We beschrijven een methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde katachtige cardiogene trombi met behulp van warmte-geïnduceerde antigen retrieval en een dubbele immunolabeling protocol.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Identificatie van Neutrophil Extracellular Traps in Paraffine-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescentie Microscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), samengesteld uit celvrij DNA (cfDNA) en eiwitten zoals histonen en neutrofiele elastase (NE), worden vrijgegeven door neutrofielen in reactie op systemische ontsteking of ziekteverwekkers. Hoewel eerder is aangetoond dat NETs de stolselvorming vergroten en fibrinolyse remmen bij mensen en honden, is de rol van NET's bij katten met cardiogene arterial trombo-embolie (CATE), een levensbedreigende complicatie secundair aan hypertrofische cardiomyopathie , is onbekend. Een gestandaardiseerde methode om NET's te identificeren en te kwantificeren bij cardiogene arteriële trombi bij katten zal ons begrip van hun pathologische rol in CATE bevorderen. Hier beschrijven we een techniek om NET's te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde trombi binnen de aortabifurcatie, geëxtraheerd tijdens obductie. Na deparaffinisatie met xyleen ondergingen aortasecties indirect warmte-geïnduceerde antigeenterugwinning. Secties werden vervolgens geblokkeerd, permeabilized, en ex vivo NETs werden geïdentificeerd door colocalisatie van cel-vrij DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), en neutrophil elastase (NE) met behulp van immunofluorescentie microscopie. Om de immunodetectie van NET's in trombi te optimaliseren, werd autofluorescentie van weefselelementen beperkt door een autofluorescentieblusproces voorafgaand aan microscopie te gebruiken. Deze techniek kan een nuttig hulpmiddel zijn om NET's en trombose bij andere soorten te bestuderen en biedt nieuwe inzichten in de pathofysiologie van deze complexe aandoening.
Inleiding
Katten met hypertrofische cardiomyopathie lopen het risico op levensbedreigende trombo-embolie complicaties1,2. Ondanks de hoge morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met katachtige cardiogene arteriële trombo-embolie (CATE), wordt de onderliggende pathofysiologie van CATE bij katten slecht begrepen. Er zijn ook beperkte diagnostische en therapeutische instrumenten om katten te behandelen en te identificeren die het risico lopen op deze verwoestende aandoening3.
Naast zijn rol in aangeboren immuniteit, neutrofielen is aangetoond dat een rol spelen in trombos....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of California, Davis. Necropsies en biopten van weefsels werden uitgevoerd met toestemming van de eigenaars.
1. Weefselfixatie, inbedding en doorsnede
- Ontleed de aortabifurcatie, met inbegrip van de dalende aorta, dijbeenslagader, en de gemeenschappelijke iliacale slagaders (Figuur 1A), kort na humane euthanasie of dood. Blunt ontleden de fascia (Figuur 1B) alvorens het volledig onder te dompelen in 10% neutraal gebuff....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van dit protocol voor deparaffinisatie, warmte-geïnduceerde antigen retrieval, en dubbele immunolabeling van paraffine-ingebedde trombi, identificeerden we NETs in katachtige CATE voor de eerste keer. Thrombi binnen de aortabifurcatie werden gelokaliseerd door fluorescentiemicroscopie en heldere veldmicroscopie met behulp van standaard H&E-kleuring en fasecontrastmicroscopie. Op heldere veldmicroscopie bestond katachtige arteriële trombi uit rode bloedcellen, leukocyten, fibrine en bloedplaatjes (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschrijven een protocol om NET's te identificeren in vaste katachtige cardiogene arteriële trombi met behulp van een dubbel immunolabelingprotocol en immunofluorescentiemicroscopie. Hoewel alleen cardiogene arteriële tromiale trombi werd gekleurd, in theorie dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten trombi en in andere diersoorten. Identificatie van NET's binnen katachtige arteriële trombi suggereert dat NET's een rol kunnen spelen bij trombose bij katten.
Detectie van NET's doo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De studie werd ondersteund door fondsen van de University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). De auteurs willen Dr. Kevin Woolard erkennen voor het gebruik van de fluorescentiemicroscoop.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin-conjugaat | ThermoFisher Scientific | Catalogusnr. S11227 | |
| Anti-gecitrullineerde histon H3-antilichaam | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objectief 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objectief 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objectief 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Geit anti-konijn Alexa Fluor 488-antilichaam | ThermoFisher Scientific | Catalogusnr. A32723 | |
| Geitenserum | Jackson Immuno Research Labs | Catalogusnr. NC9660079. Fabrieksartikelnr. 005-000-121 | |
| Neutrofiele elastase-antilichaam | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotine | Konijn polyklonaal antilichaam, geconjugeerd met biotine |
| NP40 | Pierce | Productnr. 28324. Batchnr. EJ64292 | |
| Positief geladen microscoopglaasjes | Thomas Scientific | Fabrieksnr. 1354W-72 | |
| Konijnenserum | Life Technology | Catalogusnr. 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescentie Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
Referenties
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
