Summary
Flere ulike metoder er etablert for multipleks immunstaining ved hjelp av primære antistoffer fra samme vertsarter. Her beskriver vi bruken av mikrobølgemediert antistoffstripping og fluorophore-tyramid for å blokkere antistoffkryssreaktivitet under multipleks immunstaining på formalin-fast parafin-innebygde musbinyreseksjoner.
Abstract
Immunfarging er mye brukt i biomedisinsk forskning for å vise det cellulære uttrykksmønsteret til et gitt protein. Multiplex immunstaining gjør det mulig å merke ved hjelp av flere primære antistoffer. For å minimere antistoffkryssreaktivitet krever multipleks immunbeising ved hjelp av indirekte farging umerkede primære antistoffer fra forskjellige vertsarter. Den riktige kombinasjonen av forskjellige arter antistoffer er imidlertid ikke alltid tilgjengelig. Her beskriver vi en metode for bruk av umerkede primære antistoffer fra samme vertsart (f.eks. i dette tilfellet er begge antistoffene fra kanin) for multipleksimmunofluorescens på formalin-fast parafininnebygd (FFPE) musbinyreseksjoner. Denne metoden bruker samme prosedyre og reagenser som brukes i antigengjenfinningstrinnet for å fjerne aktiviteten til det tidligere fargede primære antistoffkomplekset. Lysbildene ble farget med det første primære antistoffet ved hjelp av en generell immunstainingprotokoll etterfulgt av et bindende trinn med et biotinylated sekundært antistoff. Deretter ble en avidin-biotin-peroxidase signalutviklingsmetode brukt med fluorophore-tyramid som substrat. Immunaktiviteten til det første primære antistoffkomplekset ble strippet gjennom nedsenking i en mikrobølgekokende natriumsitratløsning i 8 min. Den uoppløselige fluorophore-tyramiddeponen forble på prøven, noe som gjorde at lysbildet kunne være farget med andre primære antistoffer. Selv om denne metoden eliminerer de fleste falske positive signaler, kan det hende at noen bakgrunn fra antistoffkryssreaktivitet kan forbli. Hvis prøvene er beriket med endogene biotin, kan et peroksidase-konjugert sekundært antistoff brukes til å erstatte det biotinylated sekundære antistoffet for å unngå falsk positiv fra gjenvunnet endogen biotin.
Introduction
I multix immunbeising kan direkte farging ved hjelp av konjugerte primære antistoffer gi informative resultater. Uten å bruke sekundære antistoffer har den direkte fargingsmetoden lav risiko for falske kolokaliseringssignaler fra antistoffkryssreaktivitet. Imidlertid begrenser de konjugerte journalistene (fluorophore, enzymer) eller biotin på det primære antistoffet sin fremtidige bruk. Alternativt gir indirekte immunstaining vanligvis sterkere signaler ved å bruke et ukonjugert primærantistoff med et merket sekundært antistoff. Ideelt sett bør ukonjugerte primære antistoffer som brukes i multipleks immunstaining komme fra forskjellige vertsarter for å unngå antistoffkryssreaktivitet. Den riktige kombinasjonen av primære antistoffer fra forskjellige vertsarter er imidlertid ikke alltid tilgjengelig.
Flere metoder er etablert for å eliminere risikoen for at det sekundære antistoffet reagerer med et uønsket primærantistoff. En vanlig metode er bruk av et F(ab) monomeriske antistoff for å blokkere eventuelle gjenværende bindende epitoper på det første primære antistoffkomplekset før farging med det andre primære antistoffet1. Antistoffstripping, som ligner på stripen og reprobeav et vestlig flekkark, fjerner det tidligere fargede antistoffkomplekset uten å fjerne avsetning av påviselige reportermolekyler som 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB)2 og fluorescerende tyramiddeponering3. Med denne metoden kan reportermolekyler i forskjellige farger vise et multipleksresultat på samme lysbilde. Multipleksfarering kan også oppnås ved fullstendig fjerning av de tidligere deponerte lagene av antistoffer og justeringen av senere oppkjøpte bilder fra andre antistoffer4,5. Disse metodene gir alle pålitelige resultater, selv om hver metode har sine begrensninger og krever enten kompliserte prosedyrer eller et spesielt bildesystem.
Den nåværende protokollen viser anvendelsen av en antistoffstrippingsmetode ved bruk av allment tilgjengelige buffere. Denne protokollen kan brukes til å utføre multipleks immunofluorescerende farging på formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) mus binyreseksjoner med to umerkede primære antistoffer fra samme vertsart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Farging med det første antistoffet
- Dewax og rehydrere FFPE lysbilder med 5 min tildelt hvert av følgende trinn: xylen eller tilsvarende reagenser 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x, og destillert vann 2x.
MERK: Lysbildene skal forbli fuktige fra dette rehydreringstrinnet til montering i siste trinn. - For valgfri antigengjenfinning plasserer du lysbildene i 275 ml kokende natriumsitratoppløsning (10 mM, pH = 6,0) i 8 min. For å holde oppløsningen kokende, plasser lysbildene flatt på bunnen av en 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) pipetteboks med lokk og mikrobølgeovn løsningen på 70% strøm i en 700 W mikrobølgeovn i 8 min. Fjern deretter pipettespissen fra mikrobølgeovnen, åpne lokket og la oppløsningen avkjøles ved romtemperatur (RT) i minst 20 min.
- Overfør lysbildene til en Coplin-krukke som inneholder PBST (fosfatbufret saltvann med 0,1 % polysorbat 20/80). Vask med PBST i 5 min 3x. Hvis det ikke umiddelbart går til neste trinn, lagrer du lysbildene på dette trinnet med PBST i en Coplin-krukke ved RT i noen timer eller ved 4 °C i 1-2 dager hvis de ikke beveger seg umiddelbart til neste trinn.
- For å forberede blokkeringsløsningen bruker det normale serumet til sekundærantistoffets vertsarter som blokkeringsreagens. Andre kommersielle blokkeringsreagenser kan også brukes. Ved bruk av normalt serum ansatt for studien som presenteres i denne studien, legg til 100 μL normalt eselserum til 4,9 ml PBST. Blokkeringsløsningen kan lagres ved 4 °C i opptil 3 dager.
- For blokkering, rist av PBST fra lysbildene og dekk dem raskt med tilstrekkelig blokkeringsløsning. Inkuber lysbildene ved RT i et fuktet kammer i 30 min.
- Forbered den primære antistoffoppløsningen (500 μL for to lysbilder) ved hjelp av blokkeringsløsningen for å fortynne det primære antistoffet til ønsket konsentrasjon. Oppløsningen skal oppbevares på is til bruk.
- For 3βHSD tilsett 2 μL 3βHSD i 498 μL blokkeringsoppløsning.
- For TH tilsettes 0,5 μL TH antistoff i 499 μL blokkeringsoppløsning.
- For β-catenin tilsett 1 μL β-catenin antistoff i 499 μL av blokkeringsoppløsning.
- For 20αHSD tilsett 1 μL 20αHSD antistoff i 499 μL av blokkeringsoppløsning.
- For CYP2F2 tilsett 2 μL CYP2F2 antistoff i 498 μL blokkeringsoppløsning.
- Inkuber med det primære antistoffet ved å riste av blokkeringsoppløsningen fra lysbildene, og raskt dekke dem med tilstrekkelig primær antistoffløsning. Inkuber lysbildene i et fuktet kammer over natten ved 4 °C. Under inkubasjon en sklier kan være dekket av et lite stykke parafin film for å hindre uttørking.
- Neste morgen vaske lysbildene med PBST i 5 min 3x.
- Forbered den sekundære antistoffoppløsningen (500 μL for to lysbilder) ved hjelp av blokkeringsoppløsningen for å fortynne det biotinylated sekundære antistoffet til ønsket konsentrasjon (f.eks. 1 μL esel antistoff eller esel anti-kanin antistoff i 499 μL blokkering oppløsning). Oppløsningen skal oppbevares på is til bruk.
- Inkuber med det andre antistoffet ved å riste av PBST fra lysbildene og raskt dekke dem med tilstrekkelig sekundær antistoffløsning. Inkuber lysbildene i et fuktet kammer i 1 t ved RT.
MERK: Hvis endogene biotin er en bekymring, bruk et peroksidase-konjugert sekundært antistoff i stedet for det biotinylated sekundære antistoffet. Hopp til trinn 1,14 hvis du bruker et peroksidase-konjugert sekundært antistoff i trinn 1,10. - Vask lysbildene med PBST i 5 min 3x.
- Forbered den pepperrotperoksidasekonjugerte streptavidin (SA-HRP)-løsningen (500 μL for to lysbilder) ved å legge til 0,5 μL SA-HRP i 499 μL PBS. Den endelige konsentrasjonen er 1 μg/ml.
- Inkuber med SA-HRP-løsningen. Rist av PBST fra lysbildene, og dekk raskt lysbildene med tilstrekkelig SA-HRP-løsning. Inkuber lysbildene i et fuktet kammer i 0,5 timer ved RT.
- Vask lysbildene med PBST i 5 min 3x.
- Forbered fluorophore-tyramidoppløsningen ved å fortynne fluorophore-tyramid med fortynningsbufferen i henhold til produsentens instruksjoner (f.eks. 5 μL fluorophore-tyramid i 496 μL fortynningsbuffer).
- Utfør signalutviklingen med fluorophore-tyramid ved å riste av PBST fra lysbildene og raskt dekke lysbildene med tilstrekkelig fluorophore-tyramidløsning. Inkuber i et fuktet kammer i 1 min ved RT. Inkubasjonstiden kan justeres for å oppnå ønsket fluorescensintensitet. Stopp reaksjonen ved å overføre lysbildene til en Coplin-krukke som inneholder PBST. Vask lysbilder med PBST i 3 min 2x.
- Signaler kan raskt kontrolleres under et fluorescensmikroskop for å bekrefte resultatet på dette stadiet. Hvis følgesedler ikke brukes, må du bruke en dråpe glyserol:PBS (1:1) på hver del for å holde prøvene fuktige. Vask lysbilder med PBST i 3 min 2x. Lysbilder kan lagres i PBST ved 4 °C i noen dager før de flyttes til neste trinn.
2. Fjern det første antistoffet
- Plasser lysbildene i 275 ml kokende natriumsitratoppløsning (10 mM, pH = 6,0) i minst 8 min. Hold oppløsningen kokende ved å plassere lysbildene flatt på bunnen av en 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) pipetteboks med lokk og mikrobølgeoppløsningen på 70% effekt i en 700 W mikrobølgeovn ovn i 8 min. Hvis en lengre strippingstid foretrekkes, kan det være nødvendig å toppe bufferen ved hjelp av en kokende natriumsitratløsning for å holde lysbildene nedsenket i bufferoppløsning til enhver tid. Fjern pipettespissen fra mikrobølgeovnen, åpne lokket og la oppløsningen avkjøles ved RT i minst 20 min.
- Overfør lysbildene til en Coplin-krukke som inneholder PBST. Vask med PBST i 5 min 3x. Hvis neste trinn hvis det ikke utføres umiddelbart, lagrer du lysbildene i en Coplin-krukke med PBST ved RT i noen timer eller ved 4 °C i 1-2 dager.
3. Flekk med det andre antistoffet
- Start fra blokkeringstrinnet og følg de samme prosedyrene i trinn 1.5 til trinn 1.14. Ved signalutviklingstrinnene (trinn 1,15 og trinn 1.16), bruk fluorophore-tyramid i et annet fluorescensspektrum.
MERK: Lysbilder kan fjernes ved hjelp av denne metoden flere ganger for å tillate multipleksfarging. Det siste antistoffet krever ikke fluorophore-tyramid som reporter. Et fluoropfor-konjugert sekundært antistoff kan brukes til å vise signaler fra det siste primære antistoffet. - Inkubatsklier med 2 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindzol (DAPI) eller Hoechst-oppløsning i 1 min ved RT hvis kjernetellerfarging er nødvendig. Vask deretter lysbildene med PBST i 3 min 2x.
4. Bildebehandling ved hjelp av et fluorescensmikroskop for å oppdage signaler
- Monter en dekkslip med en dråpe monteringsmedium egnet for immunfluorescens.
- For bildebehandling, bruk et fluorescensmikroskop for å oppdage signaler fra hver fluorescenskanal. Start med atomfargingskanalen (DAPI) og 4x-objektivet for å lokalisere vevet på lysbildet.
- Bytt til 10x-objektivet for bildebehandling. Juster eksponeringstiden (300 ms) og lyskildeintensiteten (80 % intensitet). Juster disse innstillingene hvis signalet er for sterkt eller for mørkt. Ta bilder av hver kanal uten å flytte scenen. Refokusering kan være nødvendig for hver kanal. Slå sammen bildene fra hver kanal ved hjelp av mikroskopets programvare eller ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene ble hentet fra prøver behandlet med alle tiltak som er beskrevet, inkludert antigenhentingstrinn 1.2. Alle sekundære antistoffer som brukes her var biotinylated. Fluorophore-tyramid ble brukt til å utvikle signaler fra første og andre primære antistoffer. Bilder ble tatt ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med en FITC-kube (for grønn fluorescens), en TxRED-kube (for Cy3) og en DAPI-kube (for DAPI).
Mikrowaving-mediert stripping eliminerer kryss-reaktivitet.
Mouse FFPE binyreseksjoner ble farget ved hjelp av to primære kaninantistoffer. Uten stripping (Figur 1A-C),det sekundære antistoffet for TH plukket opp 3βHSD (+) nettsteder og ga røde signaler i binyrebarken (Figur 1B). Mangelen på stripping førte til de falske kolokaliseringssignalene sett i gult (figur 1C). Denne kryssreaktiviteten kommer fra (1) HRP-enzymet som katalyserte den første tyramidreaksjonen og (2) antistoffartene kryssreaktivitet. For å fjerne antistoffet kryssreaktivitet og HRP fra den første immunstaining, testet vi en 1 min(Figur 1D-F) og en 8 min mikrobølgeovn-mediert stripping (Figur 1G-I). Begge behandlingene var tilstrekkelige til å eliminere det uspesifikke signalet, noe som ga rene doble flekker (Figur 1F,I). Den negative kontrollen fulgte alle de samme trinnene med unntak av inkubasjon med primære antistoffer (figur 1J). Ingen signifikante signaler ble plukket opp i den negative kontrollen. Vi fant at en 8 min stripping i en kokende sitrat buffer var tilstrekkelig til å eliminere antistoff kryssreaktivitet for mange antistoffer som vanligvis brukes i binyrene (Figur 2).
Begrensningen - effekten av mikrobølgemediert stripping er antistoffavhengig.
Selv om mikrobølgemedierte stripping som brukes i denne protokollen fungerer for de fleste tilfeller, er det begrensninger på denne metoden. For noen antistoffer kan det hende at en mikrobølgemediert strippingsmetode med en sitratbuffer ikke helt fjerner antistoffets kryssreaktivitet. For eksempel fjernet en 8 min stripping de fleste uspesifikke signaler fra musen anti-TH antistoff og musen anti-CYP2F2 antistoff, men et svakt falskt positivt signal var fortsatt påviselig (medulla i figur 3E og den indre cortex i figur 3K). Merk at en økning av mikrowaving ser ut til 20 min fortsatt ikke helt fjerne antistoff kryssreaktivitet(Figur 3H,K).
Figur 1: Representativ dobbel immunbeising på P1 FFPE-musbinyrene. FFPE mus binyreseksjoner ble farget med to primære antistoffer fra kaniner: anti-3βHSD (grønn = cortex), anti-TH (rød = medulla). De tre gruppene av flekker inkluderer de tre forskjellige stripping prosedyrer som brukes: (A-C) ingen stripping, (D-F) 1 min stripping, og (G-I) 8 min stripping. Vær oppmerksom på at uten mikrowaving plukket det sekundære antistoffet med TH fortsatt opp 3βHSD-signaler, mens spesifikke fargingsresultater ble oppnådd i de 1 min og 8 min mikrobølgeovnbehandlede gruppene. Det er ikke noe positivt signal i den negative kontrollen, ikke inkubert med primære antistoffer. Skala bar = 100 μm. DAPI = cellekjerner, blå. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representativ dobbel immunbeising på P21 FFPE-musbinyrene. FFPE-musbinyreseksjonene ble farget med to primære antistoffer fra kaniner i følgende rekkefølge: anti-β-catenin (grønn = ytre cortex) og deretter anti-20αHSD (rød = indre cortex). En 8 min stripping trinn ble utført i mellom. Skala bar = 100 μm; DAPI = cellekjerner, blå. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Noen antistoffer kan ikke være fullstendig strippet, noe som kan føre til svake uspesifikke signaler. FFPE-musbinyreseksjonene ble farget med to primære antistoffer fra mus: anti-CYP2F2 (grønn = indre cortex) og anti-TH (rød = medulla). Resultatene fra ingen stripping gruppe (A-C) viste at reaksjonene for å oppdage CYP2F2 protein fortsatt farget TH (+) området. En falsk kolokalisering ble sett i binyremedulla (C). Selv om en 8 min og en 20 min mikrobølgeovn behandling redusert grønn fluorescens intensitet i medulla, en merkbar bakgrunn er fortsatt til stede (D-I). Anti-CYP2F2 antistoff er et annet eksempel som viser at kryssreaktiviteten ikke kan fjernes helt selv etter 20 min mikrowaving (J-L). Vær oppmerksom på at det ikke var noe positivt signal i den negative kontrollen, ikke inkubert med primære antistoffer, noe som indikerer at det falske positive signalet var fra antistoffets kryssreaktivitet (M). Skala bar = 100 μm; DAPI = cellekjerner, blå. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multipleks immunstaining er nyttig for å undersøke cellulær kolokalisering av to eller flere antigener. Denne mye brukte teknikken gir overbevisende kolokaliseringsresultater når primære antistoffer konjugeres med forskjellige journalister (direkte farging). Imidlertid gir direkte farging vanligvis svakere signaler sammenlignet med indirekte flekker, noe som innebærer konjugerte sekundære antistoffer for å oppdage de primære antistoffene. I indirekte farging er et multiloksimmunostainingsresultat av høy kvalitet avhengig av om de sekundære antistoffene kan skille mellom de ulike primære antistoffene. På grunn av mulig antistoff kryssreaktivitet, multipleks farging utnytte indirekte farging metoden er sett tydeligere med primære antistoffer fra ulike vertsarter. Carl og andre utviklet en protokoll ved hjelp av et overskudd av unconjugert IgG F (ab) fragment for å blokkere antistoff kryssreaktivitet1. En lignende strategi brukes i "mus-på-mus" farging som bruker en F (ab) monomeric anti-mus antistoff for å hindre anti-mus sekundær antistoff fra å oppdage noen endogene mus immunoglobulin i vevet. Denne blokkeringsmetoden er imidlertid tidkrevende og kan ikke helt blokkere antistoffer fra tidligere trinn, spesielt hvis detektering av antigener er av høy overflod2.
Varmemedierte stripping er en annen metode for å forhindre antistoff kryssreaktivitet i multipleks immunstaining. Konseptet ligner på stripe og reprobe metode for en vestlig flekk. Bruken av mikrobølgeovn for å koke lysbildene i en sitratbuffer hadde en markert positiv effekt på blokkering av antistoffet ser ut til å være på tvers av reaktivitet. To 5 min mikrobølgeovn behandlinger mellom sekvensielle runder med koloreketrisk immunstaining tillate påvisning av flere antigener på samme lysbilde ved hjelp av mus monoklonale antistoffer2. Mikrobølgebehandlinger kombinert med thyramidesignalforsterkning (TSA)-metoden, som bruker fluorophore-tyramid som substrat av HRP, er også nyttige for immunfluorescens dobbel farging3,6,7. Mikrobølgebehandlingen mellom første og andre fargesykluser blokkerer aktiviteten til det første immunkomplekset uten å vaske ut sin fluorescerende tyramidnedbør. En mikrobølgebehandling kan imidlertid ikke være i stand til å forhindre kontaminering helt ved flekker8. Selv om noen metoder ved hjelp av ulike typer stripping buffere kan gi en bedre stripping effekt, spesialiserte buffere med lengre inkubasjonstider er nødvendig, eller prøver må gjennomgå bildeoppkjøp før en annen flekk påføres4,5,7,9,10,11. Her viser vi en enkel metode med en mindre komplisert prosedyre og en felles buffer for mikrobølgemediert antigengjenfinning i multipleks immunofluorescerende farging. Selv om denne metoden eliminerer de fleste kryssreaktivitet, bør brukerne være klar over en mulig svak falsk kolokalisering sett med noen antistoffer selv etter en 20 min mikrobølgeovn behandling.
Endogene biotin kan brukes som en markør for steroidogene celler i binyrebarken12. Streptavidin-konjugert fluorophore alene er tilstrekkelig til å oppdage endogene biotin og lyser opp hele binyrebarken, spesielt i frosne seksjoner. Fordi endogene biotin vanligvis er blokkert i FFPE-prøver, er avidin-biotin-peroksidaseprosedyren (dvs. ABC kit) fortsatt mye brukt til å forsterke mål i FFPE binyreprøver. Det er viktig å merke seg at antigengjenfinningstrinnet også avslører endogene biotin og induserer immunaktiviteten13. Fordi vår metode kombinerer mikrobølgemediert antigengjenfinning og bruk av streptavidin-konjugert HRP, er det mulig at endogene biotin vil føre til falske positive signaler, spesielt i vev rik med endogene biotin (f.eks lever, nyrer og noen svulster)13. Hvis avidin-biotin-peroxidase prosedyren er nødvendig for å forsterke signalet, kan et ekstra blokkeringstrinn som preinkubasjon med fri avidin og gratis biotin bidra til å redusere det endogene biotinsignalet14. Mens vår metode gir en lav endogene biotin bakgrunn på FFPE mus binyrene, er det viktig å alltid inkludere en negativ kontroll med hver prøve til enhver tid når du bruker avidin-biotin-peroxidase prosedyren. Den alternative tilnærmingen er å bruke et peroksidase-konjugert sekundært antistoff i stedet for det biotinylated sekundære antistoffet.
Våre resultater viser at mikrobølgebehandling med en sitratbuffer er en nyttig metode for multipleks immunofluorescensfarging. Det bør imidlertid bemerkes at ikke alle kryss-reaktiviteter kan være fullt blokkert. En svak falsk kolokalisering er mulig. Denne protokollen kan brukes som en alternativ tilnærming når en passende kombinasjon av primære antistoffer fra forskjellige vertsarter ikke er tilgjengelig. Brukere bør være klar over mulig falsk positiv fra gjenværende kryssreaktivitet samt gjenvunnet endogene biotin. Riktige negative kontroller bør inkluderes til enhver tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av NIH R00 HD032636.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1,000 dilution |
| Microwave oven, 700 W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz | SC-25269 | 1:1,000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
