, anders zal het moeilijk zijn om het beeld. De beelddiepte wordt gedeeltelijk bepaald door de werkafstand van het doel.
5. Uitdroging en weefselclearing
OPMERKING: In deze sectie worden embryo's uitgedroogd met behulp van methanolseries, vervolgens gewist in het organische oplosmiddel BABB, en gemonteerd tussen twee coverslippen gescheiden door een rubberen spacer; in dit protocol worden Fast Well rubberafstanders gebruikt. De Fast Well bumper heeft een dubbelzijdig kleefoppervlak. De spacer is nodig om een put te creëren, waarin het embryo zal worden geplaatst en gehouden tussen twee coverslips.
-
Methanol uitdroging
- Label nieuwe 2 mL buizen, een per embryo. Voeg 1 mL van 25% MeOH per buis toe.
- Met behulp van een schone scalpel, voorzichtig snijd de agarose rond het embryo, waardoor er genoeg rond het embryo, zodat het kan worden opgepikt door tangen. Gebruik fijne tangen om de agarose voorzichtig te grijpen met het ingebedde embryo en plaats deze in de gelabelde buis met 25% MeOH. Laat de tangen het embryo niet aanraken.
- Incubeer embryo's bij RT met zachte agitatie gedurende 1 uur in het donker.
- Verwijder 25% MeOH uit de buis, wees voorzichtig om het embryo niet aan te raken. Voeg 1 mL van 50% MeOH per buis toe. Incubeer bij RT met zachte agitatie gedurende 1 uur in het donker.
- Verwijder 50% MeOH uit de buis, wees voorzichtig om het embryo niet aan te raken. Voeg 1 mL van 75% MeOH per buis toe. Incubeer bij RT met zachte agitatie gedurende 1 uur in het donker.
- Verwijder 75% MeOH uit de buis, wees voorzichtig om het embryo(s) niet aan te raken. Voeg 1 mL van 100% MeOH per buis toe. Incubeer bij RT met zachte agitatie gedurende 1 uur in het donker. Herhaal 100% MeOH twee maal wassen.
-
Clearing met BABB
- Verwijder 100% MeOH uit de buis, wees voorzichtig om het embryo niet aan te raken. Voeg 1 mL van 50% BABB per buis toe. Incubeer bij RT met zachte agitatie gedurende 1 uur in het donker.
- Verwijder 50% BABB uit de buis, wees voorzichtig om het embryo niet aan te raken. Voeg 1 mL van 100% BABB per buis toe. Incubeer bij RT met zachte agitatie gedurende 1 uur in het donker. Herhaal 100% BABB wassen twee maal.
LET OP: (Optioneel stoppunt) Embryo's kunnen ongeveer een week in 100% BABB in buizen blijven. Langere opslag zal leiden babb om het plastic van buizen op te lossen.
-
Montage van embryo's voor beeldvorming
- Plaats een Fast Well bumper op een 24 mm x 60 mm #1.5 glazen afdekking, door de plastic lijm van één kant af te pellen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de coverslip en bumper door het toepassen van zachte druk op de plastic lijm boven op de rubberen bumper. Label de coverslip op basis van embryonummer, genotype, en antilichamen gebruikt voor kleuring.
OPMERKING: Elke afstandkan tussen de coverlips worden geplaatst zolang deze dik genoeg is om te voorkomen dat een embryo wordt geplet of geplet. We gebruiken Fast Well afstandhouders vanwege hun dikte en gemak, waaronder kleefoppervlakken aan weerszijden van de spacer voor het vastzetten van het aan coverslips. - Pipetteer de 100% BABB voorzichtig uit de buis. Na het visualiseren van de agarose-embedded embryo in de buis, gebruik fijne tangen op te halen de agarose en zorgvuldig overbrengen van het embryo op de coverslip in de Fast Well - niet toestaan dat de tangen om het embryo aan te raken.
- Haal de tweede plastic lijm uit de bumper en leg de tweede coverslip erop. Verwijder luchtbellen door zachtjes op de afdekking te drukken. Zorg ervoor dat u het glas niet breekt.
OPMERKING: Monsters kunnen tot een jaar lang plat in een schuifhouder in het donker bij RT worden opgeslagen als de afdichting strak is.
- Plaats een Fast Well bumper op een 24 mm x 60 mm #1.5 glazen afdekking, door de plastic lijm van één kant af te pellen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de coverslip en bumper door het toepassen van zachte druk op de plastic lijm boven op de rubberen bumper. Label de coverslip op basis van embryonummer, genotype, en antilichamen gebruikt voor kleuring.
6. Verwerving van gegevens
OPMERKING: In de volgende stappen zal het endotheel van de keelholtebogen 3, 4 en 6 worden afgebeeld met behulp van confocale microscopie.
-
Plaatsing van dia's op microscoopstadium
- Om embryo's te beelden, gebruik maken van een confocale microscoop uitgerust met een 20x water onderdompeling doelstelling, numeriek diafragma 0,95, werkafstand 0,95 mm, en de NIS-Elements AR 5.11.01 64-bit software.
- Met behulp van breedveldfluorescentie, visueel lokaliseren van de faryngeale bogen. Centreer het veldzicht rond de4e PAA.
- Als het gezichtsveld van de doelstelling niet het hele faryngeale booggebied vastlegt, neemt en steek dan een groot paneel van afbeeldingen met 1% overlap. Om beweging van het monster te voorkomen tijdens de aanschaf van het grote beeld, zet u de montage van de afdekkingsslip voorzichtig vast aan het podium met behulp van gietklei.
-
Acquisitieparameters instellen
- Stel de pinhole grootte in op 1.0.
- Stel onder het tabblad ND-acquisitie de boven- en onderkant van beeldvorming in met de grove aanpassing. Stel Z stapgrootte in volgens softwarespecificaties. Bepaal de dikte die kan worden weergegeven aan de werkafstand van het doel en de helderheid van het monster.
- Door de dikte van het embryo, past u de gain in de Z-stack aan. Stel de laserintensiteit en versterking in het midden van de Z-stack voor elk kanaal (405, 488 en 555) en wijs waarden toe onder het tabblad Z-intensiteitscorrectie.
- Scroll door het embryo tot fluorescentiesignalen dimmer beginnen te lijken. Verhoog de versterking van elk kanaal totdat de signaalintensiteit lijkt op het vorige segment. Wijs de nieuwe waarde toe onder het tabblad Z-intensiteitscorrectie. Herhaal totdat de z-stack is voltooid. Importinstellingen terug naar ND Acquisition.
- Scan uitvoeren met de optie Z-correctie uitvoeren.
7. Analyse met behulp van de Imaris-software
OPMERKING: In deze stappen worden confocale beelden geanalyseerd met behulp van de microscopie-beeldanalysesoftware, Imaris versie 9.2.0. Tijdens deze analyse zullen we eerst gebieden selecteren die van belang zijn om te worden geanalyseerd door oppervlakken te maken. Vervolgens gebruiken we de functie Masker om deze gebieden visueel te scheiden. Ten slotte zullen we de Spot-functie gebruiken om het aantal EC's binnen elke regio van belang te kwantificeren.
- Afhankelijk van de imagingsoftware die in stap 6 wordt gebruikt, converteert u afbeeldingen naar .ims met Behulp van Imaris File Converter.
- Open de .ims-bestanden. Afbeelding instellen op Orthogonaal onder Camera/Labels | Deelvenster Cameratype.
- Zoek de PAA's en oriënter de afbeelding op oppervlakte.
OPMERKING: Wanneer de bestanden voor het eerst worden geopend, worden ze weergegeven als een 3D-compilatie van alle segmenten die worden weergegeven. In deze stap worden de PAA's gelokaliseerd door van de 3D-afbeelding een 2D-afbeelding te maken. De 2D-afbeelding maakt het dan mogelijk voor de PAA's goed te worden georiënteerd voor analyse.- Schakel volumeonder het deelvenster Eigenschappen uit . Klik onder het deelvenster Eigenschappen op Nieuwe orthoslicer toevoegen. Stel de segmentstand in op het XY-vlak. Gebruik de segmentpositie om door de afbeelding te bladeren totdat u de PAA's hebt gevonden.
- Als de PAA's niet parallel lopen aan de boven- en onderkant van de afbeelding, draait u de afbeelding vrij met de muiscursor, zodat PAA's van links naar rechts over het scherm worden uitgevoerd. Selecteer onder het vervolgkeuzemenu Beeldverwerking de optie Vrij draaien en klik op OK.
- Het oppervlak van de 3e Pharyngeal Arch (Figuur 2A, B - B")
OPMERKING: In deze stappen zullen de faryngeale bogen en PAA's worden getraceerd met behulp van de Surface-tool om een 'opgedoken' gebied van belang te genereren. Hierdoor kan elke regio van belang visueel worden geïsoleerd van het omringende weefsel. Hierin beschrijven we de stappen om de endotheelcomponenten van de3e faryngeale boog aan de oppervlakte te brengen en te analyseren. Pharyngealbogen 4 en 6 worden op dezelfde manier geanalyseerd.- Als u het endotheel in de gehele 3 e-pharyngeale boog wilt aandeoppervlakte, klikt u op de knop Nieuwe oppervlakte toevoegen onder het deelvenster Eigenschappen. rd Dubbelklik op Surface 1 en hernoem het nieuwe oppervlak naar "3rd Pharyngeal Arch".
- Selecteer Automatisch maken overslaan, handmatig bewerken. Stel de surface-oriëntatie in op het YZ-vlak (coronale oriëntatie). Gebruik de slicepositie om het3e faryngeale boogvlak te plaatsen waar de3e PAA en de Dorsale Aorta met elkaar verbinden.
- Draai de afbeelding zo dat het3e faryngeale boogvlak in beeld is. Ortho Slicer 1 uitschakelen.
- In het kader van de loting | Contour | Tabblad Modus selecteert u de functie Afstandstekenmodus. Pas indien nodig de parameterinstellingen aan. Houd consistente oppervlakteparameters tussen de monsters. In dit voorbeeld is de vertex-afstand 10 μm.
- Als u wilt beginnen met het opduiken, drukt u op de Esc-toets en klikt u op de knop Tekenen. Traceer de omtrek van de3e faryngeale boog met de muiscursor. Gebruik de segmentpositie om 10-25 segmenten te verplaatsen. Traceer de omtrek van de faryngeale boog. Herhaal dit totdat de faryngeale boog volledig is getraceerd.
- Als u het oppervlak van het traceergebied wilt genereren, selecteert u de knop Oppervlak maken in het deelvenster Eigenschappen.
- Oppervlakte van de 3e PAA (figuur 2C - C")
- Om het endotheel van de3e PAA aan de oppervlakte te brengen, schakelt u eerst het opgedoken gebied uit vanaf stap 7.4, door dederde Pharyngeal Arch-oppervlaktebox uit te schakelen. Klik vervolgens nogmaals op de knop Nieuwe surface toevoegen. Dubbelklik op Surface 1 en hernoem het nieuwe oppervlak naar '3rd PAA'.
- Selecteer Automatisch maken overslaan, handmatig bewerken. Stel de surface-oriëntatie in op het YZ-vlak (coronale oriëntatie). Gebruik de slicepositie om het3e PAA-oppervlakvlak te plaatsen waar de3e PAA en de dorsale aorta verbinding maken en herhaal vervolgens stap 7.4.
- Maskeren van oppervlaktestructuren
OPMERKING: In de volgende stappen wordt elk opgedoken gebied van belang gemaskeerd. Maskering maakt het mogelijk de regio van belang visueel te onderscheiden van de rest van het afgebeelde weefsel en zorgt voor de kwantificering van deze verschillende structuren van belang. Hieronder beschrijven we de stappen in Imaris om het PAA-endotheel te visualiseren en te analyseren, evenals de plexus - de kleinere vasculatuur rond de PAA's in de faryngeale bogen. In deze stappen wordt het3e PAA-oppervlak gemaskeerd om alleen analyses op de PAA's te visualiseren en uit te voeren met behulp van de spotfunctie beschreven in sectie 7.7.- Selecteer Volume om alle gemaskerde kanalen te visualiseren. Druk op de Esc-toets om de afbeelding te roteren en de afbeelding in een XY-positie te plaatsen.
- Selecteer onder het tabblad Bewerken de optie Maskerselectie voor de derdePAA. Selecteer het DAPI-kanaal en klik op OK. Herhaal dit voor de overige kanalen.
- Druk op het toetsenbord op Ctrl + D om het deelvenster Weergaveaanpassingen weer te geven. Selecteer elk nieuw kanaal en wijzig ze om duidelijk te maken wat elk kanaal laat zien. Dit zal bijvoorbeeld leiden tot drie nieuwe kanalen: "3rd PAA DAPI", "3rd PAA ERG" en "3rd PAA VEGFR2".
OPMERKING: In stappen 7.6.4-7.6.7 maken we alleen kanalen voor faryngeale arch plexus. - Om de endotheliale plexus apart van de PAA te visualiseren, selecteren we eerst Mask Selection voor het3rd PAA-oppervlak. Selecteer het DAPI-kanaal. Schakel Het selectievakje Voxels buitenoppervlak selecteren in en controleer Voxels binnen het oppervlak selecteren op knoppen, stel Voxels binnenhet oppervlak op nul in. Klik op OK.
- Herhaal dit voor de overige kanalen. Deze operatie sluit de regio met de PAA uit van de nieuwe gemaskerde kanalen. Wijzig de naam van kanalen om duidelijk te maken wat elk kanaal laat zien. Dit zal bijvoorbeeld leiden tot drie nieuwe kanalen: "Non-PAA DAPI", "Non-PAA ERG" en "Non-PAA VEGFR2".
- Als u endotheliale plexus wilt visualiseren in de3e faryngeale boog, selecteert u Maskerselectie onder het tabblad Bewerken voor het3e Faryngealarch-oppervlak. Selecteer het DAPI-kanaal niet-PAA. Klik op OK.
- Herhaal dit voor de resterende niet-PAA-kanalen. Wijzig de naam van kanalen om duidelijk te maken wat elk kanaal laat zien. Dit zal bijvoorbeeld leiden tot drie nieuwe kanalen: "Plexus DAPI", "Plexus ERG" en "Plexus VEGFR2".
- Kwantificering van DE EG-nummers
OPMERKING: De expressie van ERG markeert endotheelkernen waardoor het handig is om EG-nummers te kwantificeren. In deze stappen wordt het aantal EC's gekwantificeerd met behulp van de Spot-functie om een plek te genereren voor elke EC die wordt gemarkeerd door ERG-expressie in de PAA en plexus. In punt 7.7 worden vlekken gegenereerd voor elke ERG-positieve cel in de gemaskerde PAA, gevolgd door de deselectie van vlekken in ERG-positieve, VEGFR2-negatieve cellen.- Druk op het toetsenbord op Ctrl + D om het deelvenster Weergaveaanpassingen weer te geven. Schakel alle kanalen uit, behalve PAA ERG.
- Klik onder het tabblad Eigenschappen op de knop Nieuwe vlekken toevoegen. Klik op Spots 1 en wijzig de naam in "PAA Totaal aantal ECs". Klik op de blauwe pijlknop. Selecteer voor Bronkanaalhet PAA ERG-kanaal. Stel de geschatte xy-diameter aan op 4 μm. Ga door naar het volgende paneel door op de blauwe pijlknop te klikken.
- Pas het aantal plekken dat wordt gezien met behulp van de schuifschaal aan om ervoor te zorgen dat elke EG-kern (gemarkeerd door ERG-expressie) door één plek wordt vertegenwoordigd. Klik op de groene dubbele pijlknop.
- Schakel het PAA ERG-kanaal uit in de weergaveaanpassing. Schakel het PAA VEGFR2-kanaal in om PAA-endotheel te visualiseren.
- Om het aantal EC's nauwkeurig te kwantificeren, zorgen we ervoor dat elke spot zowel EC-markeringen, ERG als VEGFR2 uitdrukt. Selecteer hiervoor Objectoppervlak onder het tabblad Bewerken | Deelvenster Toevoegen/verwijderen. Druk op de Esc-toets en verwijder alle plekken die niet VEGFR2-positief zijn, door shift ingedrukt te houden en de plek te selecteren.
OPMERKING: In de volgende stap worden vlekken gegenereerd voor elke ERG-positieve cel in de gemaskerde plexus, gevolgd door de deselectie van vlekken in ERG-positieve, VEGFR2-negatieve cellen. - Klik onder het tabblad Eigenschappen op de knop Nieuwe vlekken toevoegen. Selecteer Spots 1 en wijzig de naam in 'Plexus Totaal aantal EC's'. Klik op de blauwe pijlknop. Selecteer voor Bronkanaal het Plexus ERG-kanaal. Stel de geschatte xy-diameter aan op 4 μm. Herhaal stap 7.7.1 - 7,7,5 voor plexus totaal aantal ECs.
- Klik op het tabblad Statistieken van elke spotfunctie om het totale aantal EC's in de3e PAA en faryngeale boogplexus te bepalen.
- Herhaal stap 7.7.1 - 7.7.6 voor de resterende PAA's en faryngeale boog plexus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier gepresenteerde immunofluorescentieprotocol met hele mount levert duidelijke en schone resultaten op, waardoor de 3D-reconstructie van faryngeale boogendotheel mogelijk is, zoals te zien is in figuur 1A. Het is belangrijk om embryo's voldoende lang in elke antilichaamoplossing uit te broeden om volledige penetratie door het monster te garanderen, evenals, het grondig wassen van embryo's na de incubatie. In figuur 1Bverschijnen grote, heldere stippen als gevolg van deeltjes in het antilichaam of blokkerende bufferoplossingen. We hebben vastgesteld dat centrifugeren elke oplossing voor gebruik en langere perioden van PBST wast na elke antilichaam incubatie lost dit probleem.
Figuur 2 illustreert het proces dat wordt gebruikt om een faryngeale boog en een PAA aan de oppervlakte te brengen voor analyse zoals beschreven in sectie 7 van het protocol. Met behulp van de gemaskerde functie maakt imaris-software het mogelijk om opgedoken gebieden visueel te scheiden en onafhankelijk te analyseren.
Figuur 3 toont individuele maskering van verschillende vaatcompartimenten in de keelholtebogen: de PAA (Figuur 3A, B, C) en de plexus ( Figuur3A', B', C'). Maskering maakt de analyse en kwantificering van EG-nummers in elke structuur afzonderlijk mogelijk. In figuur 3C-C'wordt de Spot-functie gebruikt om het totale aantal EC's in zowel de PAA als de plexus te kwantificeren, door voor elke kern die ERG uitdrukt één plek toe te kennen. Het is belangrijk op te merken dat het algoritme dat wordt gebruikt voor de Spot-functie is ontworpen om een stip te genereren voor elke pixel van een bepaalde grootte. ERG, dat hier wordt gebruikt als een marker van EG-kernen, wordt ook uitgedrukt in neurale kuifcellen8; neurale kamcellen geven geen druk op VEGFR2. Figuur 3D illustreert een voorbeeld van een ERG-positieve (groene), VEGFR2-negatieve (roze) vlek die is gegenereerd door de Functie Imaris Spot. Daarom is het van essentieel belang om na te gaan of elke stip één EG vertegenwoordigt en is gelabeld met zowel ERG als VEGFR2.
| Stap | Tijd | Temperatuur | |
| 1 | PBST Wash/Permeabilisatie | 24 uur of O/N | 4 °C |
| 2 | Buffer blokkeren | 25 uur of O/N | 4 °C |
| 3 | Primair antilichaam | 4-5 dagen | 4 °C |
| 4 | PBST Wassen | 4-5 keer per dag gedurende 2 dagen | RT (of 4 °C als O/N) |
| 5 | Secundair antilichaam | 4-5 dagen | 4 °C |
| 6 | PBST Wassen | 4-5 keer per dag gedurende 2 dagen | RT (of 4 °C als O/N) |
| 7 | Insluiten | N/a | Rt |
| 8 | Methanol Uitdroging en BABB | 1 uur per stap | Rt |
Tabel 1: Overzicht van het hele immunofluorescentieprotocol. O/N - 's nachts; RT - kamertemperatuur.
Figuur 1: Vergelijking van schone en vuile beelden na de hele immunofluorescentie. Sagittale weergaven van E10.5 embryo tonen het gebruik van anti-VEGFR2 antilichaam (wit) om het PAA-endotheel te visualiseren. Embryo's grondig gewassen met PBST post antilichaam incubatie(A)hebben een hogere signaal-ruis verhouding en produceren een schoner beeld, in vergelijking met embryo's die niet grondig gewassen(B). Pijlen in B tonen gebieden met lawaai/vuil die in het beeld zijn verschenen wanneer een embryo niet grondig wordt gewassen of de antilichaamoplossing niet is gecentrifugeerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Verharding van faryngeale boog (PA) en PAA. Een 2D sagittale weergave(A)wordt gebruikt om de locatie van de PAA's in het confocale beeld te identificeren. Een coronale ortho snijmachine (A, gele lijn) is plaats door de PAA's. De faryngeale boog(B)en PAA(C)worden vervolgens in de coronale oriëntatie opgedoken met behulp van het gereedschap Afstandstekenen in Imaris. Het gereedschap Afstandstekenen, ingesteld op 10 μm, wordt gebruikt om de omtrek van de3e faryngeale boog(B)of de PAA (C) te traceren. Contouren worden elke 10-25 plakjes door de hele boog getrokken(B', C'). Contouren worden gecombineerd om een 3D-oppervlak van de faryngeale boog(B") of de PAA (C" )te genereren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van EG-nummers in een PAA en een plexus. 3D-reconstructies worden gebruikt om de structuur en expressie van EG-markeringen in een PAA of in een EG-plexus afzonderlijk te visualiseren. Panelen A-A' tonen de uitdrukking van VEGFR2 in de PAA (A, geel) en in de plexus (A', roze). Panel A" illustreert een samenvoeging van de PAA en plexus VEGFR2 expressie. Panelen B-B' tonen de uitdrukking van ERG in de PAA (B, red) en in de plexus (B', groen). Panel B" illustreert de samenvoeging van de PAA en plexus. C-C'. De Spot-functie in Imaris wordt gebruikt om het aantal EC's in de PAA of plexus te kwantificeren. Elke ERG-positieve cel in de PAA (C, rood) of plexus (C', groen) krijgt één plek toegewezen om één EG te markeren. De pijl in C'-D toont een voorbeeld ERG-positieve, VEGFR2-negatieve plek in de plexus die is gegenereerd door de Functie Imaris Spot. Deze plek is uitgesloten van kwantificering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mogelijkheid om het endotheel in muisembryo's in 3D te visualiseren heeft nieuwe inzichten opgeleverd in hun ontwikkeling3. Hier presenteren we een protocol dat het mogelijk maakt voor hoge resolutie 3D-beeldvorming van embryo's, visualisatie van vasculaire connectiviteit, en kwantitatieve analyses van PAA-vorming. Dit protocol kan worden gebruikt om te zien hoe genetische veranderingen of milieubeledigingen van invloed paa ontwikkeling. De hier gerapporteerde procedure maakt gebruik van antilichamen tegen VEGFR2 en ERG om paa-vorming te visualiseren en het EG-nummer te kwantificeren; echter, extra antilichamen kunnen worden gebruikt om te visualiseren en analyseren van andere aspecten van de ontwikkeling van de boogslagader, zoals neurale crest werving of gladde spiercel differentiatie. Als deze procedure in een eerder stadium van embryogenese moet worden gebruikt, is het belangrijk op te merken dat sommige antigenen (bijvoorbeeld ERG) die in dit protocol worden gedetecteerd, nog niet kunnen worden uitgedrukt. Andere nucleaire vlekken zoals DAPI of DRAQ5 of lineage labeling met nucleair gelabelde tracers kunnen worden gebruikt om het EG-nummer te kwantificeren.
Er zijn verschillende kritische stappen binnen het protocol: ervoor zorgen dat 1) embryo's niet uitgedroogd raken tussen oplossingsveranderingen; 2) embryo's worden grondig gewassen na het uitbroeden van antilichamen; en 3) dat embryo's volledig uitgedroogd zijn met MeOH voordat weefselclearing met BABB.
Methanol wast vóór weefselclearing dienen twee doelen: het elimineren van fluorescentie als gevolg van de expressie van fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld de expressie van EGFP of tdTomato die wordt gebruikt voor lineage tracering) in het embryo, en om het weefsel uit te drogen. De eliminatie van fluorescentie uit fluorescerende eiwitten maakt het gebruik van elke combinatie van fluorofen voor beeldvorming mogelijk. Antilichamen tegen EGFP en TdTomato (kers) kunnen worden gebruikt om de expressie van deze fluorescerende eiwitten te visualiseren. Als alternatief kan MeOH worden vervangen door tetrahydrofuran om de fluorescentie van fluorescerende eiwitten te behouden9.
We hebben vastgesteld dat embryo's die niet goed uitgedroogd zijn voorafgaand aan BABB-clearing moeilijk in beeld zijn als gevolg van lichtverstrooiing. BABB is een hydrofobe oplossing die volledige uitdroging in een organisch oplosmiddel vereist om het ondoorzichtige weefsel te wissen. Volledige clearing zorgt voor de mogelijkheid om beelden te verkrijgen op de diepste niveaus binnen het embryo10,11. In dit protocol gebruikten we een 20x wateronderdompelingsdoelstelling, vanwege de lange werkafstand en beschikbaarheid ten tijde van onze experimenten. Olieimmers zijn beter geschikt voor dit protocol, omdat BABB en olie dichterre brekingsindexen hebben dan water en BABB. Echter, ondanks het verschil in brekingsindex, water onderdompeling doelstelling gebruikt in dit protocol op voorwaarde dat een uitstekende beeldkwaliteit.
Er zijn een paar beperkingen van dit protocol. BABB clearing gebruikt hier is giftig en corrosief11,12,13. BABB lost lijm en kunststoffen op. Als monsters niet goed worden behandeld tijdens de beeldvorming, kan de objectieve lens van de microscoop worden beschadigd door BABB die via scheuren in de afdekking strekken of een gebroken afdichting tussen de Fast Well-bumper en het uitglijder uit het monster kan ontsnappen. Clearingmethoden die geen organische oplosmiddelen gebruiken, zoals CLARITY, kunnen worden gebruikt als alternatieven10,11,14. CLARITY's brekingsindexmatchingoplossing heeft een brekingsindex die vergelijkbaar is met die van water, waardoor het een geschikte clearingmethode is als het gebruik van een wateronderdompelingsdoelstelling. Een bijkomende beperking van dit protocol is dat het alleen kan worden uitgevoerd op niet-levende weefsels, waardoor de toepassing ervan voor live beeldvorming wordt voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Brianna Alexander, Caolan O'Donnell en Michael Warkala voor het zorgvuldig lezen en bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de financiering van het National Heart, Lung and Blood Institute van het NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 aan SA; AJR wordt ondersteund door NHLBI HL103920-08S1 en het National Institute of Artritis en Spier- en Huidziekten Training subsidie T32052283-11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
