Method Article

המיקרוגל והפלואורופפור-טירמידה לשימוש בחומרים מדומים על העכבר באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח

DOI:

10.3791/60868

⸱

February 21st, 2020

 ,  ,  , 
1College of Animal Science & Technology, Henan University of Science and Technology, 2Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר שיטות שונות הוקמו עבור חיסוני הקולנוע באמצעות נוגדנים עיקריים מאותו מין מארח. כאן, אנו מתארים את השימוש של מיקרוגל בתיווך נוגדן בנוכחות של fluorophore-tyramide כדי לחסום נוגדנים לחצות את הנוגדן במהלך כתמים חיסוני במגה-בניין על formalin-קבוע מוטבע האדרנל העכבר סעיפים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיסוני משמש נרחב במחקר ביו להראות דפוס הביטוי הסלולרי של חלבון נתון. חיסוני מולטיפלקס מאפשר תיוג באמצעות נוגדנים ראשוניים מרובים. כדי למזער את הנוגדן החוצה פעילות, חיסוני המגה באמצעות מכתים עקיף דורש נוגדנים ראשוניים ללא תווית ממינים מארחים שונים. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים למינים שונים אינו תמיד זמין. כאן, אנו מתארים שיטה של שימוש בנוגדנים ראשוניים שאינם מסומנים מאותם מינים מארחים (למשל, במקרה זה שני נוגדנים הם מן הארנב) עבור מגנטים למגה-ונציה על formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) עכבר סעיפים האדרנל. שיטה זו משתמשת באותו ההליך וריאגנטים המשמשים בשלב אחזור אנטיגן כדי להסיר את הפעילות של קומפלקס הנוגדן העיקרי שהיה מוכתם בעבר. השקופיות היו מוכתמות הנוגדן הראשוני הראשון באמצעות פרוטוקול חיסוני כללי ואחריו צעד מחייב עם נוגדן משני biotinylated. לאחר מכן, נעשה שימוש בשיטת פיתוח האותות avidin-biotin-peroxidase באמצעות פלואורואופפור-טירומידה כמצע. הפעילות החיסונית של מתחם הנוגדן הראשוני הראשון הוסרו באמצעות טבילה בתמיסה הרתיחה של נתרן ציטראט במשך 8 דקות. התצהיר המולא-מסיסים, שנותר על המדגם, שאיפשר לשקופית להיות מוכתם בנוגדנים ראשוניים אחרים. למרות שיטה זו מבטלת את רוב האותות החיוביים השווא, חלק מהרקע של הנוגדן חוצה פעילות מחודשת עשוי להישאר. אם הדגימות מועשר בביוטין, נוגדן משני peroxidase מעלה עשוי לשמש כדי להחליף את הנוגדן המשני biotinylated כדי למנוע את חיובי שווא מן התאושש ביולוגי אנדוסוגני.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתוך החומרים החיסונית, מכתים ישירות באמצעות נוגדנים ראשוניים מצוים יכול לספק תוצאות אינפורמטיביות. מבלי להשתמש בנוגדנים משניים, שיטת הצביעה הישירה מהווה סיכון נמוך לאותות לוקליזציה מזוייפים מנוגדן לפעילות מחודשת. עם זאת, הכתבים הצוחיים (fluorophore אנזימים) או ביוטין על הנוגדן הראשוני מגביל את השימוש העתידי שלה. לחילופין, חיסוני עקיף מספק בדרך כלל אותות חזקים יותר באמצעות נוגדן ראשוני ללא מעלה עם נוגדן משני מתויג. באופן אידיאלי, נוגדנים ראשוניים בלתי מצובאים בשימוש בבית החומרים החיסוני צריך לבוא ממינים שונים של מארחים כדי להימנע מפני הנוגדנים החוצה פעילות. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים ראשוניים ממינים מארחים שונים אינו תמיד זמין.

מספר שי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. כתמים עם הנוגדן הראשון

  1. Dewax עווה ומימה מחדש מגלשות ffpe עם 5 דקות מוקצה לכל אחד השלבים הבאים: קסילן או המקבילה ריאגנטים 3x, 100% אתנול 2x, 95% אתנול 1x, 70% אתנול 1x, 50% אתנול 1x, ו מים מזוקקים 2x.
    הערה: שקופיות צריכות להישאר לחות החל משלב מחדש זה עד להרכבה בשלב הסופי.
  2. עבור אחזור אנטיגן אופציונלי, מניחים את השקופיות ב 275 mL של תמיסת נתרן ציטראט רותחים (10 מ"מ, pH = 6.0) עבור 8 דקות. כדי לשמור על הפתרון רותח, למקם את השקופיות שטוח בתחתית של 14 x 9.5 x 9 ס מ3 (W x L x H) בתיבת עצה עם מכסה ומיקרוגל את הפתרון על 70% כוח במיקרוגל 700 W מיקרוגל עבור 8 דקות. לאחר מכן להסיר את תיבת הקצה של הפיפטה מהתנור, לפתוח את המכסה, ולתת לפתרון להתק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות התקבלו מדגימות שטופלו עם כל השלבים שתוארו כולל האחזור אנטיגן שלב 1.2. כל הנוגדנים המשניים. ששימשו כאן היו ביולוגיים פלואור שימש לפיתוח אותות מהנוגדנים הראשוניים הראשונים והשניים. תמונות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד קוביית FITC (עבור זריחה ירוקה), קוביית TxRED (עבור Cy3), ו קוביית DAPI (עבור DAPI).

התפשטות המיקרוגל מבטלת את הפעילות הצולבת.
העכבר סעיפים FFPE האדרנל היו מוכתם באמצעות שני נו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתמים חיסוני מולטיפלקס שימושי כדי לבחון את ההתאמה התאית של שני אנטיגנים או יותר. טכניקה זו בשימוש נרחב נותן תוצאות משכנעות לוקליזציה כאשר נוגדנים העיקרי הם מצועם כתבים שונים (כתמים ישירים). עם זאת, מכתים ישירה בדרך כלל מספק אותות חלשים יותר לעומת כתמים עקיפים, אשר כרוך נוגדנים משניים מצופני מעלה כדי לזהות את הנוגדנים העיקריים. באמצעות כתמים עקיפים, התוצאה באיכות גבוהה מכתים החומרים מסתמך אם הנוגדנים המשניים יכולים להבחין בין הנוגדנים העיקריים השונים. בשל הנוגדן האפשרי צלב הפעילות, מגוון הצביעת ניצול שיטת מכתים עקיף הוא נ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על-ידי NIH R00 HD032636.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000
חמור ביוטיניל נגד עכברJacksonImmuno715-066-1511:500 דילול
חמור ביוטיניל נגד ארנבJacksonImmuno711-066-1521:500 דילול
DAPIBioLegend4228012 μ גרם/מ"ל במים מזוקקים
מיקרוסקופ פלואורסצנטיECHORevolve 4
סטרפטווידין מצומד חזרת פרוקסידאזג'קסון Immuno016-030-0841:1,000 דילול
תנור מיקרוגל, 700 Wג'נרל אלקטריקJEM3072DH1BB
עכבר אנטי-CYP2F2סנטה קרוזSC-374540דילול
עכבר אנטי-THסנטה קרוזSC-252691:1,000 דילול
סרום חמור רגילJacksonImmuno017-000-1212% סרום ב-PBST
ארנב אנטי-20&אלפא; HSDKerafastEB40021:500 דילול
ארנב אנטי-3&בטא; HSDTransGenicKO6071:250 דילול
ארנב אנטי-THNOVUSNB300-1091:1,000 דילול
ארנב אנטי-&בטא;-cateninAbcamab325721:500 דילול
סטרפטווידין חזרת פרוקסידאז (SA-HRP)JacksonImmuno016-303-0841:1,000 דילול
TSA Cy3 טירמידפרקין אלמרSAT704B001EAדילול של 1:100
TSA פלואורסצאין טירמידפרקיןאלמרSAT701001EAדילול של 1:100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  2. Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex ImmunostainingFluorophore TyramideMicrowave StrippingMouse AdrenalsUnconjugated Primary AntibodiesAntigen RetrievalAvidin Biotin PeroxidaseFluorescence MicroscopyFFPE SectionsAntibody Cross Reactivity

Related Articles