Summary
プロトコルは、膀胱、前立腺、性器、骨、筋肉および足の皮膚を含むマウス下半身の上皮灌流に記載されている。
Abstract
エクスビボ灌流は、孤立した器官(例えば肝臓、腎臓)の機能を研究するための重要な生理学的ツールである。同時に、マウス器官のサイズが小さいため、骨、膀胱、皮膚、前立腺、生殖器官のエクスビボ灌流は困難であるか、または実現不可能である。ここでは、上記組織を含むマウスの下半身灌流回路を初めて報告するが、主なクリアランス器官(腎臓、肝臓、脾臓)をバイパスする。この回路は、腸骨動脈および静脈の上の腹部大動脈および下大静脈をカニューララットし、末梢血管を焼灼することによって確立される。灌流は、パーフューズン流を最大2時間維持した蠕動ポンプを介して行われる。蛍光レクチンおよびHoechst溶液によるその際の染色では、マイクロバスキュアチュアが正常に浸透していることを確認した。このマウスモデルは、病理学的プロセス、および薬物送達のメカニズム、腫瘍への循環腫瘍細胞の移動/転移、および浸透した器官および組織との免疫系の相互作用を研究するのに非常に有用なツールとなり得る。
Introduction
孤立した臓器灌流は、もともと移植のための臓器生理学を研究するために開発された11、2、3、2,3そして他の身体システムからの干渉なしに器官の機能の理解を可能にした。例えば、単離した腎臓および心臓灌流は、血行力学の基本原理および血管活性剤の効果を理解するのに非常に有用であったが、肝臓灌流は、健康および疾患組織44、5、6、75,6,7における薬物代謝を含む代謝機能を理解する上で重要であった。さらに、移植を目的とした臓器の生存率と機能を理解する上で、灌流研究は重要であった。癌研究では、単離された腫瘍灌流は、マウス、ラット、および新たに切除されたヒト組織88、99を用いていくつかのグループによって説明されている。いくつかの単離された腫瘍灌流では、腫瘍を卵巣脂肪パッドに移植し、腸間動脈10から血管を供給する腫瘍の成長を強制する。Jainグループは、結腸腺癌の単離灌流を用いて、腫瘍血球力学および転移88、11、12、13を理解するための先駆的な研究11,12を行った。他の革新的な工学的なex vivoのセットアップは、主要なヒト多発性骨髄腫細胞14を培養する96ウェルプレートベースの灌流装置および骨髄アーキテクチャおよび機能研究15を工学用のモジュラー流動室を含む。
生理学と病理研究に加えて、臓器灌流は薬物送達の基本原理を研究するために使用されてきた。したがって、1つの群は、単離されたラット四肢灌流を説明し、移植肉腫16におけるリポソームの蓄積を研究し、別の群は解剖されたヒト腎臓灌流を行い、ナノ粒子17の内皮標的化を研究した。Ternulloら. 単離された浸透ヒト皮膚フラップを近い生体内皮膚薬物浸透モデル18として使用した。
大きな臓器や組織の灌流におけるこれらの進歩にもかかわらず、マウスのsitu灌流モデルでは、a)肝臓、脾臓、腎臓などのクリアランス器官をバイパスするという報告はありません。b)骨盤臓器、皮膚、筋肉、生殖器官(男性)、膀胱、前立腺および骨髄が含まれる。これらの器官のサイズが小さく、脈管構造を供給するため、エキソビボカヌラ化および灌流回路の確立は実現不可能であった。マウスは、がんや免疫学の研究、および薬物送達において最も重要な動物モデルです。小さなマウス器官を穿フューズする能力は、骨盤に移植された腫瘍(膀胱、前立腺、卵巣、骨髄)を含むこれらの器官への薬物送達に関する興味深い質問を答えることを可能にし、これらの器官の疾患の基礎生理学および免疫学の研究を可能にする。この欠乏に対処するために、我々は、潜在的に組織損傷を回避することができ、単離された臓器灌流よりも機能的研究にはるかに適しているマウスのsitu灌流回路を開発した。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、コロラド大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 灌流システムを予熱する
- 図1Aのカスタマイズされた構成に示すように、すべての水ジャケット部品(パーフューズ貯留槽、湿潤チャンバー、および蓋)に対して37°C循環水浴を開始することにより、手術前に灌流システムを準備する。チューブが清潔であることを確認し、必要に応じて交換してください。パーフューズ量を制限するには、湿潤チャンバ内の気泡トラップをパーフューズト貯留層として使用する(図1B-6)。
2. 血管カテーテル法
- イゾフルランの獣医麻酔装置を使用して8-10週齢のBALB/cマウスで麻酔を誘発し、3~5%のイゾフルランと酸素流量を0.3 L/minで行います。代わりに、ケタミン/キシラジンまたは腹腔内麻酔の他のタイプを使用してください。2つの方法で麻酔の深さを評価する:つま先ピンチと角膜反射。
- 4-0シルク縫合糸を針で二重蒸留水にプレウェットします。
- 麻酔マウスを外科医に向けた発泡スチロールボード上の上の上の上の上の上に置き、前肢と後肢をテープで固定します。イソプロピルアルコールで腹部を拭き、中線に沿って腹部をハサミで「T」の形で切ります。電気凝固(焼灼)によって切開の縁の周りの出血を止める。
- 腹部の右側に胃、よく、そして大腸、結腸を押して腹部大動脈、大静脈、そして一般的な腸骨およびイリオルバール動脈および静脈を明らかにする。
- 解剖顕微鏡の下で、4-0シルク縫合糸を使用して、男性のイリオルバール動脈/静脈、および卵巣動脈/静脈および女性のイリオルバール動脈/静脈を見つけてリゲートする(図2 黄色の線)。
- 解剖顕微鏡の下で、腹部大動脈と下の大静脈の下に2つの4-0シルク縫合糸をループし(腸骨動脈と静脈の上に約1cm、1mm離れて図 2)、腸骨血管に最も近い縫合糸で緩い結び目を作ります(図2、白い点線)。あるいは、この結び目には6-0シルク縫合糸を使用できます。
- 解剖顕微鏡の下で、下の大静脈と腹部大動脈の両方をポルト・エギーユで水平に整列させ、伸ばします。24 Gの翼を持つシールドI.V.カテーテルを使用して腹部大動脈を穿刺し、ボタンを押して針のコアを引っ込み、約5mmのカテーテルを容器に挿入します。
- 下の大静脈で同じ手順を繰り返し、カテーテル化された血管の周りに両方の縫合糸の結び目を結びます。
注:針は血管を通して簡単に穿刺することができます。したがって、血管を伸ばし、針を血管と平行に保ちます。針が約1mmを血管に貫通するとすぐに針の芯を引き込みます。腹部大動脈は、下の大静脈の下にあり、結合組織に包まれるため、はるかに薄く、より弾力性があります。したがって、大オルタはカテーテルに「つかまり」、したがって、カテーテルが抜け出す可能性を減らすために、静脈の前にカテーテル化する必要があります。
- 下の大静脈で同じ手順を繰り返し、カテーテル化された血管の周りに両方の縫合糸の結び目を結びます。
- 即座に接着剤を塗布して、カテーテルを勃起脊髄に固定し、腹部の器官を交換し、麻酔を維持しながら手術を終了します。
注:腹腔に完全に交換することができない臓器は、灌流プロセス中に灌流媒体で定期的に湿らせなうます。
3. 灌流システムのセットアップ
- シリコンパッド上の37°Cにプリウォームされた水ジャケット湿ったチャンバーにマウスを移し、カテーテルの翼を19Gの針でパッドに固定します。
- 動脈カテーテルの端(入口)に、前温灌流バッファー(リンガーの乳酸溶液に5%BSAを補う)を充填し、スクリューオンコネクタを使用してカテーテル端を入口灌流チューブと接続します(図1B、赤矢印)。
注:コネクタに止血鉗子を持ち、カテーテルを動かさないようにテープでチューブを固定します。 - 蠕動流量を0.6 mL/minに調整し、灌流流出(図1B、青矢印)を5〜10分間放入して静脈カテーテルを通して血液を洗い流します。出口のカテーテルにはいくつかの血栓がある。灌流回路を閉じる前に、パーフューズドバッファーで血栓を洗い流してください。
- ねじコネクタを使用して、静脈カテーテルの端部をコンセントのチューブに接続して回路を閉じます(図1B)。この時点で、CO2ガス安楽死を行い、胸部穿刺またはその他の方法で検証する。
- 湿った部屋を温めた蓋で覆います。定期的に透過性のレベルを確認し、必要に応じてさらに追加します。灌流は、最大2時間行うことができる。
注:閉じた灌流システムを設定するには、5 mLのパーフューズが必要です。漏れや浮腫がない場合、パーフューズの体積は1mL未満減少し、追加のバッファは必要ありません。末梢循環血栓によって誘発される浮腫を避けるために、0.002%ヘパリンを含む灌流バッファーは、灌流の最初の10分間に使用することができるが、切開部の端部での漏れを避けるためにヘパリンなしで緩衝液に変更すべきである。 - 必要に応じて、任意の時点で灌流リザーバーまたは注入口に選択した試薬を追加します(図1B-5)。例えば、10 mg/mL Hoechst33342の10 μLをパーフューズに加えて、灌流終了の2時間前に細胞核を染色することができ、または1 mg/mL DyLight 649-レクチンの50 μLを透過の終わりの30分前に血管内皮細胞を染色する。
注:Hoechst溶液で骨髄を染色しようとする場合、マウスは手術の30分前に事前注射する必要があります。 - 蛍光試薬を灌流した後、さらに10分間、灌流バッファーで洗い流し、バックグラウンド蛍光を最小限に抑えます。
4. 浸透器官の解析
- 精巣、前立腺、膀胱、大腿骨、筋肉、皮膚(例えば、足)を含む器官を収集する。約1mm3 のオルガンを物品切りし、2枚のガラススライドの間で平らにします。
- DAPI/Cy5励起および発光フィルターを用いた反転蛍光共焦点顕微鏡(励起レーザー:DAPI、405 nm;Cy5,640 nm)。0.45の数値絞りを使用して、少なくとも200倍の倍率の目的を使用してください。
- あるいは、24時間4%ホルムアルデヒド溶液で器官を固定し、ヘマトキシリン-エオシン染色19を行う。
- 無傷の骨髄観察のための骨窓を作成するには、大腿骨または脛骨の両端を固定し、骨膜を露出させるために19G針の横端で皮質骨を削り取る。残留骨の薄い層を保つように注意してください。上述したようにDAPIおよびCy5チャネルを用いた反転蛍光共焦点顕微鏡でガラスと画像に面した窓とのカバースリップに骨を置きます。骨髄腔内の細胞および血管ネットワークは容易に観察することができる。
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Representative Results
10mL未満の灌流緩衝液の体積を保ちながら、8~10週齢マウスの腹部大動脈と下の大静脈のカヌレーションを通じて閉回路灌流システムを設置しました。 図3A は、Hoechst 33342およびDyLight 649-レクチンを含むリンガーの溶液で組織を浸透した後の共焦点画像を示す。筋肉、骨髄、精巣、膀胱、前立腺、足の皮膚は、効率的な核および血管染色を示す。 図3B は、ノルマンサーム灌流の3時間後の臓器のヘマトキシリン-エオジン染色を示す。
図 1.単純化された灌流のセットアップ。(A)システムは(1)圧力/流量コントローラ、(2)循環加熱水浴、(3)加熱カバーとカスタム発泡スチロールスペーサーを備えた加熱湿潤室、および(4)蠕動ポンプを含む。(B)灌流回路は、注入口(赤線)および出口(青線)、(5)注入ポート及び(6)カスタマイズされた灌流貯留器を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.雄マウスと雌マウスにおける連結血管およびカニュール血管の位置 血管の概略を示すために、1%のエバンスブルー染料の5μL/kgを灌流の終わりの30分前に灌流媒体に加えた。雌マウスでは、イリオルバールと卵巣動脈および静脈の両方が結紮される。雄マウスでは、イリオルバール動脈と静脈が連結される。黄色と白の線は、結紮結び目のおおよその位置を示します;黄色の矢印は、実際の縫合糸とノットを示します。静脈および動脈のカテーテルの両方が挿入される。腸はデモンストレーション目的で取り除かれました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.共焦点およびH&Eの画像は明らかなティッシュの傷害なしで3時間の器官の正常な潅流を示す。 共焦点スケールバー:骨髄用20μm、他の臓器用100μm。H&Eスケールバー:100 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載された回路は、様々な研究問題、例えば薬物送達における異なる血清成分および組織障壁の役割、または免疫および幹細胞の密売を調査するために使用することができる。異なる薬物送達システム(例えば、リポソームおよびナノ粒子)は、送達における生理学的および生化学的要因の役割を理解するためにパーフューザートに添加することができる。灌流の持続時間は、研究された組織、科学的目標、およびパーフューズトの組成によって異なる場合があります。ここでは、乳酸とアルブミンを用いたリンガーの溶液からなる基本的な灌流媒体を用いて、最大2時間の灌流の結果を提示する。本研究の目的は、最適な臓器/組織機能と酸素化をサポートするために、灌流媒体や条件を開発し最適化するのではなく、灌流回路を確立することであった。栄養素、ビタミン、ホルモン、および血液細胞の添加は、前の文献で広範囲に調査されており、ヒトおよび動物組織の研究論文の数十に記載されている多くの灌流メディアと酸素化プロトコル7、99、10、11、12、13、16、17、20、21。,11,12,13,16,17,20,21温風組成物の改良と酸素化は、体温における組織代謝の長期的な維持を可能にする。したがって、いくつかのグループは、赤血球および血液酸素化を使用し、これは感受性組織17の生存率を大幅に向上させる。灌流制御も高度にカスタマイズ可能です。必要に応じて、酸素化および圧力圧力計を制御するガスマニホールドを加えることができる。さらに、より大きなパーフューズトチャンバーを使用することができ、かつ、このような圧力、温度、および流量などの生理学的パラメータは、コンピュータによって制御することができます。
灌流回路にはいくつかの制限があります。雌マウスの子宮と卵巣は、卵巣動脈と静脈の結紮のために浸透することができなかった。また、精巣の灌流は不完全であり、おそらく灌流回路に含まれていない代替血液供給によるものであった。
十分な練習によって、cannulationのプロシージャは80%以上の成功率の20-30分の内で行うことができる。成功率は、ステップ2.7で説明したように、船を穿刺することなく大大静脈と静脈をカンニュールする能力に大きく依存します。手術領域の組織や小血管への損傷を最小限に抑えることが重要です。ステップ2.5では、まずは必ず動脈を穿刺し、カテーテルが引き抜かないように注意を要する。ステップ3では、カテーテルの端をチューブに接続する際に、針を動かさないように、ポート・エギーユを使用してカテーテルをしっかりと保持してください。血圧は流量に直接比例する;したがって、パーフューザートの流量は、生理学的圧力を維持するために0.6 mL/minより低くなければなりません。最後に、これは微小血管系の灌流を改善するので、灌流回路が閉じられるまで心拍を維持することが好ましい。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、DS、スカッグス薬学部ADR種子助成金プログラム(DS)にNIH助成金CA194058によってサポートされました。中国国立自然科学財団(グラント31771093)、吉林省国際協力プロジェクト(No.201180414085GH)、中央大学基礎研究基金、JLU科学技術革新的研究チームプログラム(2017TD-27、2019TD-36)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
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