Quantificando parâmetros espáteris de exocitose celular em células micropatteradas

Resumo

A imagem viva da excitose lisosômica em células micropatteradas permite uma quantificação espacial desse processo. A normalização da morfologia usando micropatterns é uma excelente ferramenta para descobrir regras gerais sobre a distribuição espacial dos processos celulares.

Resumo

Imagem ao vivo da pHluorin marcada como fator solúvel N-ethylmaleimida-fator anexo Proteína de apego REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana associada à vesícula 7 (VAMP7) por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) é uma maneira simples de explorar a secreção do compartimento lysosomal. Aproveitando a cultura celular em superfícies micropatteradas para normalizar a forma celular, uma variedade de ferramentas estatísticas foram empregadas para realizar uma análise espacial de padrões secretos. Usando a função K de Ripley e um teste estatístico baseado na distância do vizinho mais próximo (NND), confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório, mas mostra agrupamento significativo. Note-se que nossa análise revelou que os eventos de exocitose também estão agrupados em áreas de não adesão, indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. Ainda assim, descobrimos que a adesão celular aumenta o agrupamento. Além das áreas adesivas e não adesivas precisamente definidas, a geometria circular desses micropatterns permite o uso de coordenadas polares, simplificando as análises. Utilizamos a Estimativa de Densidade do Kernel (KDE) e a função de distribuição cumulativa em coordenadas polares de eventos de exocitose para identificar áreas enriquecidas de exocitose. Em células de micropattern em forma de anel, o agrupamento ocorreu na borda entre as áreas adesivas e não adesivas. Nossa análise ilustra como ferramentas estatísticas podem ser empregadas para investigar distribuições espaciais de diversos processos biológicos.

Introdução

Exocitose é um processo celular universal no qual uma vesícula se funde com a membrana plasmática e libera seu conteúdo. A vesícula pode se fundir totalmente com a membrana plasmática (fusão total) ou criar um poro de fusão que permanece aberto durante um tempo limitado (beijo-e-corrida)¹. Por exemplo, proteínas recém-sintetizadas são liberadas no meio extracelular a partir de vesículas provenientes do complexo golgi. Este caminho biossintético, anterograde é primordial, especialmente em organismos multicelulares, para segregar peptídeos de sinalização (por exemplo, hormônios, neurotransmissores) e componentes de matriz extracelular (por exempl....

Protocolo

1. Preparação de células micropatteradas

1. Transfecção de células
   1. Um dia antes da transfecção, as células semente 2,5 x 10⁶ hTERT-RPE1 em um poço de uma placa de 12 poços (2 x 2 cm) em 1 mL de média.
   2. No dia da transfecção, prepare a mistura de transfecção com plasmídeo vamp7-pHluorin (100 μL de tampão, 0,8 μg de DNA, 3 μL de mistura de transfecção). Incubar por 10 minutos.
      NOTA: VAMP7 é um v-SNARE lysosômico, fundido com uma tag pHluorin luminal. A sonda pHluorin é saciada por pH baixo, mas durante os prótons de exocitose são liberados e pHluorin começa a emitir um sinal^10,11....

Resultados

As características esposteis dos eventos de exocitose foram analisadas a partir de lysososomes visualizados por VAMP7-pHluorin^10,11 em células hTert-RPE1. as células hTert-RPE1 são células não transformadas que adotam bem a micropatterning e têm sido amplamente utilizadas em estudos anteriores baseados em micropattern^4,14. VAMP7 é um v-SNARE¹⁵ lisosômico que foi marcado com o pHluo.......

Discussão

Monitoramos eventos de exocitose do compartimento lisosômico por tirfm imagem celular viva de VAMP7-pHluorin em células normalizadas em forma de anel e realizamos uma análise estatística rigorosa dos parâmetros espaciais dos eventos de excitose. Empregando a função K da Ripley transformada e um teste estatístico baseado na distância mais próxima do vizinho, confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório^8,,9. Ambas as análises estatísticas m.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara magnética	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
fibrinogênio	plasma bovino de fibronectina Invitrogen	F35200
	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Linha celular Gibco	15630-056
hTert RPE1	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	De autoria de W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Reagente de transfecção	Polyplus	114-07
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140-122
Fotomáscara	Delta Máscara
PLL-g-PEG solução	Soluções de superfície	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Tripsina (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
Forno de ozônio UV	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmídeo	n/a	n/a Referência	do papel: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 5 de dezembro; 283(49):34365-73. DOI: 10.1074/JBC. M804587200. Papel da HRB na endocitose dependente de clatrina. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.

Sondas moleculares de,