Summary
Målet med denne artikel er at beskrive en raffineret metode til intubation af laboratoriemusen. Metoden er noninvasive og derfor ideel til undersøgelser, der kræver seriel overvågning af respiratorisk funktion og/ eller inddrypning af behandlinger i lungerne.
Abstract
Litteraturen beskriver flere metoder til museintubation, der enten kræver visualisering af glottis gennem mundhulen eller indsnit i ventralhalsen for direkte bekræftelse af kanyle placering i luftrøret. Den relative vanskelighed eller væv traumer induceret til emnet ved sådanne procedurer kan være en hindring for en investigators evne til at udføre langsgående undersøgelser. Denne artikel illustrerer en teknik, hvor fysisk manipulation af musen efter brug af en hårfjerning til at fjerne hår fra ventrale hals tillader transkutan visualisering af luftrøret for orotracheal intubation uanset grad af hud Pigmentering. Denne metode er uskadelig for emnet og let opnås med en begrænset forståelse af murine anatomi. Denne raffinerede fremgangsmåde letter gentagen intubation, som kan være nødvendig for at overvåge udviklingen af sygdom eller inddrypning af behandlinger. Ved hjælp af denne metode kan resultere i en reduktion af antallet af dyr og tekniske færdigheder, der kræves for at måle lungefunktion i musemodeller af luftvejssygdomme.
Introduction
Laboratoriemusen er en almindelig dyremodel for luftvejssygdomme hos mennesker. Således er der flere offentliggjorte metoder til museintubation med henblik på både inddrypning af behandlinger og måling af respiratoriske mekanik. De fleste af de beskrevne procedurer kræver visualisering af glottis gennem mundhulen med specialiseret udstyr såsom laryngoscope eller fiberoptisk lyskilde1,2,3,4,5,6,7. Dette kan dog være svært, når en relativt stor kanyle er påkrævet, da det kan skjule forskerens opfattelse. Limjunyawong et al.8 har behandlet denne bekymring med en metode til intubation, hvor en lille kutan snit er lavet langs midterlinjen af ventrale hals giver mulighed for visualisering af luftrøret. Efter proceduren lukkes snittet med vævsklæbemiddel.
For undersøgelser, der kræver hyppige gentagne intubationer, successive indsnit og lukning af dette websted kræver debridering af hudens margener og væv traumer til ventrale hals. Formålet med den transkutane trakeal visualisering tilgang til oral intubation er at give en raffineret, noninvasive teknik specielt egnet til gentagne intubation undersøgelser samt enkelt intubation begivenheder hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreaktiviteter, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra The Ohio State University og blev udført i AAALAC-akkrediterede faciliteter.
1. Forberedelse af proceduren
- Konstruere intubation platform. For at opnå den rette perronhældning skal du bruge en 3-binds3-ringbind med 3". Fold en 15−20 cm længde på 3-0 silke eller andet trådmateriale i halve og fastgør enderne af tråden til toppen af den skrå platform med tape for at skabe en affjedringsløkke (Figur 1).
- Vælg en kanyle af den passende størrelse og længde.
BEMÆRK: For en 20−30 g mus kan der anvendes et 2,5−3,8 cm langt kateter på op til 18 G. Til dette studie blev der anvendt 18 uger gamle kvindelige BALB/c og 10 uger gamle C57BL/6 mus (n = 3 af hver stamme). En uigennemsigtig hvid kateter kappe giver den bedste transkutane visualisering. - Skær en facet på kateterets distale spids, og glat den afskårne overflade med slibende papir for at skabe en afrundet skråspids. Lav forsigtigt en let bøjning i kanylen ca. 1 cm fra facetten (Figur 2).
BEMÆRK: Der skal anvendes et nyt kateter til hver mus. - Bedøve musen med ketamin (5,4 mg/g kropsvægt) og xylazin (16 μg/g kropsvægt) administreret intraperitonealt. Påfør steril oftalimic salve til øjnene.
BEMÆRK: Korrekt bedøvelsesdybde opnås ved manglende respons af musen til en fast tå knivspids. - Hæng musen i liggende stilling på intubationsplatformen ved at tilslutte de øverste fortænder omkring silketråden øverst på den vinklede overflade (figur 3). Når musen er helt og holdent placeret i rygrecumbency, forsigtigt gribe bunden af halen og trække halen mod bordet. Placer et stykke tape over bunden af halen for at sikre musen.
- Påfør depilatory creme (Tabel af materialer) til ventrale cervikale region for 30−45 s derefter fjerne alle hårfjerningscreme fra livmoderhalsen regionen ved hjælp af en tør gaze. Gentag ansøgningsprocessen, hvis det er nødvendigt. Skyl huden grundigt med saltvand eller destilleret vand for at fjerne eventuelle rester og tør den derefter af.
2. Intuberingsprocedure
- Brug lige, flade pincet i den ikke-dominerende hånd til forsigtigt at trække tungen tilbage på en måde, der i tilstrækkelig grad åbner munden for indførelse af kanyle.
BEMÆRK: Rottetandpincet bør ikke anvendes, da dette vil beskadige tungen. - Med den dominerende hånd, fremrykke kanylen ind i munden, således at enden, der er distalt til den lille bøje er mod taget af motivets mund.
- Slip tungen og skub den flade kant af de lukkede pincet ederly langs ventralhalsen, indtil manubrium er nået. Denne bevægelse sideværts fortrænger spytkirtlerne og flader musklen dækker luftrøret. Luftrøret fremstår transcutantøst som en hvid linje (Figur 3A). Hvis det er nødvendigt, rotere pincet i en kraniodorsal retning og samtidig opretholde spændinger på huden i en haleretning at forårsage sideværts fordrevne spytkirtler til at toppe. Denne manøvre skaber mere kontrast omkring luftrøret (Figur 3B).
BEMÆRK: Undgå overdreven kraft på vendhalsen, da det kan kollapse luftrøret og forringe vejrtrækningen. - Fremfør kanylen, mens samtidig lystfiskeri den distale spidsen af kanyle ventrally ved supination af den dominerende hånd med samtidig fleksion af håndleddet.
- Den korrekte placering af kanylen indikeres ved visualisering af den uigennemsigtige kanyle i luftrøret (figur 4B,D). Hvis kanylen er blevet fremrykket forbi niveauet af oprindelsen af massør musklen og visualisering af kanyle i luftrøret ikke er blevet bekræftet, trække kanylen og forsøge manøvren igen.
- Bekræft korrekt kanyle placering ved at forbinde en lunge inflation pære til kanylen og observere thorax ekspansion med samtidig edepression af enheden.
- Uden at fortrænge kanylen, forsigtigt løsne fortænder af musen fra intubation platform. Flyt musen til en vandret platform (Tabel af materialer) og indsæt kanylen til adapteren på ventilatoren. Efter den dybe inflation, ventilere musen i 60 s derefter måle respiratorisk modstand.
3. Inddrivelse
- Når proceduren er færdig, skal du flytte musen til en opvarmet platform. Giv konstant stimulering via lystå eller hale klemmer for at fremme spontan respiration.
- Extubation kan forekomme, når musen bare begynder at tygge. Tag fat i kanylen på navets niveau, og træk forsigtigt røret kranielt og væk fra musen, indtil kanylen er helt fjernet fra motivets mund.
BEMÆRK: Det er at foretrække at yde luftvejsstøtte med den stive kanyle så længe som muligt under genvindingsprocessen. - Når extubated, overføre musen til en ren opsving bur med varmestøtte. Løbende overvåge musen, indtil det er fuldt ambulant, og opsving et er afsluttet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seriel overvågning af baseline lungefunktion
18 uger gamle hun-BALB/c og 10 uger gamle C57BL/6-mus (n = 3 af hver stamme) blev intuberet ved hjælp af den beskrevne metode på dag 0, 3, 10 og 17. Efter intubation på hver dag, var emnet forbundet til en mekanisk ventilator forsynet med 100% ilt (Tabel af materialer). Respiratorisk modstand (Rrs) blev målt ved hjælp af den tvungne svingningsteknik i 60 s efter en dyb oppustning til 25 cm H2O holdt i 5 s. Ingen software fejl forbundet med denne vedvarende ånde hold sammen med Rrs værdier inden fysiologiske rækkevidde give yderligere støtte til korrekt placering af kanyle. Data viste ingen signifikante forskelle mellem målte Rrs observeret mellem tidspunkter inden for hver stamme (Figur 5). Det antages, at fraværet af en stigning i Rrs over tid indikerer manglende traume-associeret betændelse i åndedrætssystemet over fire på hinanden følgende tidspunkter.
Statistisk analyse
Beskrivende statistikker (middel- og standardfejl) blev beregnet ved hjælp af statistisk analysesoftware (Materialetabel). Kolmogorov-Smirnov-metoden blev brugt til at kontrollere den gaussiske datadistribution. Statistiske analyser af datasæt blev foretaget af uparret ANOVA, med en post hoc Tukey-Kramer multiple sammenligning post-test. Alle data præsenteres som gennemsnit ± SEM. P < 0,05 blev anset for statistisk signifikant.
Figur 1: Intubationsplatform. Intubationsplatformen består af et tre-ringbind med en løkke af silketråd, der klæbes til toppen af bindemidlet for at skabe en affjedringsløkke. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Præparation af kanylering. (A) Sideværts udsyn til den forberedte kanyle. Bemærk den blide vinkel, der er skabt ca. 1 cm fra den afrundede facet i kateterets distale ende og retningen af kanylvinklen i forhold til facetten. BB) Dorsoventral udsyn til den forberedte kanyle. Bemærk den afrundede og glattede kant af facetten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Luftrøralvisualisering. (A) Pincet er placeret på ventrale hals og huden er forsigtigt trukket caudally at sideværts fortrænge spytkirtlerne og give visualisering af luftrøret som en hvid struktur på ventralmidterlinjen (sort pil). (B) Craniodorsal rotation af pincet på ventrale hals skaber en fremspring af spytkirtlerne (*). Luftrøret er visualiseret som den hvide lineære struktur på ventralmidterlinje mellem spytkirtlerne (sort pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Korrekt kanyleplacering. (A) C57BL/6 mus placeret på intubationsplatformen med kanyle indført i det proksimale mundhulen. (B) C57BL/6 mus med kanyle korrekt placeret i luftrøret. Bemærk kanylen kan let visualiseres som den hvide struktur i luftrøret (hvid pil). CC) BALB/c-mus placeret på intubationsbrættet med kanyle indføring i det proksimale mundhulen. (D) BALB/c mus med kanyle korrekt placeret i luftrøret. Den hvide kanyle kan let visualiseres i luftrøret (sort pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Seriel måling af modstand. Der er ikke observeret signifikante forskelle mellem de målte Rrs mellem tidspunkter inden for hver stamme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intubation ved hjælp af den transkutane trakeal visualisering teknik tilbyder en raffineret tilgang til standard hud indsnit metode. Med særlig vægt på flere vigtige trin, kan intubation nemt og hurtigt opnås. Dyret skal placeres helt og holdent i rygrecumbency på intubationsplatformen med musen fastgjort i skånsom tilbagetrækning. Dette vil udvide dyret i lodret justering og korrekt positionering til intubation. Desuden bør hårfjerningscremen ikke forblive i kontakt med dyrets hud i længere tid end 30−45 sek. Udvidet hudkontakt med hårdug vil forårsage unødvendige smerter for dyret og ulcerationer kan hindre visningen af luftrøret9. Det er bydende nødvendigt at bruge den korrekte håndled bevægelse som den dominerende hånd introducerer kateteret i glottis. Den dominerende håndled skal bøje, mens hånden bevæger sig i en supination bevægelse. Det er også vigtigt at overvåge motivet nøje som den flade kant af pincet er presset på ventrale hals for at visualisere luftrøret. Tryk fra pincet vil okklude luftrøret og forårsage hypoxi, hvis opretholdes i en længere periode. Hvis patienten forekommer cyanotisk, tillade en kort pause for slimhinder at vende tilbage til en lyserød farve og for respiration at stabilisere før gentagne forsøg.
Omfattende mus intubation erfaring var ikke nødvendigt at udføre denne teknik. De mest almindelige komplikationer hos uerfarne personer omfatter larynx traumer og øvre luftveje betændelse på grund af flere intubation forsøg. Tæt overvågning er nødvendig under genopretningen af disse patienter, da medicinsk intervention med nonsteroide antiinflammatoriske midler kan være indiceret. Gentagne mislykkede intubationsforsøg kan resultere i vævstraumer og betændelse i det distale mundhulen, hvilket kan resultere i øvre luftvejsstøj, dyspnø, hypoxæmi, langvarig bedring, manglende evne til at udføre gentagen intubation eller død.
Flere ændringer anbefales i tilfælde af, at intubation ikke lykkes. Først skal du sørge for, at kanylens facet er glat, afrundet og skåret til den rette længde for dyrets størrelse. Facetkanten kan glattes ved hjælp af slibende papir for at minimere vævstraumer og lette intubation7. Kontroller desuden, at kanylen udviser en let kurve på ca. 15° i en tredjedel afstand fra facetten, og at spidsen af kanylen er skrå vinkel som beskrevet i Brown et al.6. Kontroller altid, at kateteret er i den rigtige retning før og under udførelsen af denne procedure.
Til denne undersøgelse blev mus intuberet til gentagne lungefunktionstest ved hjælp af et mekanisk ventilationssystem til registrering af lungefunktionsmålinger. En stor, 18 G kanyle blev brugt til at skabe en tæt forsegling. For at udføre gentagne lungefunktionsundersøgelser på mus med en mindre trakealdiameter på grund af alder eller stamme kan det være en udfordring at placere en større kanyle. Hvis en mindre kanyle vælges til brug, skal det sikres, at der stadig kan opnås en ordentlig forsegling, og at kanylens modstand ikke er højere end prøvepersonens luftvejsmodstand10. En vellykket dyb inflationsforstyrrelser er tilstrækkelig bekræftelse af en passende forsegling. Bemærk, at en sådan forsegling er unødvendig, hvis kun installation af behandlinger i lungerne ønskes.
Selv om den beskrevne metode har foretaget ændringer, der forhindrer ydre vævsskader, den øvre grænse for hyppigheden af intubation er stadig en funktion af kumulative traumer til glottis og luftrør på grund af overdreven indførelse af kanylen. Samtidig overvågning af en kontrolgruppe for betydelige stigninger i luftvejsresistens under en undersøgelse anbefales, da væv traumer er ledsaget af betændelse, der vil resultere i nedsat luminal diameter af luftrøret. Signifikante stigninger i luftvejsmodstanden i løbet af gentagne intubationsprocedurer blev ikke observeret i den nuværende undersøgelse. Mus forblev klinisk normale i forsøgsvarigheden, og bruttoobduktion af øvre luftvejsstrukturer var ikke bemærkelsesværdige ved undersøgelseskonklusionen hos alle dyr.
Sammenfattende tilbyder den beskrevne intubationsteknik en ikke-invasiv metode til placering af endotrakealkanyle med minimalt udstyr, herunder en skrå overflade, pincet, en polypropylenkanyle og depilatoriske forsyninger. Denne raffinerede metode muliggør gentagne intubation begivenheder uden tilbagevendende væv traumer og smerter forbundet med en kutan snit sted på ventralhals eller en tracheotomi procedure. Desuden reducerer denne metode antallet af mus, der kræves, da individuelle mus gentagne gange kan intuberes i løbet af en undersøgelse. Det eliminerer også behovet for specielt designede intubationsfastholdelsesanordninger, anvendelsesområdet eller transbelysningsudstyr til luftvejsvisualisering. BALB/c og C57BL/6 stammer blev anvendt i denne undersøgelse for at demonstrere teknikkens succes hos både lyse og mørke pigmenterede stammer og dyr i en relativt ung alder og lille størrelse (10−20 uger gamle mus). Denne raffinerede teknik er velegnet til enkelt eller gentagen intratrakeal instillation af forbindelser, bronchoalveolar lavage, billeddannelse eller lungefunktion test. Denne minimalt invasive, alsidige metode kan implementeres for stort set enhver procedure, der kræver adgang til de nedre luftveje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph og Lindsey Ferguson for deres tekniske bistand og University Laboratory Animal Resources for deres dyrepleje støtte. Dette arbejde er finansieret af NIH T35OD010977 og R01-HL102469.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179 (1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107 (2013).
