Summary
이 문서의 목적은 실험실 마우스의 정교한 삽관 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 비침습적이며, 따라서 호흡기 기능의 연속 모니터링 및 / 또는 폐로의 치료 의 주입을 필요로하는 연구에 이상적입니다.
Abstract
문헌은 기관에서 캐뉼라 배치의 직접적인 확인을 위해 구강 또는 복부 목에 절개를 통해 글로티스의 시각화를 필요로하는 마우스 삽관에 대한 몇 가지 방법을 설명합니다. 이러한 절차에 의해 피험자에게 유도된 상대적 어려움 또는 조직 외상은 종적 연구를 수행하는 조사자의 능력에 장애가 될 수 있다. 이 문서는 복부 목에서 모발을 제거하기 위해 제모를 사용한 후 마우스의 물리적 조작이 피부의 정도에 관계없이 orotracheal 삽관을 위한 기관의 경피적 시각화를 허용하는 기술을 보여줍니다. 착 색. 이 방법은 대상에 무해하고 쉽게 뮤린 해부학의 제한된 이해로 달성된다. 이 정제된 접근법은 질병의 진행을 모니터링하거나 치료의 주입을 모니터링하는 데 필요할 수 있는 반복적인 삽관을 용이하게 합니다. 이 방법을 사용하면 호흡기 질환의 마우스 모델에서 폐 기능을 측정하는 데 필요한 동물 및 기술 기술의 감소가 발생할 수 있다.
Introduction
실험실 마우스는 인간 호흡기 질환에 대한 일반적인 동물 모델입니다. 따라서, 치료 및 호흡 역학의 측정의 주입 모두를 목적으로 마우스 삽관에 대한 몇 가지 게시 된 방법이 있다. 기재된 절차의 대부분은 후두경 또는 광섬유 광원11, 2,23,34,4,5,,66,7과같은 특수 장비를 사용하여 구강을 통한 구강 을 통한 글로티스의 시각화가 필요합니다. 그러나, 이것은 상대적으로 큰 캐뉼라가 필요할 때, 연구원의 견해를 모호하게 할 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. Limjunyawong 등8은 작은 절단 절개가 기관의 시각화를 허용하는 복부 목의 중간선을 따라 이루어지는 삽관의 방법으로 이러한 우려를 해결했습니다. 절차에 따라 절개는 조직 접착제로 닫힙됩니다.
빈번한 반복된 삽관을 요구하는 연구 결과를 위해, 이 사이트의 연속적인 절개 및 폐쇄는 복부 목에 피부 여백 및 조직 외상의 신부전을 요구합니다. 경구 삽관에 대한 경피적 기관 시각화 접근법의 목적은 마우스에서 반복된 삽관 연구뿐만 아니라 단일 삽관 이벤트에 특히 적합한 정제된 비침습적 기술을 제공하는 것입니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 동물 활동은 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 AAALAC 공인 시설에서 수행되었습니다.
1. 절차 준비
- 삽관 플랫폼을 구성합니다. 적절한 플랫폼 경사를 달성하려면 3인치(7.6cm) 3링 바인더를 사용하십시오. 3-0 실크 또는 다른 스레드 재료의 15-20cm 길이를 반으로 접고 기울어진 플랫폼의 상단에 실의 끝을 테이프로 부착하여 서스펜션 루프를 만듭니다(그림 1).
- 적절한 크기와 길이의 캐뉼라를 선택합니다.
참고: 20-30g 마우스의 경우 1-1.5인치(2.5−3.8cm) 길이의 카테터를 최대 18G까지 사용할 수 있습니다. 본 연구를 위해, 18주령 암컷 BALB/c 및 10주된 C57BL/6 마우스(각 균주의 n=3)를 사용하였다. 불투명한 백색 카테터 칼집은 최상의 경피 적 시각화를 제공합니다. - 카테터의 말단 끝에서 경사를 자르고 연마용지로 절단된 표면을 부드럽게 하여 둥근 경사팁을 만듭니다. 경사에서 약 1cm 떨어진 캐뉼러에 약간의 굴곡을 부드럽게만듭니다(그림 2).
참고: 각 마우스에 새 카테터를 사용해야 합니다. - 케타민 (5.4 mg / g 체중)과 자일라진 (16 μg / g 체중)으로 마우스를 심상 으로 투여하여 마취시. 멸균 된 ophthalimic 연고를 눈에 바르고.
참고: 적당한 마테스테틱 깊이는 단단한 발가락 핀치에 마우스의 반응의 부족에 의해 달성됩니다. - 각진 표면의 상단에 있는 실크 실 주위의 상부 절개를 연결하여 삽관 플랫폼상의 척추 위치에서 마우스를 일시 중단합니다(그림3). 마우스가 등지 의 자세로 배치되면, 부드럽게 꼬리의 베이스를 잡고 테이블쪽으로 꼬리를 철회. 테이프 조각을 꼬리 밑면 위에 놓아 마우스를 고정합니다.
- 제모 크림(재료표)을복부 자궁 경부 부위에 30-45 s의 경우 마른 거즈를 사용하여 자궁 경부 부위에서 모든 제모 크림을 제거하십시오. 필요한 경우 신청 프로세스를 반복합니다. 식염수 나 증류수로 피부를 철저히 헹구어 잔여물을 제거한 다음 건조시하십시오.
2. 삽관 절차
- 캐뉼라의 도입을 위해 입을 충분히 여는 방식으로 혀를 부드럽게 후퇴시키기 위해 비지배적 인 손에 똑바로 평평한 집게를 사용하십시오.
참고: 쥐 치집이 혀를 손상시킬 수 있기 때문에 사용해서는 안됩니다. - 지배적 인 손으로 캐뉼라를 입안으로 전진시키면 약간의 굴곡에 말단이 피험자의 입의 지붕에 닿도록합니다.
- 혀를 풀어 내고 닫힌 집게의 평평한 가장자리를 복부 목에 따라 미끄러져 마누브리움에 도달 할 때까지 밀어 내십시오. 이 운동은 측면타액선을 변위시키고 기관을 덮는 근육을 평평하게 합니다. 기관선은 흰색 선으로 경피적으로 나타납니다(그림 3A). 필요한 경우, 캐그 방향으로 피부에 장력을 유지하면서 격노 방향으로 집게를 회전하여 측면 변위된 타액선이 최고조에 달하게 합니다. 이 기동은 기관 주위에서 더 많은 대비를 만듭니다(그림 3B).
참고: 기관을 붕괴시키고 호흡을 손상시킬 수 있으므로 복부 목에 과도한 힘을 피하십시오. - 동시에 손목의 동시 굴곡으로 지배적 인 손의 supination에 의해 캐뉼라의 원위 끝을 통풍구로 낚시하면서 캐뉼라를 진행합니다.
- 캐뉼라의 적절한 배치는 기관내의 불투명 캐뉼라의 시각화에 의해 표시됩니다(그림 4B, D). 캐뉼라가 매스터 근육의 기원 수준을 지나서 진행된 경우 기관내 캐뉼라의 시각화가 확인되지 않은 경우, 캐뉼라를 철회하고 기동을 다시 시도한다.
- 폐 인플레이션 전구를 캐뉼라에 연결하고 장치의 동시 우울증으로 흉부 확장을 관찰하여 적절한 캐뉼라 배치를 확인하십시오.
- 캐뉼라를 대체하지 않고 삽관 플랫폼에서 마우스의 앞니를 조심스럽게 풀습니다. 마우스를 수평플랫폼(재료 표)으로이동하고 캐뉼라를 인공호흡기의 어댑터에 삽입합니다. 깊은 인플레이션에 따라, 60 s에 대 한 마우스를 환기 다음 호흡 저항을 측정.
3. 복구
- 절차가 완료되면 마우스를 데운 플랫폼으로 이동합니다. 가벼운 발가락이나 꼬리 핀치를 통해 일정한 자극을 제공하여 자발적인 호흡을 장려하십시오.
- 마우스가 그냥 츄를 시작하면 절전이 발생할 수 있습니다. 허브 의 수준에서 캐뉼라를 잡고 캐뉼라가 피사체의 입에서 완전히 제거 될 때까지 튜브를 두개골에서 조심스럽게 당기고 마우스에서 멀리 당깁니다.
참고: 복구 과정에서 가능한 한 오랫동안 경질 캐뉼라와 함께 기도 지지체를 제공하는 것이 바람직하다. - 일단 방출되면, 열 지원깨끗한 복구 케이지에 마우스를 전송합니다. 마우스가 완전히 외래되고 복구가 완료될 때까지 마우스를 계속 모니터링합니다.
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Representative Results
기준선 폐 기능의 직렬 모니터링
18주령 암컷 BALB/c 및 10주령 C57BL/6 마우스(각 균주의 n=3)를 0일째, 3일, 10일 및 17일에 기재된 방법을 사용하여 삽관하였다. 매일 삽관에 이어, 피험자는 100%산소(재료표)를공급받은 기계식 인공호흡기에 연결하였다. 호흡 저항성(Rrs)은 5s에 대해 25 cmH2O로깊은 인플레이션을 따라 60s에 대한 강제 진동 기술을 사용하여 측정하였다. 생리적 범위 내의 Rrs 값과 함께 이 지속적인 호흡과 관련된 소프트웨어 오류는 캐뉼라의 적절한 배치에 대한 추가 지원을 제공합니다. 데이터는 각 스트레인 내의 시간 점 사이에서 관찰된 측정된 Rrs의 유의한 차이를 밝혀냈다(그림5). 시간이 지남에 따라 Rrs의 증가가 없는 것은 4개의 연속적인 시간 지점에 걸쳐 호흡기에 있는 외상 관련 염증에 부족을 나타낸다는 것을 가정합니다.
통계 분석
통계 통계(평균 및 표준 오차)는 통계 분석소프트웨어(재료 표)를사용하여 계산하였다. 콜모고로프-스미르노프 방법은 가우시안 데이터 분포를 확인하는 데 사용되었습니다. 데이터 세트의 통계 분석은 페어링되지 않은 ANOVA에 의해 이루어졌으며, 포스트 호크 투키-크라머 다중 비교 후 테스트가 이루어졌습니다. 모든 데이터는 평균 ±SEM. P P< 0.05로서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
그림 1: 삽관 플랫폼. 삽관 플랫폼은 서스펜션 루프를 만들기 위해 바인더의 상단에 부착 실크 스레드의 루프와 세 링 바인더로 구성되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 캐뉼라 준비. (A)준비된 캐뉼라의 측면 도면. 카테터의 말단에서 둥근 경사에서 약 1cm 를 생성하고 경사와 관련하여 캐뉼라 각도의 방향을 작성합니다. (B)준비된 캐뉼라의 도르소벤브랄 뷰. 경사의 둥글고 매끄러운 가장자리를 기록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기관 시각화. (A)집게는 복부 목에 배치되고 피부는 부드럽게 침샘을 변위시키고 복부 중간선 (검은 색 화살표)에 흰색 구조로 기관의 시각화를 제공하기 위해 caudally. (B)복부 목에 집게의 Craniodorsal 회전은 침샘의 돌출을 만듭니다 (*). 기관은 침 샘 (검은 색 화살표) 사이의 복부 중간선에 흰색 선형 구조로 시각화된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 적절한 캐뉼라 배치. (A)C57BL/6 마우스가 근위 구강 내로 유입된 캐뉼라와 함께 삽관 플랫폼에 위치하였다. (B)캐뉼라가 있는 C57BL/6 마우스를 기관에 제대로 넣습니다. 캐뉼라는 기관 내의 흰색 구조(흰색 화살표)로 쉽게 시각화할 수 있습니다. (C)BALB/c 마우스를 근위 구강 내로 유입된 캐뉼라와 함께 삽관 보드에 위치시켰다. (D)제대로 기관에 배치 캐뉼라와 BALB / c 마우스. 흰색 캐뉼라는 기관(검은 색 화살표) 내에서 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 저항의 직렬 측정. 측정된 Rrs의 유의한 차이는 각 스트레인 내의 시간 포인트 사이에서 관찰되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
경피 적 기관 시각화 기술을 사용하여 삽관은 표준 피부 절개 방법에 대한 세련된 접근 방식을 제공합니다. 몇 가지 주요 단계에 특별한주의를 기울여 삽관을 쉽고 빠르게 달성 할 수 있습니다. 동물은 부드러운 후퇴에 고정 된 마우스와 삽관 플랫폼에 등도 recumly에 정사각형으로 배치해야합니다. 이렇게 하면 동물을 수직 정렬과 삽관에 대한 적절한 위치로 확장합니다. 또한, 제모 크림은 30-45 s 이상 동물의 피부에 접촉하지 않아야하며 모든 잔류 물을 제거하기 위해 철저히 헹구어야합니다. 제모 크림과의 피부 접촉이 확대되면 동물에 불필요한 통증을 유발하고 궤양은 기관의 시야를 방해할 수 있습니다9. 지배적 인 손이 강변염에 카테터를 도입하기 때문에 적절한 손목 움직임을 사용하는 것이 필수적입니다. 지배적 인 손목은 손이 신의 움직임으로 움직이는 동안 구부러져야합니다. 또한 기관지를 시각화하기 위해 집게의 평평한 가장자리가 복부 목에 눌려있기 때문에 피사체를 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다. 집게에서 압력은 기관을 폐쇄하고 장기간 유지하면 저산소증을 일으킬 것입니다. 환자가 청색증으로 나타나면 점액 막이 분홍색으로 돌아오고 호흡이 반복되기 전에 안정화되도록 잠시 잠시 멈춥히십시오.
이 기술을 수행하기 위해 광범위한 마우스 삽관 경험이 필요하지 않았습니다. 경험이 없는 개별에 있는 일반적인 합병증은 다중 삽관 시도 때문에 후두 외상 및 상부 기도 염증을 포함합니다. 비스테로이드 항염증제에 의학적 개입이 표시될 수 있기 때문에 이러한 환자의 회복 중에 면밀한 모니터링이 필요하다. 반복적인 실패한 삽관 시도는 조직 외상 및 말단 구강의 염증을 초래할 수 있으며, 이는 상부 호흡 소음, 호흡 곤란, 저산소혈증, 장기간 회복, 반복적인 삽관 또는 사망을 수행할 수 없음을 초래할 수 있습니다.
삽관이 성공하지 못하는 경우 몇 가지 수정을 권장합니다. 첫째, 캐뉼라의 경사가 부드럽고 둥글며 동물의 크기에 적합한 길이로 절단되었는지 확인하십시오. 경사 가장자리는 연마 종이를 사용하여 매끄럽게 하여 조직 외상을 최소화하고 삽관을 용이하게 할 수 있습니다7. 또한, 캐뉼라가 경사로부터 1/3 거리에서 약 15°의 약간의 곡선을 나타내고 캐뉼라의 끝이 Brown etal.6에설명된 바와 같이 45° 각도로 경사진지 확인합니다. 이 절차를 수행하기 전과 동안 카테터가 적절한 방향에 있는지 항상 확인하십시오.
이 연구를 위해, 마우스는 폐 기능 측정을 기록하기 위하여 기계적인 환기 시스템을 사용하여 반복된 폐 기능 시험을 위해 삽관되었습니다. 18G의 대형 캐뉼라를 사용하여 단단한 밀봉을 만들었습니다. 나이 또는 긴장 때문에 더 작은 기관 직경을 가진 마우스에 반복 폐 기능 연구를 수행하기 위하여는, 더 큰 캐뉼라를 두는 것이 어려울 지도 모릅니다. 더 작은 캐뉼라가 사용하기 위해 선출되는 경우, 적절한 밀봉이 여전히 달성될 수 있는지 확인하고, 캐뉼라의 저항이 시험 대상자의기도(10)의저항보다 높지 않다는 것을 확인한다. 성공적인 깊은 인플레이션 교란은 적절한 인감의 적절한 확인입니다. 폐에 치료법만 설치하면 그러한 씰이 필요하지 않습니다.
기재된 방법은 외부 조직 손상을 방지하는 변형을 했지만, 관과증 의 빈도상한도는 여전히 캐뉼라의 과도한 도입으로 인한 글로티스 및 기관에 누적된 외상의 기능이다. 연구 도중 기도 저항에 있는 중요한 증가를 위한 대조군의 동시 감시는 조직 외상이 기관의 감소된 발광 직경 귀착될 염증을 동반하기 때문에 추천됩니다. 반복된 삽관 절차의 과정을 통해 기도 저항에 있는 중요한 증가는 현재 연구 결과에서 관찰되지 않았습니다. 마우스는 연구 기간 동안 임상적으로 정상으로 남아 있었고 상부 기도 구조의 총 부검은 모든 동물에서 연구 결론에서 주목할 만한 것이 아니었다.
요약하면, 설명된 삽관 기술은 경사진 표면, 집게, 폴리프로필렌 캐뉼라 및 제모 공급을 포함한 최소한의 장비로 내포성 캐뉼라를 배치하는 비침습적 방법을 제공한다. 이 정제 된 방법은 복부 목이나 기관 절개 절차에 있는 절단 부위와 관련된 재발하는 조직 외상 및 고통없이 반복된 삽관 이벤트를 가능하게 합니다. 또한, 이 방법은 개별 마우스가 연구 과정 전반에 걸쳐 반복적으로 삽관될 수 있기 때문에 요구되는 마우스의 수를 감소시킨다. 또한 기도 시각화를 위해 특별히 설계된 삽관 구속 장치, 범위 또는 트랜스 일루미네이팅 장비의 필요성을 제거합니다. BALB/c 및 C57BL/6 균주는 비교적 어린 나이와 작은 크기의 밝고 어두운 색소 균주와 동물 모두에서 기술 성공을 입증하기 위해 이 연구에서 사용되었습니다(10-20주령 마우스). 이 정제 된 기술은 화합물, 기관지 용포 세척, 이미징 또는 폐 기능 검사의 단일 또는 반복된 경화에 적합합니다. 이 최소 침습, 다재 다능 한 방법은 하부 호흡기에 대한 액세스를 필요로하는 거의 모든 절차에 대해 구현 될 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자들은 루시아 로사스, 로렌 두리틀, 리사 조셉, 린지 퍼거슨의 기술 지원과 동물 보호 지원을 위한 대학 실험실 동물 자원에 감사드립니다. 이 작품은 NIH T35OD010977 및 R01-HL102469에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
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- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
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- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179 (1999).
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