Summary
गेहूं के अनाज मेटाबोलाइट्स और लिपिड के अलक्षित विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। प्रोटोकॉल में सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड में अधिग्रहण के साथ एक एसीटोनिट्रिल मेटाबोलाइट निष्कर्षण विधि और रिवर्स्ड चरण तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री पद्धति शामिल है।
Abstract
जीन, पर्यावरण और कृषि अभ्यास में प्रबंधन के बीच बातचीत को समझना अधिक सटीक भविष्यवाणी और उत्पाद उपज और गुणवत्ता के प्रबंधन की अनुमति सकता है । मेटापोलोमिक्स डेटा समय में किसी दिए गए क्षण में इन बातचीत को पढ़ने का प्रावधान करता है और किसी जीव की जैव रासायनिक स्थिति की जानकारीपूर्ण है। इसके अलावा, व्यक्तिगत मेटाबोलाइट्स या मेटाबोलाइट्स के पैनलों का उपयोग उपज और गुणवत्ता भविष्यवाणी और प्रबंधन के लिए सटीक बायोमार्कर के रूप में किया जा सकता है। पौधे मेटाबोलोम में विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों के साथ हजारों छोटे अणुओं को शामिल करने की भविष्यवाणी की गई है जो शारीरिक लक्षणों और बायोमार्कर खोज में जैव रासायनिक अंतर्दृष्टि के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं। इसका फायदा उठाने के लिए, मेटापोलोमिक्स शोधकर्ताओं के लिए एक प्रमुख उद्देश्य एक ही विश्लेषण के भीतर यथासंभव भौतिक रासायनिक विविधता को कैप्चर करना है। यहां हम खेत में उगाए गए गेहूं के अनाज के विश्लेषण के लिए एक तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित अलक्षित मेटापोलोमिक्स विधि प्रस्तुत करते हैं। विधि एक तिहाई मोबाइल चरण शुरू करने के लिए तरल क्रोमेटोग्राफ क्वाटरनेरी सॉल्वेंट प्रबंधक का उपयोग करती है और एक लिपिड-उत्तरदायी ढाल के साथ एक पारंपरिक रिवर्स-चरण ढाल को जोड़ती है। अनाज तैयार करना, मेटाबोलाइट निष्कर्षण, वाद्य विश्लेषण और डेटा प्रसंस्करण कार्यप्रवाह का विस्तार से वर्णन किया गया है। अच्छी मास सटीकता और सिग्नल प्रजनन क्षमता देखी गई, और विधि ने आयनीकरण मोड प्रति लगभग 500 जैविक रूप से प्रासंगिक विशेषताएं प्राप्त कीं। इसके अलावा, गेहूं की किस्मों के बीच काफी अलग मेटाबोलाइट और लिपिड फीचर सिग्नल निर्धारित किए गए थे।
Introduction
कृषि में जीन, पर्यावरण और प्रबंधन प्रथाओं के बीच बातचीत को समझना उत्पाद उपज और गुणवत्ता के अधिक सटीक भविष्यवाणी और प्रबंधन की अनुमति दे सकता है । पौधे मेटाबोलाइट्स जीनोम, पर्यावरण (जलवायु, वर्षा आदि) जैसे कारकों से प्रभावित होते हैं, और कृषि सेटिंग में, जिस तरह से फसलों का प्रबंधन किया जाता है (यानी, उर्वरक, कवकनाशक आदि का अनुप्रयोग)। जीनोम के विपरीत, मेटापोलोम इन सभी कारकों से प्रभावित होता है और इसलिए मेटापोलोमिक्स डेटा एक विशेष समय में इन बातचीत का एक जैव रासायनिक फिंगरप्रिंट प्रदान करता है। आमतौर पर मेटाबोलोमिक्स-आधारित अध्ययन के लिए दो लक्ष्यों में से एक होता है: सबसे पहले, जीव के जैव रसायन की गहरी समझ प्राप्त करने के लिए और शरीर विज्ञान के संबंध में क्षोभ (एबायोटिक या बायोटिक तनाव) के प्रति प्रतिक्रिया के तंत्र को समझाने में मदद करता है; और दूसरा, अध्ययन के तहत क्षोभ के साथ बायोमार्कर को संबद्ध करने के लिए। दोनों ही मामलों में, इस ज्ञान होने का परिणाम बेहतर उपज आकार और गुणवत्ता के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक अधिक सटीक प्रबंधन रणनीति है ।
पौधे के मेताबोलोम में विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों के साथ हजारों1 छोटे अणुओं के शामिल होने की भविष्यवाणी की गई है। वर्तमान में, कोई मेटापोलोमिक्स प्लेटफॉर्म (मुख्य रूप से द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी) एक ही विश्लेषण में पूरे मेटापोलोम को कैप्चर नहीं कर सकता है। इस तरह की तकनीकों (नमूना तैयारी, मेटाबोलाइट निष्कर्षण और विश्लेषण) का विकास करना, जो एक विश्लेषणात्मक रन के भीतर संभव के रूप में मेटाबोलोम का एक बड़ा कवरेज प्रदान करता है, मेटापोलोमिक्स शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण उद्देश्य है। गेहूं के अनाज के पिछले अलक्षित मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण ों में कई क्रोमेटोग्राफिक अलगाव और अधिग्रहण ध्रुवीकरण और/या अधिक मेटापोलोम कवरेज के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन से संयुक्त डेटा है । हालांकि, इसके लिए प्रत्येक तौर-तरीकों के लिए अलग से नमूने तैयार करने और प्राप्त करने की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, बेलेगिया एट अल2 ने नॉनपोलर एनालिट्स के जीसी-एमएस विश्लेषण के अलावा ध्रुवीय विश्लेषणों के जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए एक व्युत्पन्न नमूना तैयार किया। दास एट अल3 ने अपने विश्लेषण ों में कवरेज में सुधार करने के लिए जीसी और एलसी-एमएस दोनों तरीकों का उपयोग किया; हालांकि, इस दृष्टिकोण को आम तौर पर ऊपर वर्णित अलग नमूना तैयारी के साथ-साथ दो स्वतंत्र विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों की आवश्यकता होगी। जीसी-एमएस2,3,3,4 और एलसी-एमएस3,,5 प्लेटफार्मों का उपयोग करगेहूं अनाज के पिछले विश्लेषणों में जीसी-एमएस के लिए ५० से ४१२ (५५ की पहचान) विशेषताएं, संयुक्त जीसी-एमएस और एलसी-एमएस के लिए ४०९ और एलसी-एमएस लिपिडोमिक्स विश्लेषण5के लिए कई हजार मिले हैं । एक ही विश्लेषण में कम से कम दो मोड के संयोजन से, विस्तारित मेटापोलोम कवरेज को बनाए रखा जा सकता है, जैविक व्याख्या की समृद्धि में वृद्धि करते हुए समय और लागत दोनों में बचत की पेशकश भी की जा सकती है।
रिवर्स-चरण क्रोमेटोग्राफी द्वारा लिपिड प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के कुशल पृथक्करण की अनुमति देने के लिए, आधुनिक लिपिडोमिक्स पद्धतियां आमतौर पर एल्यूशन सॉल्वेंट6में आइसोप्रोपेनॉल के उच्च अनुपात का उपयोग करती हैं, लिपिड कक्षाओं को एमेनेबिलिटी प्रदान करती हैं जो अन्यथा क्रोमेटोग्राफी द्वारा अनसुलझे हो सकती हैं। एक कुशल लिपिड जुदाई के लिए, शुरुआती मोबाइल चरण विशिष्ट उत्क्रमित चरण क्रोमेटोग्राफिक विधियों की तुलना में कार्बनिक संरचना7 में भी बहुत अधिक है, जो अणुओं के अन्य वर्गों पर विचार करते हैं। ढाल की शुरुआत में उच्च कार्बनिक संरचना इन तरीकों को अणुओं के कई अन्य वर्गों के लिए कम उपयुक्त बनाती है। सबसे विशेष रूप से, उलट चरण तरल क्रोमेटोग्राफी एक बाइनरी सॉल्वेंट ग्रेडिएंट को रोजगार देता है, जो ज्यादातर जलीय संरचना से शुरू होता है और कार्बनिक सामग्री में वृद्धि करता है क्योंकि क्रोमेटोग्राफी की एल्यूशन ताकत बढ़ जाती है। इस उद्देश्य के लिए, हमने एक ही विश्लेषण के भीतर मेटाबोलाइट्स के लिपिड और गैर-लिपिड दोनों वर्गों को अलग करने के लिए दो दृष्टिकोणों को संयोजित करने की मांग की।
यहां, हम एक क्रोमेटोग्राफिक विधि प्रस्तुत करते हैं जो तीसरे मोबाइल चरण का उपयोग करता है और एक एकल नमूना तैयारी और एक विश्लेषणात्मक स्तंभ का उपयोग करके एक संयुक्त पारंपरिक उलट चरण और लिपिडोमिक्स-उपयुक्त क्रोमेटोग्राफी विधि को सक्षम बनाता है। हमने कई गुणवत्ता नियंत्रण उपायों और डेटा फ़िल्टरिंग चरणों को अपनाया है जिन्हें पहले मुख्य रूप से नैदानिक मेटापोलोमिक्स अध्ययनों में लागू किया गया है। ये दृष्टिकोण उच्च तकनीकी प्रजनन क्षमता और जैविक प्रासंगिकता के साथ मजबूत सुविधाओं का निर्धारण करने में उपयोगी हैं और उन मानदंडों को पूरा नहीं करने वालों को शामिल नहीं करते हैं जो इन मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं। उदाहरण के लिए, हम पूल किए गए क्यूसी नमूने8,क्यूसी सुधार9,डेटा फ़िल्टरिंग9,,10 और लापता सुविधाओं के आरोपण के दोहराने के विश्लेषण का वर्णन करते हैं11।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
यह विधि 30 नमूनों (प्रति नमूना लगभग 150 बीज) के लिए उपयुक्त है। यहां दस विभिन्न क्षेत्रों में उगाई गई गेहूं की किस्मों की तीन जैविक प्रतिकृतियों का उपयोग किया गया ।
1. अनाज की तैयारी
- -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से नमूने (साबुत अनाज) पुनः प्राप्त करें।
नोट: बीज ों के फ्रीज सुखाने की सिफारिश फसल के तुरंत बाद की जाती है यदि कई मौसमों से नमूने एकत्र किए जा रहे हैं। यह मेटाबोलाइट एकाग्रता में किसी भी परिवर्तन को कम करता है जो भंडारण की अलग-अलग अवधि के बाद हो सकता है। ऐसा करने के लिए, बीज को 15 mL प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब (लगभग 300 बीज ट्यूब भर देंगे) में स्थानांतरित करें और एल्यूमीनियम पन्नी से कवर करें। एक पिन का उपयोग करके दो-तीन बार पन्नी को छेदें और रात भर (लगभग 24 घंटे) साबुत अनाज को सुखा लें। नमूने या तो इस स्तर पर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर वापस किए जा सकते हैं या अगला कदम चलाया जा सकता है। - 20 एस के लिए उच्च मोड पर दो रन के लिए एक प्रयोगशाला ब्लेंडर का उपयोग कर बीज पीसलें ।
नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले ब्लेंडर को ब्लेंडर को ब्लेड ऊंचाई तक भरने और अपेक्षाकृत समरूप रूप से जमीन अनाज का नमूना देने के लिए न्यूनतम लगभग 150 बीजों की आवश्यकता होती है। - आधार से ब्लेंडर निकालें और नमूने की सतह पर किसी भी मोटे जमीन अनाज लाने के लिए ब्लेंडर के किनारे टैप करें। मोटे सामग्री को त्यागया या संग्रहीत किया जा सकता है।
- पाउडर की तरह बारीक जमीन सामग्री ब्लेंडर से एक 2 मिलीआर प्लास्टिक माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
नोट: ब्लेंडर को डिओनाइज्ड पानी से धोएं और नमूनों के बीच एलसी-एमएस-ग्रेड मीओएच के साथ कुल्ला करें। सुनिश्चित करें कि ब्लेंडर अगले नमूने पर आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से सूखा है। - फ्रीजर के लिए पतले जमीन अनाज के नमूने वापस या अगले कदम (मेटाबोलाइट निष्कर्षण) के लिए आगे बढ़ना ।
2. निष्कर्षण सॉल्वेंट की तैयारी
नोट: निष्कर्षण के प्रदर्शन के रूप में एक ही दिन पर निष्कर्षण विलायक तैयार करते हैं ।
- प्रत्येक मानक के 1 मिलीग्राम/मीटर के कम से कम 2 मिलीग्राम तैयार करें। 2-अमीनोएंथ्रेसीन, मिकोनाजोल और डी6-ट्रांससिनेमिक एसिड तैयार करने के लिए एसीटोनिट्रिल (एसीएन) का उपयोग करें। 13सी 6 - स्कक्षतैयार करने के लिए पानीकाउपयोग करें।
- प्रत्येक 1 मिलीग्राम/mL मानक के 2 mL ले लो और एक १०० mL volumetric फ्लास्क में जोड़ें ।
- एसिटोनिट्रिल के साथ लाइन में वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क भरें। सुनिश्चित करें कि एसीटोनिट्रिल के 100 मीटर में प्रत्येक आंतरिक मानकों में से 20 μg/mL शामिल हैं: 2-अमीनोएंथ्रेसीन, मिकोनाजोल, 13सी6-सोर्बिटोल, डी6-ट्रांससिनेमिक एसिड।
3. मेटाबोलाइट निष्कर्षण
- 200 मिलीग्राम बारीक जमीन के अनाज का वजन 2 मिलीग्राम माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में करें।
- 200 मिलीग्राम बारीक जमीन अनाज के नमूने में निष्कर्षण सॉल्वेंट के 500 माइक्रोन जोड़ें।
- 6,500 आरपीएम पर 20 एस के 2 रन के लिए एक समरूपका का उपयोग कर मिश्रण करें।
- 16,100 x ग्राम पर 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज।
- एक 2 mL प्लास्टिक ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण।
- लगभग 1.5 मिलील की कुल अलौकिक मात्रा देने के लिए इस प्रक्रिया को चरण 3.1 से 3.5 दो गुना अधिक दोहराएं।
- भंवर अधिवनात मिश्रण करने के लिए।
- एक पूल्ड अनाज निकालने का नमूना बनाने के लिए प्रत्येक उद्धरण की समान मात्रा (55 माइक्रोन) को एक अलग 2 मिलील ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- एक गिलास शीशी के लिए निकालने के एक 50 μL aliquot हस्तांतरण।
नोट: अर्क इस बिंदु पर जमे हुए (-80 डिग्री सेल्सियस) किया जा सकता है या अगले कदम के लिए आगे बढ़ना और एलसी-एमएस विश्लेषण के माध्यम से पालन करें ।
4. एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए समाधान की तैयारी
सावधानी: केंद्रित एसिड के लिए, हमेशा पानी/विलायक करने के लिए एसिड जोड़ें ।
- 1 एम अमोनियम फोरमेट स्टॉक सॉल्यूशन का 50 एमएल तैयार करें। अमोनियम फोरमेट के 3.153 ग्राम वजन और एक 50 एमएल वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क करने के लिए हस्तांतरण। एलसी-एमएस ग्रेड एच2ओ के साथ लाइन के लिए वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क भरें।
- मोबाइल फेज ए के 1 एल तैयार करें जिसमें 10 एमएम अमोनियम फोरमेट, 0.1% फोरिक एसिड शामिल है। ऐसा करने के लिए, एल-एमएस ग्रेड पानी के लगभग 500 mL को 1 एल वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में जोड़ें। 1 एम अमोनियम फोरमेट स्टॉक का 10 एमएल और फोरमिक एसिड का 1 एमएल जोड़ें। एलसी-एमएस ग्रेड एच2ओ के साथ लाइन में वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क भरें 1 एल बोतल में ट्रांसफर करें और डेगास के लिए 15 मिन के लिए सोनीकेट करें।
- मोबाइल चरण बी के 1 एल तैयार करें जिसमें 79:20:1 एसीटोनिट्रिल में 10 एमएम अमोनियम फोरमेट शामिल हैं: आइसोप्रोपिल अल्कोहल: पानी, 0.1% फॉर्मिक एसिड अनुपात। एक 1 एल वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क करने के लिए आइसोप्रोपेनॉल के 200 mL जोड़ें। 1 एम अमोनियम फोरमेट स्टॉक का 10 एमएल और फोरमिक एसिड का 1 एमएल जोड़ें। एसीटोनिट्रिल के साथ लाइन में वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क भरें। 1 एल बोतल में स्थानांतरित करें और 15 मिन के लिए डेगास में सोनिकेट करें।
नोट: ACN जोड़ने से पहले आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) में 1 एम अमोनियम फोरमेट को पतला करें। अमोनियम फोरमेट कैन में अघुलनशील है। - मोबाइल चरण सी के 1 एल तैयार करें जिसमें 89:10:1 आइसोप्रोपिल अल्कोहल के अनुपात में 10 एमएम अमोनियम फोरमेट शामिल है: एसीटोनिट्रिल: पानी। ऐसा करने के लिए, आइसोप्रोपेनॉल का लगभग 500 एमएल, 1 एम अमोनियम फोर्टमेट स्टॉक का 10 एमएल और 1 एल वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में एसीटोनिट्रिल का 100 एमएल जोड़ें। आइसोप्रोपेनॉल के साथ लाइन में भरें। 1 एल बोतल में स्थानांतरित करें और 15 मिन के लिए डेगास में सोनिकेट करें।
- एलसी-एमएस सिस्टम वॉश सॉल्वैंट्स की तैयारी
- पंप-हेड वॉश सॉल्यूशन को नए समाधान के साथ बदलें। निर्माता द्वारा अनुशंसित 50% मेथनॉल, 10% आइसोप्रोपिल अल्कोहल या अन्य का उपयोग करें।
- नमूना इंजेक्शन से पहले और बाद में इंजेक्शन तरल पदार्थ धोने के लिए मजबूत और कमजोर सुई धोने के समाधान तैयार करें। मजबूत धोने के लिए, एसीएन और आईपीए के बराबर मात्रा जोड़ें। कमजोर धोने के लिए, अलग बोतलों में 10% एसीएन (इस प्रोटोकॉल और नमूनों की संख्या के लिए क्रमशः मजबूत और कमजोर वॉश में से प्रत्येक में से लगभग 500 मिलीग्राम और 1 एल की आवश्यकता होती है) का समाधान तैयार करें।
- सुई धोने की मात्रा क्रमशः मजबूत और कमजोर वॉश के लिए 600 माइक्रोन और 1800 माइक्रोन सेट करें।
5. एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए नमूनों की तैयारी
- 400 एनजी/μL ल्यूसिन एनकेफेलिन तैयार करने के लिए निर्मातामानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया के अनुसार, 12 मिलीएल ल्यूसिन-एनकेफालिन शीशी में 7.5 मिलीग्राम पानी का पाइपेट 7.5 मिलीग्राम पानी जिसमें 3 मिलीग्राम ल्यूसिन-एनकेफेलिन होता है। 50 माइक्रोन एलआली कोट में -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
- 5% एसीएन के 100 मीटर तैयार करें जिसमें 200 एनजी/एमएल ल्यूसिन-एनकेफेलिन (400 एनजी/μL ल्यूसिन एनकेफालिन का 50 माइक्रोन) हो। एलसी-एमएस विश्लेषण के रूप में उसी दिन तैयार करें।
- चरण 3 से तैयार 50 μL नमूना aliquot में इंजेक्शन मानक ल्यूसिन-एनकेफेलिन युक्त 5% एसीटोनिट्रिल के 950 माइक्रोन जोड़ें।
- तैयार सैंपल को मिलाने के लिए भंवर।
6. एलसी-एमएस सेटअप
नोट: निर्माता के उपयोगकर्ता गाइड में उपकरण और अधिग्रहण विधि सेटअप का विस्तृत विवरण वर्णित है। एक सामान्य गाइड और इस प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट विवरण नीचे उल्लिखित हैं। डेटा प्राप्त करने से पहले निम्नलिखित चरण ों को किसी भी समय पूरा किया जा सकता है।
- एक एलसी-एमएस हार्डवेयर प्रोफाइल खोलें।
- टेबल 1में उल्लिखित क्रोमेटोग्राफिक विधि स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि एलसी प्रणाली इस ढाल को स्थापित करने के लिए एक क्वाटरनेरी सॉल्वेंट प्रबंधक से सुसज्जित है।
नोट: आईपीए एक चिपचिपा विलायक है। इसे कम प्रवाह दर पर पेश किया जाना चाहिए और संरचना को 98.0% तक बढ़ाने से पहले पर्याप्त संतुलन समय का उपयोग किया जाना चाहिए। इन कदमों से एलसी सिस्टम को ओवरप्रेसिंग और रोकने से रोका जा सकेगा। - एम/जेड रेंज 50-1,300 पर सकारात्मक और नकारात्मक ToF-एमएस मोड में से प्रत्येक के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर अधिग्रहण विधियों की स्थापना करें ।
नोट: यहां प्रस्तुत काम के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण को सकारात्मक और नकारात्मक तरीकों को अंशांकित करने और व्यक्तिगत रूप से चलाने की आवश्यकता होती है (यानी, एक विधि के भीतर ध्रुवता स्विच करना संभव नहीं है)। - यदि एलसी कॉलम नया है, तो निर्माता की सिफारिश के अनुसार कॉलम को शर्त रखें।
नोट: निम्नलिखित कदम सीधे डेटा अधिग्रहण से पहले पूरा किया जाना चाहिए. - 'एमएस केवल' हार्डवेयर प्रोफ़ाइल में, निर्माता की सिफारिशों के अनुसार बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर को कैलिब्रेट करें। अधिग्रहण के प्रत्येक मोड से पहले इस कदम को पूरा करें, यह सुनिश्चित करना कि प्रणाली अंशांकन से पहले प्रत्येक दिए गए तौर-तरीकों में स्थिर हो गई है।
- मोबाइल चरण और वॉश सॉल्वैंट्स सहित एलसी-एमएस ग्रेड सॉल्वैंट्स का उपयोग करके एलसी फ्लूडिक्स सिस्टम को शुद्ध और फ्लश करें।
- एलसी प्रणाली शुरू करने की शर्तों का उपयोग कर के समतुल्य, यह सुनिश्चित करना है कि कॉलम दबाव स्थिर हो गया है ।
- उपकरण अंशांकन की जांच करने के लिए नमूना अनुक्रम (नीचे वर्णित) की शुरुआत में सोडियम फोर्टेट (90% आईपीए में 0.5 mM) इंजेक्ट करें।
- उपकरण अनुक्रम तालिका स्थापित करें ताकि सॉल्वेंट और तैयारी (निष्कर्षण) रिक्त स्थान का विश्लेषण पहले किया जा सके; सिस्टम कंडीशनिंग के लिए पूल किए गए क्यूसी नमूने (6-10) के बाद; फिर क्यूसी नमूनों के साथ यादृच्छिक नमूना सूची तकनीकी प्रतिकृति के रूप में नियमित अंतराल (जैसे, हर पांचवां इंजेक्शन) पर चलती है। अनुक्रम के अंत में दो क्यूसी नमूने चलाएं।
नोट: नमूना फाइलनाम के साथ-साथ नमूना आईडी में तिथि और इंजेक्शन/अधिग्रहण आदेश को शामिल करना सहायक है । उदाहरण के लिए: YYYy MMDD_Injection number_Variety_Biological दोहराने । शुरू करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि एलसी कॉलम दबाव स्थिर है और एलसी एमएस से जुड़ा हुआ है।
7. डेटा प्रोसेसिंग
नोट: एक सामान्य डेटा प्रोसेसिंग वर्कफ्लो चित्रा 1में प्रस्तुत किया जाता है।
- अनुक्रम चल रहा है, जबकि डेटा गुणवत्ता (आंतरिक मानक जन सटीकता (नीचे गणना) और संकेत प्रजनन क्षमता की जांच करें। सिग्नल प्रजनन क्षमता की जांच करने के लिए, मढ़ा स्पेक्ट्रा का दृश्य निरीक्षण पर्याप्त होना चाहिए।
नोट: मास त्रुटि (पीपीएम) = ((सैद्धांतिक द्रव्यमान-मापा द्रव्यमान) / सैद्धांतिक द्रव्यमान) x 106 - एक गठबंधन चोटी तीव्रता मैट्रिक्स जिसमें नमूने एक्स आंतरिक मानक (प्रतिधारण समय और मे/जेड मूल्यों द्वारा संरेखित) होते हैं।
- डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिकादेखें)। होम एंड जीटी के तहत, डेटापर क्लिक करें । उपयुक्त फ़ाइल स्थान पर नेविगेट करें और सभी डेटा फ़ाइलें खोलें।
- होम एंड जीटी; सीक्वेंस एंड प्रोसेसिंग टाइपके तहत, ड्रॉप-डाउन मेनू से क्वांटिशन का चयन करें।
- होम एंड जीटी; मेथड एंड क्वान केतहत अंशांकन घटकोंपर क्लिक करें । तालिका 2में दिए गए विवरणों का उपयोग करके प्रत्येक फ़ील्ड भरें। ओकेपर क्लिक करें ।
- डेटा फ़ाइलों के बगल में कॉलम में बाएं पैनल पर, सेल पर सही क्लिक करके और अज्ञातका चयन करके नमूना प्रकार भरें। एन/एके रूप में स्तर भरें ।
- होम एंड जीटीएंड प्रोसेसिंगके तहत सीक्वेंससिलेक्ट करें । अनुक्रम को सहेजने के लिए एक स्थान चुनें और फिर प्रक्रियापर क्लिक करें।
- होम एंड जीटी एंड रिजल्ट्सके तहत क्वानका चयन करें । क्वान व्यूअर से, एक्सपोर्ट का चयन मैट्रिक्स एनालाइजर तक चलताहै ।
- मैट्रिक्स एनालाइजर परिणाम दर्शक से, सीएसवी के लिए निर्यातक्लिक करें । स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में फ़ाइल को सहेजें।
- स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में, प्रत्येक आंतरिक मानक की तीव्रता (पीक क्षेत्र) के औसत, मानक विचलन और सापेक्ष मानक विचलन की गणना करें।
- एक गठबंधन चोटी तीव्रता मैट्रिक्स जिसमें नमूने एक्स अनलक्षित विशेषताएं (प्रतिधारण समय और एम/जेड मूल्यों द्वारा गठबंधन) शामिल हैं।
- छोटे अणु खोज विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिकादेखें) और एक नया प्रयोग बनाने के लिए फ़ाइल और जीटी; नया चुनें। प्रयोग का नाम दें और प्रयोग फ़ाइलों को सहेजने और स्टोर करने के लिए स्थान चुनें। आगेक्लिक करें ।
- उपयोग किए गए उपकरण के प्रकार (उच्च रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर), डेटा प्रारूप (प्रोफ़ाइल), और ध्रुवता (सकारात्मक या नकारात्मक) का चयन करें। आगेक्लिक करें । पुस्तकालय में उपलब्ध सभी एडडक्ट्स का चयन करें और आवश्यकतानुसार एडडक्ट लाइब्रेरी को संपादित करें। क्लिक करें बनाएं प्रयोग. एक नया पृष्ठ लोड होगा जहां शेष डेटा प्रसंस्करण जारी रहेगा/
- डेटा फाइलों का आयात करें। फाइल फॉर्मेट का चयन करें और फिर आयात का चयन करें। डेटा स्थान पर ब्राउज़ करें और आयात की जाने वाली डेटा फ़ाइलों का चयन करें। पृष्ठ के बाएं पैनल पर प्रत्येक फ़ाइल के लिए प्रगति दिखाई जाएगी।
- एक बार डेटा फ़ाइलों का आयात किया जाता है, शुरू स्वचालित प्रसंस्करण काचयन करें । संरेखण संदर्भ का चयन करने के लिए एक विधि चुनें। या तो सॉफ्टवेयर उपयुक्तता के लिए सभी रन का आकलन करने दें, उपयुक्त नमूनों (यानी, क्यूसी नमूनों) की एक सूची दें या संदर्भ को सबसे उपयुक्त यानी मध्य अनुक्रम क्यूसी नमूना चुनें। हां चुनें, स्वचालित रूप से मेरे रन और gt; अगलेसंरेखित करें ।
- प्रयोग डिजाइन पृष्ठ पर अगला चुनें (इसे बाद में स्थापित किया जा सकता है)।
- पीक पिकिंग का चयन करें और फिर पैरामीटर सेट करें। पीक पिकिंग लिमिट्स टैब के तहत, निरपेक्ष आयन तीव्रता का चयन करें और 100दर्ज करें। चुनें एक न्यूनतम चोटी चौड़ाई लागू करें और 0.01 न्यूनतम दर्ज करें। OK का चयन करें और खत्मकरें। जब प्रसंस्करण पूरा हो जाए, तो क्लोजका चयन करें।
नोट: पीक पिकिंग सीमा को अन्य डेटा फ़ाइल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जैसा कि आवश्यक है। - स्क्रीन के नीचे दाईं ओर, सेक्शन कंप्लीटचुनें। गठबंधन रन की समीक्षा करें और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना संदर्भ के अनुरूप है। यहां प्रस्तुत आंकड़ों के लिए अलाइनमेंट स्कोर >90% थे। सेक्शन कंप्लीटका चयन करें ।
- अगले पेज पर सब्जेक्ट डिजाइन के बीच सिलेक्ट करें। डिजाइन का नाम। मैन्युअल रूप से रन ग्रुप का चयन करें और डिजाइन बनाएं। शर्त जोड़ें, शर्त 1 पर क्लिक करें और समूह का नाम उचित रूप से करें। क्लिक करें सेक्शन पूरा।
नोट: सॉफ्टवेयर के भीतर आंकड़ों का उपयोग करने के लिए उपयुक्त के रूप में शर्तों को जोड़ने के लिए जारी रखें । चूंकि हमने केवल एक अलक्षित मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग किया था, इसलिए हमने 'सभी' लेबल वाली एक शर्त का उपयोग किया। - अगले पेज पर, सेक्शन पूराचुनें। चोटी चुनने को फिर से न करें।
- डेकोवोलुशन की समीक्षा करें और फिर सेक्शन कंप्लीटपर क्लिक करें ।
- फाइल एंड जीटी; एक्सपोर्ट कंपाउंड मेजरमेंट परजाएं । आउटपुट में वांछित किसी भी गुण को डिसेलेक्ट करें। ओकेपर क्लिक करें । .csv फ़ाइल को बचाने के लिए एक स्थान चुनें। क्लिक करें सेव एंड जीटी; ओपन फाइल एंड जीटी; ओपन फ़ोल्डर या क्लोज.
- कलाकृतियों (स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर) को हटाने के लिए निष्कर्षण रिक्त स्थान का उपयोग कर डेटा फ़िल्टर करें।
- प्रत्येक आरटी एक्स एम/जेड सुविधा के लिए, एक नए कॉलम में, निष्कर्षण रिक्त स्थान में औसत प्रतिक्रिया की गणना करें।
- प्रत्येक आरटी एक्स एम/जेड सुविधा के लिए, अन्य सभी नमूनों (क्यूसी नमूनों सहित) में औसत प्रतिक्रिया की गणना करें।
- नमूनों में रिक्त स्थान की % चोटी तीव्रता की गणना (रिक्त में औसत प्रतिक्रिया/
- प्रतिशत योगदान कॉलम को सबसे कम से उच्चतम मूल्यों तक सुलझाएं।
- उन सुविधाओं को हटा दें जिनमें रिक्त स्थानों से 5% तीव्रता का योगदान है।
- गायब मूल्यों को फ़िल्टर करें और पूल किए गए क्यूसी नमूनों में संकेतों के लिए सुविधा संकेतों को सही करें।
- डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका) खोलें। व्यू मैट्रिक्सएनालाइजर बटन पर क्लिक करें। ओपन डाटा फाइल बटन पर क्लिक करें।
- प्रत्येक नमूने (अलक्षित मैट्रिक्स) के लिए आरटी एक्स एम/जेड सुविधाओं की चोटी तीव्रता वाले .csv फ़ाइल स्थान पर नेविगेट करें। ओपनका चयन करें ।
- क्यूसी नमूनों टैब के तहत, आवश्यकतानुसार प्रत्येक पैरामीटर भरें। यहां वर्णित डेटा सेट के लिए, क्यूसी श्रेणी = क्यूसी का उपयोग करें, श्रेणियों की अनदेखी करें = खाली, इम्टयूट टाइप = कोई नहीं, कवरेज थ्रेसहोल्ड = 80, स्केल का उपयोग = नो स्केलिंग, अनचेक लॉग ट्रांसफॉर्म, सही उपयोग = चौरसाई स्प्लीन, चौरसाई = 0.25।
- मैट्रिक्स पैनल के शीर्ष दाईं ओर, प्ले बटन क्यूसी करेक्शनपर क्लिक करें।
- मैट्रिक्स पैनल के शीर्ष अधिकार पर सुधार किया गया है के बाद, क्लिक करें सेव परिणाम। एक उपयुक्त स्थान पर नेविगेट करें और .csv परिणाम फ़ाइल को सहेजें।
- क्यूसी नमूनों में 20% आरएसडी वाले फीचर्स को हटाने के लिए डेटा फ़िल्टर करें।
- डेटा की व्यवस्था करें ताकि नमूने पंक्तियों में हों और विशेषताएं कॉलम में हों।
- एक नए कॉलम में, क्यूसी नमूनों के लिए औसत चोटी तीव्रता की गणना करें।
- एक नए कॉलम में, क्यूसी नमूनों के लिए चोटी की तीव्रता के मानक विचलन की गणना करें।
- क्यूसी नमूनों के लिए चोटी की तीव्रता के सापेक्ष मानक विचलन की गणना करें: (क्यूसी मानक विचलन/क्यूसी औसत) x 100।
- सुविधाओं को सबसे कम से उच्चतम% आरएसडी तक सुलझाएं और उन सुविधाओं को हटा दें जिनमें क्यूसी आरएसडी और जीटी 20% है।
- कम आरएसडी नमूना/आरएसडीsampleक्यूसी अनुपात (जैसे, <1) के साथ सुविधाओं को हटाने के लिए डेटा फ़िल्टर करें।
- एक नए कॉलम में, नमूनों के लिए औसत चोटी तीव्रता की गणना करें।
- एक नए कॉलम में, नमूनों के लिए चोटी की तीव्रता के मानक विचलन की गणना करें।
- नमूनों की चोटी की तीव्रता के सापेक्ष मानक विचलन की गणना करें: (नमूना मानक विचलन/नमूना औसत) x 100।
- एक नए कॉलम में क्यूसी आरएसडी द्वारा नमूनों आरएसडी को विभाजित करें ।
- मूल्यों (आरएसडीsampleनमूना/आरएसडीक्यूसी अनुपात) को उच्चतम से सबसे कम तक सुलझाएं और अनुपात & 1 के साथ सुविधाओं को हटा दें।
- लापता मूल्यों (कई तरीके ऑनलाइन उपलब्ध) को इम्पुट करें।
- स्प्रेडशीट को प्रारूपित करें ताकि नमूने पंक्तियों में हों और विशेषताएं कॉलम में हों। पहला कॉलम सैंपल फाइलनाम होना चाहिए। फाइलनाम के बगल में एक अतिरिक्त कॉलम बनाएं और नमूना समूह दर्ज करें। इस मामले में, नमूनों को विविधता द्वारा समूहीकृत किया गया था।
- एक .csv फ़ाइल के रूप में स्प्रेडशीट सहेजें।
- उच्च-थ्रूपुट मेटापोलोमिक्स (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए वेब-आधारित विश्लेषणात्मक पाइपलाइन के लिए होमपेज पर जाएं और शुरू करने के लिए यहां क्लिक करें।
- क्लिक करें सांख्यिकीय विश्लेषण. अपलोड योर डेटा केतहत, डेटा टाइप चुनें: पीक तीव्रता तालिका, प्रारूप: पंक्तियों में नमूने (अनपेयर) और फिर फ़ाइल चुनें।
- .csv फ़ाइल पर नेविगेट करें, ओपन चुनें और फिर सबमिटचुनें।
- अगले पृष्ठ पर, मिसिंग वैल्यू अनुमानचुनें। अचेक चरण 1 (यह एनालाइजरप्रो एक्सडी में किया गया था)। चरण 2 में, लापता मूल्यों का अनुमान लगाने के लिए एक विधि चुनें।
नोट: यहां प्रस्तुत आंकड़ों के लिए - 'केएनएन' के साथ 'अनुमान लापता मूल्यों' का चयन किया गया था। - इस स्तर पर, डेटा मैट्रिक्स डाउनलोड किया जा सकता है (वेब पेज के बाएं पैनल से डाउनलोड का चयन करें) या आगे सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
संयंत्र मेटाबोलोम अपने जीनोम और पर्यावरण के संयोजन से प्रभावित होता है, और इसके अतिरिक्त कृषि सेटिंग, फसल प्रबंधन शासन में। हम प्रदर्शित करते हैं कि गेहूं की किस्मों के बीच आनुवंशिक अंतर मेटाबोलाइट स्तर पर देखा जा सकता है, यहां, ५०० से अधिक मापा यौगिकों के साथ अकेले अनाज में किस्मों के बीच काफी अलग सांद्रता दिखा । नकारात्मक और सकारात्मक आयनीकरण मोड(तालिका 3)दोनों के लिए आंतरिक मानकों(चित्रा 2)की अच्छी जन सटीकता (<10 पीपीएम त्रुटि) और सिग्नल प्रजनन क्षमता (<20% आरएसडी) देखी गई । वर्णित नमूना तैयारी और तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित विश्लेषण में नकारात्मक आयनीकरण मोड में और सकारात्मक आयनीकरण मोड में 1300 डेकोवोल्यूट फीचर्स दिए गए हैं। तैयारी रिक्त स्थान(चित्रा 3)को यह निर्धारित करने के लिए शामिल किया गया था कि नमूना तैयारी और विश्लेषण विधियों ने कलाकृतियों की विशेषताओं को पेश किया है या नहीं, और इस प्रकार डेटा मैट्रिक्स से समाप्त सभी गैर-जैविक प्रभाव। यह पाया गया कि नकारात्मक मोड में 421 संकेतों और सकारात्मक मोड में 835 संकेतों में अनाज के नमूनों में औसत संकेत तीव्रता के 5% के बराबर या उससे अधिक संकेत तीव्रता थी। इन सुविधाओं को हटा दिया गया और आगे डेटा फ़िल्टरिंग स्टेप्स (चरण 7 और चित्रा 1) केबाद, नकारात्मक मोड ने 483 सुविधाओं को लौटा दिया और सकारात्मक मोड ने मेटाबोलिक स्नैपशॉट बनाते हुए 523 सुविधाओं को वापस कर दिया। विधि सुविधाओं का पता लगाने में सफल रही, जिसमें आयनीकरण मोड में और 500 महत्वपूर्ण सुविधाओं के साथ गेहूं की किस्मों(चित्रा 4)के बीच काफी अलग तीव्रता थी। नकारात्मक आयनीकरण मोड में, अधिकांश महत्वपूर्ण विशेषताएं उलटचरण ढाल में थीं और सकारात्मक आयनीकरण मोड में, अधिकांश महत्वपूर्ण विशेषताएं लिपिड ग्रेडिएंट(चित्रा 4)में थीं।
चित्रा 1: डेटा जांच, प्रसंस्करण और फ़िल्टरिंग के लिए इस विश्लेषण में उपयोग किया जाने वाला कार्यप्रवाह। चरण 1 उपकरण पर डेटा अधिग्रहण/देखने वाले सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आयोजित किया जाता है ताकि ऑन-द-फ्लाई मूल्यांकन किया जा सके । इसमें आंतरिक मानकों की सामूहिक त्रुटि (पीपीएम) की गणना करना और डेटा प्रजनन क्षमता के दृश्य मूल्यांकन के लिए आंतरिक मानक चोटियों को ओवरले करना शामिल है। चरण 2-7 प्रोटोकॉल में उल्लिखित डेटा प्रसंस्करण प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, चरण 7। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम। 13सी 6-सोर्बिटोल6(गहरा नीला), ल्यूसिन-एनकेफेलिन (गुलाबी), डी 6-ट्रांस-सिन्मिक एसिड (नारंगी), 2-अमीनोन्थ्रेसीन (हरा) और मिकोनाजोल (हल्का नीला) आंतरिक मानकों में सकारात्मक (शीर्ष) और नकारात्मक (नीचे) इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) मोड के निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम।6 आंतरिक मानक प्रतिधारण समय और तीव्रता दिखाई जाती है। ईएसआई + और ईएसआई - कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: नकारात्मक मोड (गुलाबी) और सकारात्मक मोड (नीला) अधिग्रहण दिखा तैयारी रिक्त स्थान के कुल आयन क्रोमेटोग्राम (TIC) ओवरले। एक आंतरिक मानक, मिकोनाजोल, दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: कुल आयन क्रोमेटोग्राम (TIC) ओवरले, नकारात्मक मोड (गुलाबी) और सकारात्मक मोड (नीले) अधिग्रहण और क्रोमेटोग्राफिक ढाल भर में गेहूं की विविधता के बीच काफी अलग सुविधाओं की संख्या दिखा । नकारात्मक मोड में, मोबाइल चरण बी संरचना अधिक होने पर महत्वपूर्ण सुविधाओं की सबसे बड़ी संख्या पाई गई। सकारात्मक मोड में, मोबाइल चरण सी संरचना अधिक होने पर महत्वपूर्ण सुविधाओं की सबसे बड़ी संख्या पाई गई। एक आंतरिक मानक, मिकोनाजोल, दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| खंड | समय | प्रवाह दर | % ए | %B | %C | वक्र |
| (मिन) | (mL/min) | |||||
| 1 | प्रारंभिक | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
तालिका 1: मोबाइल चरण रचनाओं का तरल क्रोमेटोग्राफी समय पर कार्यक्रम।
| पैरामीटर | आंतरिक मानक | ||||
| 13 सी6-sorbitol | ल्यूसिन-एनकेफेलिन | d6-ट्रांससिनेमिक एसिड | 2-अमीनो-एंथ्रेसी | मिकोनाजोल | |
| क्वान मै/जेड | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| सामूहिक सहिष्णुता (एएमयू) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| प्रतिधारण समय | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| रिटेंशन टाइम विंडो | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| डिटेक्शन टाइप | उच्चतम | उच्चतम | उच्चतम | उच्चतम | उच्चतम |
| रिस्पांस टाइप | क्षेत्र | क्षेत्र | क्षेत्र | क्षेत्र | क्षेत्र |
| क्षेत्र सीमा | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| चौड़ाई सीमा | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| ऊंचाई सीमा | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| सिग्नल-टू-शोर अनुपात | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| चौरसाई | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
तालिका 2: सकारात्मक (और नकारात्मक) अधिग्रहण मोड में आंतरिक मानकों के लिए पीक डिटेक्शन पैरामीटर।
| मास सटीकता (पीपीएम) | QC सुधार से पहले % RSD | QC सुधार के बाद % RSD | ||
| नकारात्मक मोड | 13 सी6-sorbitol | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-ट्रांससिनेमिक एसिड | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| ल्यूसिन-एनकेफेलिन | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| सकारात्मक मोड | 13 सी6-sorbitol | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| ल्यूसिन-एनकेफेलिन | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-ट्रांससिनेमिक एसिड | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-अमीनोएंथ्रेसन | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| मिकोनाजोल | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
तालिका 3: नमूना(n=30) आंतरिक मानक जन सटीकता (पीपीएम) और संकेत प्रजनन क्षमता से पहले और बाद में QC-सुधार सापेक्ष मानक विचलन (%) के रूप में व्यक्त किया ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहां, हम गेहूं के अनाज के विश्लेषण के लिए एलसी-एमएस आधारित अलक्षित मेतापोलोमिक्स विधि प्रस्तुत करते हैं। विधि उलट चरण ढाल में एक तिहाई मोबाइल चरण शुरू करके सकारात्मक और नकारात्मक आयनीकरण के साथ चार अधिग्रहण मोड (उलट चरण और लिपिड-उत्तरदायी उलट चरण) को दो मोड में जोड़ती है। संयुक्त दृष्टिकोण गेहूं की किस्मों के बीच तीव्रता में इन काफी अलग के लगभग आधे के साथ आयन ध्रुवीकरण प्रति लगभग ५०० जैविक रूप से प्रासंगिक सुविधाओं मिले । विभिन्न गेहूं की किस्मों के अनाज में मेटाबोलाइट एकाग्रता में महत्वपूर्ण परिवर्तन बदल जैव रसायन है, जो रोग प्रतिरोध, तनाव सहिष्णुता और अनाज की गुणवत्ता और उपज के लिए महत्वपूर्ण है अन्य फेनोटाइपिक लक्षण से जोड़ा जा सकता है इंगित करता है। उदाहरण के लिए, मेटाबोलोमिक्स दृष्टिकोण का उपयोग उपन्यास रक्षा तंत्र12 का वर्णन करने और सूखा सहिष्णुता13में मेटाबोलिट्स की भूमिका का प्रस्ताव करने के लिए किया गया है। इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों को आनुवंशिक लक्षण है कि कुछ वातावरण और प्रबंधन प्रथाओं के लिए वांछनीय है करने के लिए विशेष किस्मों के जैव रासायनिक प्रोफाइल को और अधिक जोड़ने में सक्षम हो सकता है । बदले में, यह इष्टतम अनाज की गुणवत्ता और चयनित जीनोटाइप के लिए उपज के उत्पादन की अनुमति देगा।
आंतरिक मानकों को शामिल करना इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है ताकि उपयोगकर्ता को संकेत, प्रतिधारण समय बदलाव और बड़े पैमाने पर सटीकता के संकेतकों में परिवर्तन निर्धारित करने की अनुमति दी जा सके। संकेत में परिवर्तन, उदाहरण के लिए, उप इष्टतम निष्कर्षण, इंजेक्शन (तरल प्रणाली रुकावटों सहित), या डिटेक्टर प्रदर्शन का संकेत हो सकता है। प्रतिधारण समय बदलाव खराब पंप प्रदर्शन, अनुचित मोबाइल चरण ढाल संतुलन या कि एलसी कॉलम स्थिर चरण खराब हो गया है संकेत हो सकता है । खराब जन सटीकता एक बहाव अंशांकन का संकेत हो सकता है और प्रणाली को फिर से अंशांकन की आवश्यकता होती है। उपर्युक्त सभी मामलों में, प्रणाली को रोका जाना चाहिए, और उचित रखरखाव/किए गए भागों का प्रतिस्थापन किया जाना चाहिए । हमने इंजेक्शन से पहले जोड़े गए अंतिम नमूने में अनाज और एक मानक तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले निष्कर्षण समाधान में चार मानकों को शामिल किया। यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती गई कि मानक प्रत्येक आयनीकरण मोड के लिए उत्तरदायी थे और अवधारण समय की एक श्रृंखला को कवर किया गया था; हालांकि, हम स्वीकार करते हैं कि लेबल वाले लिपिड मानक को शामिल करने के साथ मानकों की इस सरणी में सुधार किया जा सकता है। यह दिखाया गया है कि गेहूं के अनाज में सैकड़ों ट्राइसिग्लिसरोल (टीएजी)5होते हैं, जिनमें से कोई भी इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त अतिरिक्त होगा। तैयारी रिक्त स्थान और पूल्ड क्यूसी नमूनों को शामिल करना8 भी इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं। आयन सुविधाओं के हजारों अलक्षित जन स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों में पता चला रहे है और यह उन जो केवल खाली नमूनों में मौजूद है और यह भी जो पुनः उत्पादन नहीं कर रहे है बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है (यानी, उच्च% RSD) विश्लेषण के दौरान ।
हालांकि वर्तमान विधि काफी समय और संसाधनों की बचत करती है, यदि एक क्वाटररी सॉल्वेंट प्रबंधक उपलब्ध नहीं है, तो मानक उलट चरण और लिपिड विधियों का उपयोग समान परिणामों को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली निष्कर्षण मात्रा अतिरिक्त अधिग्रहण मोड के विश्लेषण के लिए पर्याप्त होगी। यह प्रोटोकॉल एक एसीटोनिट्रिल निष्कर्षण का वर्णन करता है। जबकि सफल, एक वैकल्पिक निष्कर्षण विलायक, या सॉल्वैंट्स का संयोजन, एक अलग मेटाबोलाइट कवरेज प्रदान करेगा, जो बदले में अधिक सुविधाओं को वितरित कर सकता है और/या कुछ यौगिकों की बेहतर (या कम) निष्कर्षण दक्षता दे सकता है । हमने इस प्रोटोकॉल में हल किए गए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मापन की मेटाबोलाइट पहचान स्थापित करने का प्रयास नहीं किया है; हालांकि, प्लांट मेटाबोलाइट्स और लिपिड के लिए मास स्पेक्ट्रल डेटाबेस उपलब्ध हैं और5,14,15विकसित कर रहे हैं . मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए, पूर्ण स्कैन डेटा के अलावा मिलकर मास स्पेक्ट्रा (एमएस/एमएस) एकत्र करने की आवश्यकता होगी। इन्हें प्रारंभिक रन के दौरान पूल किए गए नमूनों और एक उपयुक्त एमएस/एमएस विधि का उपयोग करके या आरक्षित अर्क (-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) पर एकत्र किया जा सकता है, एक बार ब्याज के मेटाबोलाइट्स निर्धारित किए गए हैं। हमने किस्मों के बीच यौगिकों के बड़े गुना परिवर्तनों का अवलोकन किया ताकि हम उच्चतम गुणवत्ता वाले एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए ब्याज के यौगिक की उच्च एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए जानी जाने वाली विविधता का उपयोग करते हुए दोनों और दूसरे उदाहरण में करने की सिफारिश करेंगे ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक पश्चिम ऑस्ट्रेलियाई प्रीमियर के कृषि और खाद्य फैलोशिप कार्यक्रम (नौकरियां, पर्यटन, विज्ञान और नवाचार विभाग, पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया सरकार) और प्रीमियर के फेलो, प्रोफेसर साइमन कुक (केंद्र के लिए) को स्वीकार करना चाहते है डिजिटल एग्रीकल्चर, कर्टिन यूनिवर्सिटी और मर्डोक यूनिवर्सिटी) । क्षेत्र परीक्षण ों और अनाज नमूना संग्रह क्षेत्रों कार्यक्रम के लिए पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया की रॉयल्टी की सरकार द्वारा समर्थित थे । हम फील्ड परीक्षणों में उनके योगदान के लिए ग्रांटली स्टेनर और रॉबर्ट फ्रेंच को स्वीकार करते हैं। एनसीआरआईएस द्वारा वित्तपोषित बायोप्लेटफॉर्मऑस्ट्रेलिया को उपकरण वित्त पोषण के लिए स्वीकार किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
