Summary
Было установлено несколько различных методов мультиплексного иммуностоинга с использованием первичных антител одного и того же вида хозяев. Здесь мы описываем использование микроволновой опосредованной антитела зачистки и фторофора-тирамид блокировать антитела поперечной реактивности во время мультиплексиммуностина на формалин фиксированной парафин-встроенных мыши надпочечников разделов.
Abstract
Иммуностоинг широко используется в биомедицинских исследованиях, чтобы показать клеточное выражение картины данного белка. Мультиплекс иммуностоидает позволяет маркировки с использованием нескольких первичных антител. Чтобы свести к минимуму кросс-реактивность антител, мультиплекс иммуномаркировки с использованием косвенного окрашивания требует немаркированных первичных антител от различных видов хозяина. Однако, соответствующее сочетание различных видов антител не всегда доступна. Здесь мы описываем метод использования немаркированных первичных антител из тех же видов хозяев (например, в данном случае оба антитела от кролика) для мультиплекса иммунофлуоресценции на формалино-фиксированной парафин-встроенных (FFPE) мыши надпочечников разделов. Этот метод использует ту же процедуру и реагенты, используемые в шаге поиска антигена, чтобы лишить активность ранее окрашенных первичного комплекса антител. Слайды были окрашены первым первичным антителом с использованием общего протокола иммуностоинга с последующим связывающим шагом с биотинилатированным вторичным антителом. Затем в качестве субстрата использовался метод развития сигнала авидин-биотин-пероксидаза. Иммуноактивность первого первичного комплекса антител была снята путем погружения в микроволновой кипящей цитрат натрия раствор в течение 8 минут. Нерастворимый фторофор-тирамид осаждения остались на образце, что позволило слайд быть окрашены с другими первичными антителами. Хотя этот метод устраняет большинство ложных положительных сигналов, некоторый фон от перекрестной реактивности антител может остаться. Если образцы обогащены эндогенным биотином, пероксидаза-конъюгированных вторичных антител может быть использована для замены биотинилаповых вторичных антител, чтобы избежать ложного срабатывания от восстановленного эндогенного биотина.
Introduction
В мультиплексе иммуносточинов, прямое окрашивание с использованием конъюгированных первичных антител может обеспечить информативные результаты. Без использования вторичных антител, метод прямого окрашивания имеет низкий риск ложных сигналов колокализации от перекрестной реактивности антител. Однако конъюгированные репортеры (фторофор, ферменты) или биотин на первичном антителе ограничивают его использование в будущем. Кроме того, косвенное иммуностоирование обычно обеспечивает более сильные сигналы с помощью неконъюгированных первичных антител с помеченными вторичными антителами. В идеале, неконъюгированные первичные антитела, используемые в мультиплексном иммуностонинге, должны поступать от различных видов хозяев, чтобы избежать перекрестной реактивности антител. Однако, соответствующее сочетание первичных антител от различных видов хозяина не всегда доступны.
Было установлено несколько методов для устранения риска реакции вторичных антител нежелательным первичным антителом. Одним из распространенных методов является использование мономерных антител F (AB) для блокирования любых оставшихся связывающих эпитопов на первом первичном комплексе антител перед окрашиванием второго первичного антитела1. Зачистка антител, которая похожа на полосу и повторное исследование западного листа побот, удаляет ранее окрашенные антитела комплекса без зачистки осаждения обнаруживаемых молекул репортера, таких как 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид (DAB)2 и флуоресцентные тирамида осаждения3. С помощью этого метода молекулы репортера в разных цветах могут показывать результат мультиплекса на одном слайде. Мультиплексок окрашивания также достижимо путем полного удаления ранее отложенных слоев антител и выравнивание впоследствии приобретенных изображений из других антител4,5. Все эти методы дают надежные результаты, хотя каждый метод имеет свои ограничения и требует либо сложных процедур, либо специальной системы визуализации.
Настоящий протокол показывает применение метода зачистки антител с использованием широко доступных буферов. Этот протокол может быть использован для выполнения мультиплекс иммунофторных окрашивания на формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE) мыши надпочечников разделы с двумя немаркированных первичных антител из тех же видов хозяина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Окрашивание первым антителом
- Dewax и регидратировать FFPE слайды с 5 мин, выделенных на каждый из следующих шагов: ксилен или эквивалентные реагенты 3x, 100% этанол 2x, 95% этанола 1x, 70% этанола 1x, 50% этанола 1x, и перегоняемая вода 2x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды должны оставаться влажными, начиная с этого шага регидратации до монтажа в заключительном шаге. - Для дополнительного поиска антигена поместите слайды в 275 мл раствора цитрата натрия (10 мм, рН 6,0) в течение 8 мин. Чтобы сохранить раствор кипения, поместите слайды плашмя на дне 14 х 9,5 х 9 см3 (W х L х H) pipette наконечник поле с крышкой и микроволновой раствор на 70% мощности в микроволновой печи 700 Вт в течение 8 минут. Затем выньте трубчатый ящик из микроволновой печи, откройте крышку и дайте раствору остыть при комнатной температуре (RT) не менее 20 минут.
- Передача слайдов в банку Коплин, содержащий PBST (фосфат-буферный солевой раствор с 0,1% полисорбат 20/80). Вымойте с PBST в течение 5 мин 3x. Если не сразу перейти к следующему шагу, хранить слайды на этом шаге с PBST в банку Коплин на RT в течение нескольких часов или при 4 градусов по Цельсию в течение 1-2 дней, если не сразу перейти к следующему шагу.
- Для подготовки блокирующего раствора используйте нормальную сыворотку вторичного вида антител в качестве блокирующего реагента. Также могут использоваться другие коммерческие блокирующие реагенты. При использовании нормальной сыворотки, используемой для исследования, представленного в данном исследовании, добавьте 100 qL нормальной сыворотки осла к 4,9 мл PBST. Блокирующее решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 3 дней.
- Для блокирования, стряхните PBST со слайдов и быстро накройте их достаточным блокирующим решением. Инкубировать горки на RT в увлажненной камере в течение 30 минут.
- Подготовьте основной раствор антитела (500 л для двух слайдов) с помощью блокирующего раствора, чтобы разбавить первичное антитело до нужной концентрации. Раствор следует хранить на льду до использования.
- Для 3'HSD, добавьте 2 зл 3'HSD в 498 л блокирующего раствора.
- Для TH добавьте 0,5 л антитела TH в 499 л блокирующего раствора.
- Для катенина добавьте 1 qL антитела к-катенина в 499 л блокирующего раствора.
- Для 20'HSD, добавить 1 л 20 "HSD антитела в 499 Л блокирующего раствора.
- Для CYP2F2 добавьте 2 qL антитела CYP2F2 в 498 л блокирующего раствора.
- Инкубировать с первичным антителом, стряхивая блокирующий раствор со слайдов, и быстро покрывая их достаточным первичным антителом раствором. Инкубировать горки в увлажненной камере на ночь при 4 градусах Цельсия. Во время инкубации горки могут быть покрыты небольшим кусочком парафина, чтобы предотвратить высыхание.
- На следующее утро мыть слайды с PBST в течение 5 мин 3x.
- Подготовьте вторичный раствор антитела (500 л для двух слайдов) с помощью блокирующего раствора для разбавления биотинилапотированных вторичных антител к желаемой концентрации (например, 1 кЛ антимышечного антитела осла или осла анти-кроличьего антитела в 499 л блокирующих раствора). Раствор следует хранить на льду до использования.
- Инкубировать со вторым антителом, стряхивая PBST со слайдов и быстро покрывая их достаточным вторичным антителом раствором. Инкубировать горки в увлажненной камере в течение 1 ч на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эндогенный биотин является проблемой, используйте пероксидаза-конъюгированных вторичных антител вместо биотинилаповых вторичных антител. Перейти к шагу 1.14 при использовании пероксидазы-конъюгированных вторичных антител в шаге 1.10. - Вымойте слайды с PBST в течение 5 мин 3x.
- Подготовьте раствор хрена пероксидазы-конъюгированного стрептавидина (SA-HRP) (500 л для двух слайдов), добавив 0,5 л SA-HRP в 499 Л ПБС. Окончательная концентрация составляет 1 мкг/мл.
- Инкубировать с решением SA-HRP. Встряхните PBST со слайдов и быстро покройте слайды достаточным решением SA-HRP. Инкубировать горки в увлажненной камере для 0,5 ч на RT.
- Вымойте слайды с PBST в течение 5 мин 3x.
- Подготовьте раствор фторофор-тирамид путем разбавления флюорофор-тирамид его буфером разбавления в соответствии с инструкциями производителя (например, 5 л флюорофор-тирамида в 496 л буфера разбавления).
- Выполните развитие сигнала с помощью фторофора-тирамида, стряхивая PBST со слайдов и быстро покрывая слайды достаточным раствором фторрофора-тирамида. Инкубировать в увлажненной камере в течение 1 мин на RT. Время инкубации может быть скорректировано для получения желаемой интенсивности флуоресценции. Остановите реакцию, переведя слайды в банку Коплина, содержащую PBST. Вымойте слайды с PBST для 3 мин 2x.
- Сигналы могут быть быстро проверены под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить результат на данном этапе. Если крышки не используются, нанесите каплю глицерола:PBS (1:1) на каждый раздел, чтобы сохранить образцы влажными. Вымойте слайды с PBST для 3 мин 2x. Слайды могут храниться в PBST при 4 градусах по Цельсию в течение нескольких дней, прежде чем перейти к следующему шагу.
2. Стрип первое антитело
- Поместите слайды в 275 мл кипящего раствора цитрата натрия (10 мм, рН 6,0) не менее 8 мин. Держите раствор кипения, поместив слайды плоскими на дно 14 х 9,5 х 9 см3 (W x L x H) пипетка наконечник поле с крышкой и микроволновой печи раствор на 70% мощность юаней. Если предпочтение отдает более длительное время зачистки, может потребоваться дополнить буфер с помощью кипящего натриевого цитрата, чтобы слайды постоянно погружались в буферное решение. Снимите трубную коробку из микроволновой печи, откройте крышку и дайте раствору остыть на RT не менее 20 минут.
- Перенесите слайды в банку Coplin, содержащую PBST. Вымойте с PBST в течение 5 мин 3x. Если следующий шаг, если не выполняется немедленно, хранить слайды в банку Коплин с PBST на RT в течение нескольких часов или при 4 градусов по Цельсию в течение 1-2 дней.
3. Пятно со вторым антителом
- Начните с блокирующего шага и следуйте тем же процедурам в шаге 1.5 через шаг 1.14. На этапах разработки сигнала (шаг 1.15 и шаг 1.16) используйте фторофор-тирамид в другом спектре флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут быть лишены с помощью этого метода несколько раз, чтобы мультиплекс окрашивания. Последнее антитело не требует флюорофор-тирамид в качестве репортера. Фторофор-конъюгированные вторичные антитела могут быть использованы для показа сигналов от последнего первичного антитела. - Инкубировать слайды с 2 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) или Hoechst решение в течение 1 мин на RT, если ядерная счетчик окрашивания необходимо. Затем мыть слайды с PBST в течение 3 мин 2x.
4. Изображение с помощью флуоресцентного микроскопа для обнаружения сигналов
- Установите крышку с каплей монтажа среды подходит для иммунофлуоресценции.
- Для визуализации используйте флуоресцентный микроскоп для обнаружения сигналов каждого канала флуоресценции. Начните с ядерного окрашивания (DAPI) канал и 4x объектив, чтобы найти ткани на слайде.
- Переключитесь на 10-x объектив для визуализации. Отрегулируйте время экспозиции (300 мс) и интенсивность источника света (интенсивность 80%). Отрегулируйте эти настройки, если сигнал слишком яркий или слишком темный. Сфотографируйте каждый канал, не двигая сцену. Для каждого канала может потребоваться переориентация. Слияние изображений с каждого канала с помощью программного обеспечения микроскопа или ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты были получены из образцов, обработанных со всеми описанными шагами, включая шаг поиска антигена 1.2. Все вторичные антитела, используемые здесь, были биотинителами. Флурофор-тирамид использовался для разработки сигналов от первого и второго первичных антител. Изображения были получены с помощью флуоресценции микроскоп оснащен КУБ FITC (для зеленой флуоресценции), Куб TxRED (для Cy3), и куб DAPI (для DAPI).
Микроволновая печь опосредовано зачистки устраняет поперечной реактивности.
Мышь FFPE надпочечников разделы были окрашены с помощью двух основных антител кролика. Без зачистки(Рисунок 1A-C), вторичное антитело для TH взял 3"HSD (я) сайтов и дал красные сигналы в коре надпочечников (Рисунок 1B). Отсутствие зачистки привело к ложным сигналам колокализации, видимым желтым цветом(рисунок 1C). Эта перекрестная реактивность исходит от (1) фермента HRP, который катализировал первую реакцию тирамида и (2) кросс-реактивность видов антител. Чтобы удалить перекрестную реактивность антител и HRP с первого иммунодефицита, мы протестировали 1 мин(Рисунок 1D-F) и 8 мин микроволновой опосредованной зачистки(Рисунок 1G-I). Оба лечения были достаточными для устранения неспецифического сигнала, давая чистые двойные результаты окрашивания(Рисунок 1F,I). Отрицательный контроль следовал всем тем же шагам, за исключением инкубации с первичными антителами(рисунок 1J). В отрицательном контроле не было обнаружено существенного сигнала. Мы обнаружили, что 8 мин зачистки в кипящей цитрат буфера было достаточно, чтобы устранить антитела кросс-реактивность для многих антител, обычно используемых в надпочечнике (Рисунок 2).
Ограничение – эффективность микроволновой опосредоченной зачистки зависит от антител.
Хотя свпой-опосредованное зачистка, используемая в этом протоколе, работает в большинстве случаев, этот метод имеет ограничения. Для некоторых антител, микроволновой опосредованный метод зачистки с цитратом буфера не может полностью удалить антитела перекрестной реактивности. Например, 8 мин зачистки удалены большинство неспецифических сигналов от мыши анти-TH антитела и мыши анти-CYP2F2 антитела, но слабый ложноположительный сигнал по-прежнему обнаруживаются (медулла на рисунке 3E и внутренней коры на рисунке 3K). Обратите внимание, что увеличение времени микроволновой печи до 20 мин до сих пор не полностью удалить антитела перекрестной реактивности(рисунок 3H, K).
Рисунок 1: Представитель двойного иммунодефицита на надпочечники мыши P1 FFPE. Разделы надпочечников мыши FFPE были окрашены двумя основными антителами от кроликов: анти-3'HSD (зеленый и кора), анти-TH (красный й медулла). Три группы пятен включают в себя три различных процедур зачистки используется: (A-C) не зачистки, (D-F) 1 мин зачистки, и (G-I) 8 мин зачистки. Обратите внимание, что без микроволновой печи, вторичное антитело с TH по-прежнему взял 3"HSD сигналов, в то время как конкретные результаты окрашивания были получены в 1 мин и 8 мин микроволновой обработки групп. В отрицательном контроле нет положительного сигнала, не инкубируется первичными антителами. Шкала бар 100 мкм. DAPI - ядра клеток, синий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель двойного иммунодефицита на P21 FFPE мыши надпочечников. Разделы надпочечников мыши FFPE были окрашены двумя основными антителами от кроликов в следующем порядке: анти-к-катенин (зеленый и внешняя кора), а затем анти-20"HSD (красный и внутренняя кора). 8 мин зачистки шаг был выполнен между ними. Шкала бар 100 мкм; DAPI - ядра клеток, синий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Некоторые антитела не могут быть полностью лишены, что может привести к слабым неспецифическим сигналам. Разделы надпочечников мыши FFPE были окрашены двумя основными антителами мышей: анти-CYP2F2 (зеленая и внутренняя кора) и анти-TH (красный и медулла). Результаты не зачистки группы (A-C) показали, что реакции для обнаружения белка CYP2F2 по-прежнему окрашенных TH (я) области. Ложная колокализация была замечена в надпочечников medulla(C). Хотя 8 мин и 20 мин микроволновой обработки снижение интенсивности зеленой флуоресценции в медулла, заметный фонпо-прежнему присутствует (D-I). Анти-CYP2F2 антитела является еще одним примером, показывающим, что перекрестная реактивность не может быть полностью удалена даже после 20 минут микроволновой печи (J-L). Обратите внимание, что не было никакого положительного сигнала в отрицательном контроле, не инкубируется с первичными антителами, указывая ложноположительный сигнал был от перекрестной реакции антитела(M). Шкала бар 100 мкм; DAPI - ядра клеток, синий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мультиплекс иммуностоинг полезно для изучения клеточной колокализации двух или более антигенов. Этот широко используемый метод дает убедительные результаты colocalization когда главным образом антитела спрягиваются с по-разному репортерами (сразу окрашивание). Тем не менее, прямое окрашивание обычно обеспечивает более слабые сигналы по сравнению с косвенным окрашиванием, которое включает в себя конъюгированные вторичные антитела для обнаружения первичных антител. При косвенном окрашивании, высококачественный мультиплекс иммуностоинга результат зависит от того, вторичные антитела могут различать различные первичные антитела. Из-за возможной кросс-реактивности антител, мультиплекс окрашивания с использованием непрямого метода окрашивания рассматривается более четко с первичными антителами от различных видов хозяина. Карл и другие разработали протокол, используя избыток неконъюгированного фрагмента IgG F (ab), чтобы блокировать перекрестную реактивность антител1. Аналогичная стратегия используется в "мышь-на-мышь" окрашивание, которое использует F (AB) мономерных анти-мышь анти-мышь антитела для предотвращения анти-мышь вторичного антитела от обнаружения любых эндогенных иммуноглобулин мыши в ткани. Однако, этот метод блокирования занимает много времени и не может полностью блокировать антитела от предыдущих шагов, особенно если обнаружение антигенов имеют большое изобилие2.
Тепло-опосредованный зачистки является еще одним методом для предотвращения антител кросс-реактивность в мультиплекс иммуно-спотов. Концепция похожа на полосу и метод повторного зонда западной подьеносие. Использование микроволновой печи для кипения слайдов в цитрат буфера оказало заметное положительное влияние на блокирование поперечной реактивности антител. Два 5 мин микроволновой обработки между последовательными раундами колориметрического иммуноспомингования позволяют обнаружить несколько антигенов на том же слайде с помощью мыши моноклональных антител2. Микроволновое лечение в сочетании с тирамид сигнал усиления (TSA) метод, который использует фторофор-тирамид в качестве субстрата HRP, также полезны для иммунофлюоресценции двойное окрашивание3,6,7. Микроволновая обработка между первым и вторым циклами окрашивания блокирует активность первого иммунокомплекса без вымывания его флуоресцентных осадков тирамида. Тем не менее, микроволновая обработка не может быть в состоянии полностью предотвратить загрязнение в окрашивании8. Хотя некоторые методы, использующие различные типы зачистки буферов может обеспечить лучшую эффективность зачистки, специализированные буферы с более длительным временем инкубации необходимы, или образцы должны пройти приобретение изображения до другого пятна применяется4,5,7,9,10,11. Здесь мы демонстрируем простой метод с менее сложной процедурой и общим буфером для поиска при посредничестве СВЧ антигена в мультиплексном иммунофторном окрашивании. Хотя этот метод устраняет большинство кросс-реактивность, пользователи должны быть осведомлены о возможной слабой ложной колокализации видели с некоторыми антителами даже после 20 минут микроволновой обработки.
Эндогенный биотин может быть использован в качестве маркера стероидогенных клеток в коре надпочечников12. Стрептавидин-конъюгированный фторофор достаточно только для обнаружения эндогенного биотина и освещает всю кору надпочечников, особенно в замороженных участках. Поскольку эндогенный биотин обычно блокируется в образцах FFPE, процедура avidin-biotin-peroxidase (т.е. комплект ABC) по-прежнему широко используется для усиления целей в образцах надпочечников FFPE. Важно отметить, что шаг по извлечению антигена также разоблачает эндогенный биотин и вызывает его иммуноактивность13. Поскольку наш метод сочетает в себе извлечение при посредничестве СВЧ антигена и использование стрептавидина-конъюгированного HRP, вполне возможно, что эндогенный биотин приведет к ложноположительным сигналам, особенно в тканях, богатых эндогенным биотином (например, печень, почки и некоторые опухоли)13. Если процедура avidin-biotin-peroxidase необходима для того чтобы усилить сигнал, то дополнительный блокируя шаг such as preincubation с свободным avidin и свободным биотином может помочь уменьшить сигнал биотина эндогена14. В то время как наш метод дает низкий эндогенный фон биотин на надпочечники мыши FFPE, важно всегда включать отрицательный контроль с каждым образцом во все времена при использовании алзин-биоттин-пероксидаза процедуры. Альтернативный подход заключается в использовании пероксидазы спряжение вторичных антител вместо биотинилаповых вторичных антител.
Наши результаты показывают, что микроволновая обработка с цитратным буфером является полезным методом для окрашивания мультиплексного иммунофлуоресценции. Однако следует отметить, что не все перекрестные действия могут быть полностью заблокированы. Возможна слабая ложная колокализация. Этот протокол может быть использован в качестве альтернативного подхода, когда не доступно надлежащее сочетание первичных антител различных видов хозяев. Пользователи должны быть осведомлены о возможном ложном срабатывании оставшейся перекрестной реактивности, а также восстановленного эндогенного биотина. Надлежащий отрицательный контроль должен быть включен в любое время.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается NIH R00 HD032636.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1,000 dilution |
| Microwave oven, 700 W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz | SC-25269 | 1:1,000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
