Summary
Plusieurs méthodes différentes ont été établies pour l’immunostaining multiplex utilisant des anticorps primaires de la même espèce hôte. Ici, nous décrivons l’utilisation du décapage micro-ondes d’anticorps et du fluorophore-tyramide pour bloquer la réactivité croisée d’anticorps pendant l’immunostaining multiplex sur les sections surrénales paraffines formalin-fixes de paraffine.
Abstract
Immunostaining est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour montrer le modèle d’expression cellulaire d’une protéine donnée. L’immunostaining multiplex permet l’étiquetage à l’aide de plusieurs anticorps primaires. Pour minimiser la réactivité croisée des anticorps, l’immunostaining multiplex à l’aide de taches indirectes nécessite des anticorps primaires non étiquetés provenant de différentes espèces hôtes. Cependant, la combinaison appropriée de différents anticorps d’espèces n’est pas toujours disponible. Ici, nous décrivons une méthode d’utilisation des anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte (par exemple, dans ce cas, les deux anticorps sont du lapin) pour l’immunofluorescence multiplex sur les sections surrénales de souris formalin-fixes (FFPE). Cette méthode utilise la même procédure et les réactifs utilisés dans l’étape de récupération d’antigène pour dépouiller l’activité du complexe d’anticorps primaire précédemment taché. Des glissières ont été souillées avec le premier anticorps primaire utilisant un protocole d’immunostaining général suivi d’une étape de liaison avec un anticorps secondaire biotinylated. Ensuite, une méthode de développement de signal avidin-biotine-peroxidase a été utilisée avec le fluorophore-tyramide comme substrat. L’immunoactivité du premier complexe primaire d’anticorps a été dépouillée par immersion dans une solution de citrate de sodium bouillante au micro-ondes pendant 8 min. Le dépôt insoluble de fluorophore-tyramide est resté sur l’échantillon, ce qui a permis à la glissière d’être tachée avec d’autres anticorps primaires. Bien que cette méthode élimine la plupart des faux signaux positifs, un certain fond de la réactivité croisée des anticorps peut rester. Si les échantillons sont enrichis en biotine endogène, un anticorps secondaire conjugué par peroxidase peut être utilisé pour remplacer l’anticorps secondaire biotinylated pour éviter le faux positif de la biotine endogène récupérée.
Introduction
Dans l’immunostaining multiplex, la coloration directe utilisant des anticorps primaires conjugués peut fournir des résultats informatifs. Sans utiliser d’anticorps secondaires, la méthode de coloration directe présente un faible risque de faux signaux de colocalisation provenant de la réactivité croisée des anticorps. Cependant, les reporters conjugués (fluorophore, enzymes) ou la biotine sur l’anticorps primaire limitent son utilisation future. Alternativement, l’immunostaining indirect fournit habituellement des signaux plus forts en utilisant un anticorps primaire non conjugué avec un anticorps secondaire étiqueté. Idéalement, les anticorps primaires non conjugués utilisés dans l’immunostaining multiplex devraient provenir de différentes espèces hôtes pour éviter la réactivité croisée des anticorps. Cependant, la combinaison appropriée d’anticorps primaires provenant de différentes espèces hôtes n’est pas toujours disponible.
Plusieurs méthodes ont été établies pour éliminer le risque que l’anticorps secondaire réagisse avec un anticorps primaire indésirable. Une méthode courante est l’utilisation d’un anticorps monomeric F(ab) pour bloquer les épitopes de liaison restants sur le premier complexe d’anticorps primaires avant de coloration avec le deuxième anticorps primaire1. Le décapage des anticorps, qui est similaire à la bande et à la résondance d’une feuille de tache occidentale, enlève le complexe d’anticorps précédemment taché sans dépouiller le dépôt de molécules de reporter détectables telles que le tétrahydrochlorure de 3,3'-diaminobenzidine (DAB)2 et le dépôt fluorescent de tyramide3. Avec cette méthode, les molécules de reporter dans différentes couleurs peuvent montrer un résultat multiplexe sur la même diapositive. La coloration multiplexe est également réalisable par l’élimination complète des couches précédemment déposées d’anticorps et l’alignement des images acquises ultérieurement à partir d’autres anticorps4,5. Ces méthodes donnent toutes des résultats fiables, bien que chaque méthode ait ses limites et nécessite soit des procédures compliquées, soit un système d’imagerie spécial.
Le protocole actuel montre l’application d’une méthode de décapage des anticorps avec l’utilisation de tampons couramment disponibles. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer des taches immunofluorescentes multiplex sur des sections surrénales de souris intégrées à la paraffine (FFPE) avec deux anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte.
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Protocol
1. Staining avec le premier anticorps
- Décire et réhydrater les glissières FFPE avec 5 min allouées à chacune des étapes suivantes : xylène ou réactifs équivalents 3x, 100 % éthanol 2x, 95 % éthanol 1x, 70 % éthanol 1x, 50 % éthanol 1x et eau distillée 2x.
REMARQUE : Les glissières doivent rester humides à partir de cette étape de réhydratation jusqu’à l’accumulation dans l’étape finale. - Pour la récupération facultative de l’antigène, placez les lames dans 275 ml de solution de citrate de sodium bouillante (10 mm, pH et 6,0) pendant 8 min. Pour maintenir la solution bouillante, placez les lames à plat sur le fond d’une boîte de tuyauterie de 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) avec un couvercle et micro-ondes la solution sur 70 % de puissance dans un four à micro-ondes de 700 W pendant 8 min. Retirez ensuite la boîte de tip du four à micro-ondes, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à température ambiante (RT) pendant au moins 20 min.
- Transférer les diapositives dans un pot de Coplin contenant de la PBST (saline tamponnée de phosphate avec 0,1 % de polysorbate 20/80). Laver avec pBST pendant 5 min 3x. Si vous ne passez pas immédiatement à l’étape suivante, entreposez les diapositives à cette étape avec pBST dans un bocal Coplin à RT pendant quelques heures ou à 4 oC pendant 1-2 jours si ce n’est pas immédiatement passer à l’étape suivante.
- Pour préparer la solution de blocage, utilisez le sérum normal de l’espèce hôte de l’anticorps secondaire comme réactif de blocage. D’autres réactifs de blocage commerciaux peuvent également être utilisés. Si vous utilisez le sérum normal utilisé pour l’étude présentée dans cette étude, ajoutez 100 L de sérum d’âne normal à 4,9 mL de PBST. La solution de blocage peut être stockée à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu’à 3 jours.
- Pour bloquer, secouez la PBST des diapositives et recouvrez-les rapidement d’une solution de blocage suffisante. Incuber les toboggans à RT dans une chambre humidifiée pendant 30 min.
- Préparer la solution d’anticorps primaire (500 l pour deux diapositives) en utilisant la solution de blocage pour diluer l’anticorps primaire à la concentration désirée. La solution doit être stockée sur la glace jusqu’à l’utilisation.
- Pour 3'HSD, ajouter 2 'L de 3'HSD dans 498 'L de solution de blocage.
- Pour TH, ajouter 0,5 L d’anticorps TH dans 499 'L de solution de blocage.
- Pour la caténine, ajouter 1 'L d’anticorps de caténine dans 499 'L de solution de blocage.
- Pour 20'HSD, ajoutez 1 'L d’anticorps de 20'HSD dans 499 'L de solution de blocage.
- Pour CYP2F2, ajouter 2 'L d’anticorps CYP2F2 dans 498 'L de solution de blocage.
- Incuber avec l’anticorps primaire en secouant la solution de blocage des diapositives, et rapidement les couvrir avec une solution d’anticorps primaire suffisante. Incuber les toboggans dans une chambre humidifiée pendant la nuit à 4 oC. Pendant l’incubation, les diapositives peuvent être recouvertes d’un petit morceau de film de paraffine pour éviter le dessèchement.
- Le lendemain matin laver les diapositives avec PBST pour 5 min 3x.
- Préparer la solution d’anticorps secondaire (500 l pour deux diapositives) en utilisant la solution de blocage pour diluer l’anticorps secondaire biotinylated à la concentration désirée (p. ex., 1 l d’anticorps antisouris à ânes ou d’anticorps anti-lapin à ânes en 499 l de blocage solution). La solution doit être stockée sur la glace jusqu’à l’utilisation.
- Incuber avec le deuxième anticorps en secouant la PBST des diapositives et en les recouvrant rapidement d’une solution d’anticorps secondaire suffisante. Incuber les toboggans dans une chambre humidifiée pendant 1 h à RT.
REMARQUE : Si la biotine endogène est une préoccupation, utilisez un anticorps secondaire peroxidase-conjugué au lieu de l’anticorps secondaire biotinylated. Passez à l’étape 1.14 si vous utilisez un anticorps secondaire conjugué à la peroxidase à l’étape 1.10. - Laver les toboggans avec pBST pendant 5 min 3x.
- Préparer la solution de streptavidine conjuguée au raifort peroxidase (SA-HRP) (500 l pour deux diapositives) en ajoutant 0,5 L de SA-HRP en 499 L de PBS. La concentration finale est de 1 g/mL.
- Incuber avec la solution SA-HRP. Secouez la PBST des diapositives et recouvrez rapidement les diapositives d’une solution SA-HRP suffisante. Incuber les toboggans dans une chambre humidifiée pendant 0,5 h à RT.
- Laver les toboggans avec pBST pendant 5 min 3x.
- Préparer la solution fluorophore-tyramide en diluant le fluorophore-tyramide avec son tampon de dilution selon les instructions du fabricant (p. ex., 5 l de fluorophore-tyramide en 496 l de tampon de dilution).
- Effectuer le développement du signal avec fluorophore-tyramide en secouant la PBST des diapositives et en couvrant rapidement les diapositives avec une solution suffisamment fluorophore-tyramide. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 1 min à RT. Le temps d’incubation peut être ajusté pour obtenir l’intensité de fluorescence désirée. Arrêtez la réaction en transférant les diapositives dans un bocal Coplin contenant de la PBST. Laver les toboggans avec pBST pendant 3 min 2x.
- Les signaux peuvent être rapidement vérifiés sous un microscope à fluorescence pour confirmer le résultat à ce stade. Si les résilles ne sont pas utilisées, appliquez une goutte de glycérol :PBS (1:1) sur chaque section pour garder les échantillons humides. Laver les toboggans avec pBST pendant 3 min 2x. Les glissières peuvent être stockées en PBST à 4 oC pendant quelques jours avant de passer à l’étape suivante.
2. Dépouiller le premier anticorps
- Placez les lames dans 275 ml de solution de citrate de sodium bouillante (10 mm, pH et 6,0) pendant au moins 8 min. Maintenez la solution à ébullition en plaçant les lames à plat sur le fond d’une boîte à tuyaux de 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x X H) avec couvercle et micro-ondes de la solution sur une puissance de 700 W pendant 8 min. Si un temps de décapage plus long est préférable, il peut être nécessaire de compléter le tampon à l’aide d’une solution de citrate de sodium bouillante pour garder les diapositives immergées dans la solution tampon en tout temps. Retirez la boîte de tip du four à micro-ondes, ouvrez le couvercle et laissez la solution refroidir à RT pendant au moins 20 min.
- Transférer les diapositives dans un bocal Coplin contenant de la PBST. Laver avec pBST pendant 5 min 3x. Si l’étape suivante, si elle n’est pas effectuée immédiatement, entreposez les diapositives dans un bocal Coplin avec PBST à RT pendant quelques heures ou à 4 oC pendant 1-2 jours.
3. Tache avec le deuxième anticorps
- Commencez par l’étape de blocage et suivez les mêmes procédures dans l’étape 1.5 à l’étape 1.14. Aux étapes de développement du signal (étape 1,15 et étape 1,16), utilisez le fluorophore-tyramide dans un spectre de fluorescence différent.
REMARQUE : Les diapositives peuvent être dépouillées à l’aide de cette méthode plusieurs fois pour permettre la coloration multiplexe. Le dernier anticorps n’a pas besoin de fluorophore-tyramide comme le journaliste. Un anticorps secondaire conjugué au fluorophore pourrait être utilisé pour montrer les signaux du dernier anticorps primaire. - Incuber les toboggans avec 2 g/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou la solution Hoechst pendant 1 min à RT si la coloration du compteur nucléaire est nécessaire. Ensuite, lavez les diapositives avec PBST pendant 3 min 2x.
4. Imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence pour détecter les signaux
- Montez un bordereau avec une goutte de milieu de montage adapté à l’immunofluorescence.
- Pour l’imagerie, utilisez un microscope à fluorescence pour détecter les signaux de chaque canal de fluorescence. Commencez par le canal de coloration nucléaire (DAPI) et la lentille 4x pour localiser le tissu sur la diapositive.
- Passez à l’objectif 10x pour l’imagerie. Ajuster le temps d’exposition (300 ms) et l’intensité des sources lumineuses (intensité de 80 %). Ajustez ces réglages si le signal est trop lumineux ou trop foncé. Prenez des photos de chaque canal sans déplacer la scène. Un recentrage peut être nécessaire pour chaque canal. Fusionnez les images de chaque canal à l’aide du logiciel du microscope ou de l’ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
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Representative Results
Les résultats ont été obtenus à partir d’échantillons traités avec toutes les étapes décrites, y compris l’étape de récupération d’antigène 1.2. Tous les anticorps secondaires utilisés ici ont été biotinylated. Fluorophore-tyramide a été utilisé pour développer des signaux à partir des premiers et deuxièmes anticorps primaires. Des images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un cube FITC (pour la fluorescence verte), d’un cube TxRED (pour Cy3) et d’un cube DAPI (pour DAPI).
Le décapage à médiation micro-ondes élimine la réactivité croisée.
Les sections surrénales de FFPE de souris ont été souillées utilisant deux anticorps primaires de lapin. Sans décapage (Figure 1A-C), l’anticorps secondaire pour th a ramassé des sites de 3 HSD et a donné des signaux rouges dans le cortex surrénalien (Figure 1B). L’absence de décapage a conduit aux faux signaux de colocalisation vus en jaune (figure 1C). Cette réactivité croisée provient (1) de l’enzyme HRP qui a catalysé la première réaction de tyramide et (2) de la réactivité croisée des espèces d’anticorps. Pour éliminer la réactivité croisée de l’anticorps et le HRP de la première immunostaining, nous avons testé un 1 min (Figure 1D-F) et un décapage micro-ondes de 8 min(figure 1G-I). Les deux traitements ont été suffisants pour éliminer le signal non spécifique, donnant des résultats propres double coloration (Figure 1F, I). Le contrôle négatif a suivi toutes les mêmes étapes à l’exception de l’incubation avec des anticorps primaires (figure 1J). Aucun signal significatif n’a été capté dans le contrôle négatif. Nous avons constaté qu’un décapage de 8 minutes dans un tampon de citrate bouillant était suffisant pour éliminer la réactivité croisée d’anticorps pour beaucoup d’anticorps couramment utilisés dans la glande surrénale (figure 2).
La limitation — l’efficacité du décapage micro-ondes dépend des anticorps.
Bien que le décapage micro-ondes utilisé dans ce protocole fonctionne pour la plupart des cas, il ya des limites à cette méthode. Pour certains anticorps, une méthode de décapage à médiation micro-ondes avec un tampon de citrate peut ne pas enlever complètement la réactivité croisée de l’anticorps. Par exemple, un décapage de 8 min a enlevé la plupart des signaux non spécifiques de l’anticorps anti-TH de souris et de l’anticorps anti-CYP2F2 de souris, mais un signal faussement positif faible était toujours détectable (la médulle de la figure 3E et le cortex intérieur de la figure 3K). Notez qu’une augmentation du temps de micro-ondes à 20 min n’a toujours pas complètement éliminé la réactivité croisée des anticorps (Figure 3H,K).
Figure 1 : Double immunostaining représentative sur les surrénales de souris De la FFPE P1. Les sections surrénales de souris de FFPE ont été souillées avec deux anticorps primaires des lapins : anti-3-HSD (vert et cortex), anti-TH (rouge et médulle). Les trois groupes de taches comprennent les trois différentes procédures de décapage utilisées: (A-C) pas de décapage, (D-F) 1 min décapage, et (G-I) 8 min décapage. Notez que sans micro-ondes, l’anticorps secondaire avec TH a encore capté des signaux de 3-HSD, tandis que des résultats spécifiques de coloration ont été obtenus dans les groupes traités au micro-ondes de 1 min et 8 min. Il n’y a pas de signal positif dans le contrôle négatif, pas incubé avec des anticorps primaires. Barre d’échelle de 100 m. DAPI , noyaux cellulaires, bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Double immunostaining représentative sur les surrénales de souris De ffPE P21. Les sections surrénales de souris de FFPE ont été souillées avec deux anticorps primaires des lapins dans l’ordre suivant : anti-caténine (vert et cortex externe) et puis anti-20-HSD (rouge et cortex intérieur). Une étape de décapage de 8 min a été exécutée entre les deux. Barre d’échelle de 100 m; DAPI - noyaux cellulaires, bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Certains anticorps peuvent ne pas être complètement dépouillés, ce qui peut entraîner de faibles signaux non spécifiques. Les sections surrénales de souris de FFPE ont été souillées avec deux anticorps primaires des souris : anti-CYP2F2 (vert - cortex intérieur) et anti-TH (rouge et médulle). Les résultats du groupe sans décapage (A-C) ont montré que les réactions pour détecter la protéine CYP2F2 encore taché la zone TH(MD). Une fausse colocalisation a été vue dans la médulle surrénale (C). Bien qu’un traitement micro-ondes de 8 min et 20 min ait réduit l’intensité de la fluorescence verte dans la médulle, un fond notable est toujours présent (D-I). L’anticorps anti-CYP2F2 est un autre exemple montrant que la réactivité croisée ne peut pas être complètement enlevée même après 20 min de micro-ondes (J-L). Notez qu’il n’y avait pas de signal positif dans le contrôle négatif, non incubé avec des anticorps primaires, indiquant que le faux signal positif provenait de la réactivité croisée de l’anticorps (M). Barre d’échelle de 100 m; DAPI - noyaux cellulaires, bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Multiplex immunostaining est utile pour examiner la colocalisation cellulaire de deux ou plusieurs antigènes. Cette technique largement utilisée donne des résultats convaincants de colocalisation lorsque les anticorps primaires sont conjugués avec différents journalistes (coloration directe). Cependant, la coloration directe fournit habituellement des signaux plus faibles par rapport à la coloration indirecte, ce qui implique des anticorps secondaires conjugués pour détecter les anticorps primaires. Dans la coloration indirecte, un résultat immunostaining multiplex de haute qualité repose sur la question de savoir si les anticorps secondaires peuvent distinguer les différents anticorps primaires. En raison de la réactivité croisée possible des anticorps, la coloration multiplexe utilisant la méthode de coloration indirecte est observée plus clairement avec des anticorps primaires provenant de différentes espèces hôtes. Carl et d’autres ont développé un protocole utilisant un excès de fragment non conjugué d’IgG F(ab) pour bloquer la réactivité croisée d’anticorps1. Une stratégie similaire est utilisée dans la coloration "souris sur souris" qui utilise un anticorps anti-souris monomérique F(ab) pour empêcher l’anticorps secondaire anti-souris de détecter toute immunoglobuline de souris endogène dans le tissu. Cependant, cette méthode de blocage prend du temps et ne peut pas bloquer complètement les anticorps des étapes précédentes, surtout si les antigènes de détection sont de haute abondance2.
Le décapage à médiation thermique est une autre méthode pour prévenir la réactivité croisée des anticorps dans l’immunostaining multiplex. Le concept est similaire à la méthode de bande et de réprobe d’une tache occidentale. L’utilisation d’un four à micro-ondes pour faire bouillir les lames dans un tampon de citrate a eu un effet positif marqué sur le blocage de la réactivité croisée de l’anticorps. Deux traitements micro-ondes de 5 min entre les tours séquentiels de coloriographie immunostaining permettent la détection de multiples antigènes sur la même diapositive à l’aide d’anticorps monoclonaux de souris2. Les traitements par micro-ondes combinés à la méthode d’amplification du signal de thyramide (TSA), qui utilise le fluorophore-tyramide comme substrat de HRP, sont également utiles pour l’immunofluorescence double coloration3,6,7. Le traitement par micro-ondes entre les cycles de première et deuxième coloration bloque l’activité du premier immunocomplexe sans laver ses précipitations fluorescentes de tyramide. Cependant, un traitement par micro-ondes peut ne pas être en mesure de prévenir complètement la contamination par la coloration8. Bien que certaines méthodes utilisant différents types de tampons de décapage peuvent fournir une meilleure efficacité de décapage, tampons spécialisés avec des temps d’incubation plus longs sont nécessaires, ou des échantillons doivent subir l’acquisition d’image avant une autre tache est appliquée4,5,7,9,10,11. Ici nous démontrons une méthode simple avec une procédure moins compliquée et un tampon commun pour la récupération micro-ondes d’antigène dans la coloration immunofluorescente de multiplex. Bien que cette méthode élimine la plupart des réactivité croisée, les utilisateurs doivent être conscients d’une possible faible colocalisation fausse vu avec certains anticorps, même après un traitement micro-ondes de 20 min.
La biotine endogène peut être utilisée comme marqueur de cellules stéroïdomiques dans le cortex surrénalien12. Le fluorophore conjugué à la streptavidine seul est suffisant pour détecter la biotine endogène et éclaire tout le cortex surrénalien, en particulier dans les sections congelées. Puisque la biotine endogène est habituellement bloquée dans les échantillons de FFPE, la procédure avidin-biotine-peroxidase (c.-à-d., kit d’ABC) est encore employée couramment pour amplifier des cibles dans des échantillons surrénalendiens de FFPE. Il est important de noter que l’étape de récupération d’antigène démasque également la biotine endogène et induit son immunoactivité13. Puisque notre méthode combine la récupération micro-ondes d’antigène-négociée et l’utilisation du HRP streptavidin-conjugué, il est possible que la biotine endogène mènera aux signaux positifs faux, particulièrement dans les tissus riches en biotine endogène (par exemple, le foie, les reins, et quelques tumeurs)13. Si la procédure avidin-biotine-peroxidase est nécessaire pour amplifier le signal, une étape de blocage supplémentaire telle que la préincubation avec avidin libre et biotine libre peut aider à réduire le signal endogène de biotine14. Tandis que notre méthode donne un fond endogène bas de biotine sur des surrénales de souris de FFPE, il est important d’inclure toujours un contrôle négatif avec chaque échantillon en tout temps en utilisant la procédure avidin-biotine-peroxidase. L’approche alternative est d’employer un anticorps secondaire peroxidase-conjugué au lieu de l’anticorps secondaire biotinylated.
Nos résultats démontrent que le traitement de micro-ondes avec un tampon de citrate est une méthode utile pour la coloration d’immunofluorescence de multiplex. Toutefois, il convient de noter que toutes les activités croisées ne peuvent pas être entièrement bloquées. Une faible fausse colocalisation est possible. Ce protocole peut être utilisé comme une approche alternative lorsqu’il n’existe pas de combinaison appropriée d’anticorps primaires provenant de différentes espèces hôtes. Les utilisateurs doivent être conscients d’un éventuel faux positif provenant de la réactivité croisée restante ainsi que de la biotine endogène récupérée. Des contrôles négatifs appropriés doivent être inclus en tout temps.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par NIH R00 HD032636.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1,000 dilution |
| Microwave oven, 700 W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz | SC-25269 | 1:1,000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
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