Summary
Flera olika metoder har fastställts för multiplex immunfärgning med hjälp av primära antikroppar från samma värdarter. Här beskriver vi användningen av mikrovågsmedierad antikroppsstrippning och fluoroffors-tyramid för att blockera antikroppskorsåteraktivitet under multiplex immunfärgning på formalin-fast paraffin-inbäddade musadrenal sektioner.
Abstract
Immunostaining används ofta i biomedicinsk forskning för att visa cellulärt uttryckmönster av ett visst protein. Multiplex immunfärgning tillåter märkning med hjälp av flera primära antikroppar. För att minimera antikroppskorsreaktivitet kräver multiplex immunfärgning med indirekt färgning omärkta primära antikroppar från olika värdarter. En lämplig kombination av olika arter finns dock inte alltid tillgänglig. Här beskriver vi en metod för att använda omärkta primära antikroppar från samma värdarter (t.ex. i detta fall är båda antikropparna från kanin) för multiplex immunfluorescens på formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) mus adrenal sektioner. Denna metod använder samma procedur och reagenser som används i antigenhämtningssteget för att skala aktiviteten hos det tidigare färgade primära antikroppskomplexet. Diabilder färgades med den första primära antikroppen med hjälp av en allmän immunfärgning protokoll följt av ett bindande steg med en biotinylated sekundär antikropp. Sedan användes en avidin-biotin-peroxidassignalutvecklingsmetod med fluoroffors-tyramid som substratet. Immunaktiviteten hos det första primära antikroppskomplexet togs bort genom nedsänkning i en mikrovågskokande natriumcitratlösning i 8 min. Den olösliga fluoroffors-tyramid nedfall kvar på provet, vilket gjorde att bilden kunde färgas med andra primära antikroppar. Även om denna metod eliminerar de flesta falska positiva signaler, kan viss bakgrund från antikroppskorsreaktivitet finnas kvar. Om proverna är berikade med endogen biotin kan en peroxidaskonjurat sekundär antikropp användas för att ersätta den biotinylated sekundära antikroppen för att undvika falskt positivt från återvunnen endogen biotin.
Introduction
Vid multiplex immunfärgning, direkt färgning med konjugerat primära antikroppar kan ge informativa resultat. Utan att använda sekundära antikroppar har den direkta färgningsmetoden en låg risk för falska samtidighetssignaler från antikroppskorsreaktivitet. Emellertid, de konjugerade reportrar (fluoroffor, enzymer) eller biotin på den primära antikroppen begränsa dess framtida användning. Alternativt ger indirekt immunfärgning vanligtvis starkare signaler genom att använda en okonjugerade primära antikroppar med en märkt sekundär antikropp. Helst bör okonjugerade primära antikroppar som används i multiplex immunfärgning komma från olika värdarter för att undvika antikroppskorsreaktivitet. En lämplig kombination av primära antikroppar från olika värdarter är dock inte alltid tillgänglig.
Flera metoder har fastställts för att eliminera risken för att den sekundära antikroppen reagerar med en oönskad primär antikropp. En vanlig metod är användningen av en F(ab) monomeric antikroppar för att blockera eventuella återstående bindande epitoper på den första primära antikroppar komplex innan färgning med den andra primära antibody1. Antibody strippning, som liknar remsan och reprobe av en västerländsk blot blad, tar bort tidigare färgade antikroppar komplex utan att strippa nedfallet av detekterbara reporter molekyler såsom 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)2 och fluorescerande tyramid nedfall3. Med denna metod kan reportermolekyler i olika färger visa ett multiplexresultat på samma bild. Multiplex färgning kan också uppnås genom fullständig borttagning av tidigare deponerade lager av antikroppar och anpassningen av senare förvärvade bilder från andra antikroppar4,5. Dessa metoder ger alla tillförlitliga resultat, även om varje metod har sina begränsningar och kräver antingen komplicerade förfaranden eller ett särskilt bildsystem.
Det aktuella protokollet visar tillämpningen av en antikroppsstrippningsmetod med användning av allmänt tillgängliga buffertar. Detta protokoll kan användas för att utföra multiplex immunfluorescerande färgning på formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) mus adrenal sektioner med två omärkta primära antikroppar från samma värdarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Färgning med den första antikroppen
- Devax och rehydratFFPE glider med 5 min tilldelas var t.ex.
Obs: Diabilder bör förbli fuktigfrån detta rehydreringssteg tills monteringi det sista steget. - För antigenhämtning som tillval placerar du bilderna i 275 ml kokande natriumcitratlösning (10 mM, pH = 6,0) i 8 min. För att hålla lösningen kokande, placera rutschkanorna platt på botten av en 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) pipett spetslåda med lock och mikrovågsugn lösningen på 70% ström i en 700 W mikrovågsugn i 8 min. Ta sedan bort pipetttippen från mikrovågsugnen, öppna locket och låt lösningen svalna i rumstemperatur (RT) i minst 20 min.
- Överför bilderna till en Coplin burk som innehåller PBST (fosfat-buffrad reslinje med 0,1% polysorbate 20/80). Tvätta med PBST i 5 min 3x. Om inte omedelbart flytta till nästa steg, lagra bilderna i detta steg med PBST i en Coplin burk på RT för ett par timmar eller vid 4 ° C i 1-2 dagar om inte omedelbart flytta till nästa steg.
- För att förbereda blockeringslösningen använd det normala serumet hos den sekundära antikroppens värdarter som blockerande reagens. Andra kommersiella blockerande reagenser kan också användas. Om du använder normalt serum som används för studien som presenteras i denna studie, tillsätt 100 μl normal åsna serum till 4,9 ml PBST. Blockeringslösningen kan förvaras vid 4 °C i upp till 3 dagar.
- För blockering, skaka av PBST från bilderna och snabbt täcka dem med tillräcklig blockeringslösning. Inkubera diabilderna på RT i en befuktad kammare i 30 min.
- Förbered den primära antikroppslösningen (500 μL för två diabilder) med hjälp av blockeringslösningen för att späda ut den primära antikroppen till önskad koncentration. Lösningen ska förvaras på is tills den används.
- För 3βHSD, tillsätt 2 μL av 3βHSD i 498 μL blockeringslösning.
- För TH, tillsätt 0,5 μl TH-antikroppar i 499 μL blockeringslösning.
- För β-catenin, tillsätt 1 μL β-catenin antikropp i 499 μl blockeringslösning.
- För 20αHSD, tillsätt 1 μL av 20αHSD antikroppar i 499 μl blockeringslösning.
- För CYP2F2, tillsätt 2 μL CYP2F2 antikroppar i 498 μL blockeringslösning.
- Inkubera med den primära antikroppen genom att skaka av blockeringslösningen från bilderna och snabbt täcka dem med tillräcklig primär antikroppslösning. Inkubera rutschkanorna i en befuktad kammare över natten vid 4 °C. Under inkubationsinkan bilderna täckas av en liten paraffinfilm för att förhindra uttorkning.
- Nästa morgon tvätta rutschkanorna med PBST i 5 min 3x.
- Förbered den sekundära antikroppslösningen (500 μL för två diabilder) med hjälp av blockeringslösningen för att späda ut den biotinylated sekundära antikroppen till önskad koncentration (t.ex. 1 μl åsna anti-mus antikropp eller åsna antikaninantikroppar i 499 μL av blockering lösning). Lösningen ska förvaras på is tills den används.
- Inkubera med den andra antikroppen genom att skaka av PBST från bilderna och snabbt täcka dem med tillräcklig sekundär antikroppslösning. Inkubera diabilderna i en befuktad kammare för 1 h på RT.
OBS: Om endogen biotin är ett problem, använd en peroxidas-konjugerat sekundär antikropp i stället för den biotinylated sekundära antikroppar. Hoppa till steg 1,14 om du använder en peroxidas-konjugerat sekundär antikropp i steg 1,10. - Tvätta bilderna med PBST i 5 min 3x.
- Förbered den pepparrotsperoxidaskonjuptavidin (SA-HRP) lösning (500 μL för två diabilder) genom att lägga till 0,5 μl SA-HRP i 499 μL PBS. Den slutliga koncentrationen är 1 μg/ml.
- Inkubera med SA-HRP-lösningen. Skaka av PBST från bilderna och täck snabbt bilderna med tillräcklig SA-HRP-lösning. Inkubera rutschkanorna i en fuktad kammare för 0,5 h på RT.
- Tvätta bilderna med PBST i 5 min 3x.
- Förbered fluorofforstyramidlösningen genom att späda fluoroffors-tyramid med utspädningsbuffertenligt tillverkarens anvisningar (t.ex. 5 μl fluoroffort-tyramid i 496 μl utspädningsbuffert).
- Utför signalutvecklingen med fluoroffors-tyramid genom att skaka av PBST från bilderna och snabbt täcka rutschkanorna med tillräcklig fluorofforare-tyramidlösning. Inkubera i en fuktad kammare i 1 min på RT. Inkubationstiden kan justeras för att erhålla önskad fluorescensintensitet. Stoppa reaktionen genom att överföra bilderna till en Coplin burk som innehåller PBST. Tvätta rutschkanorna med PBST i 3 min 2x.
- Signaler kan snabbt kontrolleras under ett mikroskop i fluorescens för att bekräfta resultatet i detta skede. Om täckskydd inte används, applicera en droppe glycerol:PBS (1:1) på varje avsnitt för att hålla proverna fuktiga. Tvätta rutschkanorna med PBST i 3 min 2x. Bilder kan förvaras i PBST vid 4 °C i några dagar innan du går vidare till nästa steg.
2. Strippa den första antikroppen
- Placera rutschkanorna i 275 ml kokande natriumcitratlösning (10 mM, pH = 6,0) i minst 8 min. Håll lösningen kokande genom att placera diabilderna platt på botten av en 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) pipettspetslåda med lock och microwaving lösningen på 70% ström i en 700 W mikrovågsugn i 8 min. Om en längre stripptid är att föredra kan det krävas att den överst på bufferten med hjälp av en kokande natriumcitratlösning för att alltid hålla bilderna nedsänkta i buffertlösning. Ta bort pipetttippen från mikrovågsugnen, öppna locket och låt lösningen svalna på RT i minst 20 min.
- Överför bilderna till en Coplin burk som innehåller PBST. Tvätta med PBST i 5 min 3x. Om nästa steg om det inte utförs omedelbart, förvara bilderna i en Coplin burk med PBST på RT i några timmar eller vid 4 °C i 1-2 dagar.
3. Fläck med den andra antikroppen
- Börja från blockeringssteget och följ samma procedurer i steg 1.5 till och med steg 1.14. Vid signalutvecklingsstegen (steg 1.15 och steg 1.16) använder du fluoroffors-tyramidien i ett annat fluorescensspektrum.
Bilder kan tas bort med den här metoden flera gånger för att tillåta multiplexfärgning. Den sista antikroppen kräver inte fluorofforare-tyramid som reporter. En fluorofforisk konjugerad sekundär antikropp kan användas för att visa signaler från den sista primära antikroppen. - Inkubera diabilder med 2 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) eller Hoechst lösning i 1 min på RT om kärnmotfärgning behövs. Tvätta sedan rutschkanorna med PBST i 3 min 2x.
4. Bildbehandling med hjälp av ett fluorescensmikroskop för att upptäcka signaler
- Montera ett täckslip med en droppe monteringsmedium som lämpar sig för immunfluorescens.
- För bildbehandling, använd ett fluorescensmikroskop för att upptäcka signaler från varje fluorescenskanal. Börja med den nukleära färgning (DAPI) kanal och 4x objektiv et för att lokalisera vävnaden på bilden.
- Växla till 10x-objektivet för bildbehandling. Justera exponeringstiden (300 ms) och ljuskällintensiteten (80 % intensitet). Justera dessa inställningar om signalen är för ljus eller för mörk. Ta bilder av varje kanal utan att flytta scenen. Det kan behövas en omfokusering för varje kanal. Slå samman bilderna från varje kanal med hjälp av mikroskopets programvara eller ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten erhölls från prover som behandlades med alla beskrivna steg 1.2, inklusive antigenhämtningssteg 1.2. Alla sekundära antikroppar som används här var biotinylated. Fluorofforsk-tyramid användes för att utveckla signaler från första och andra primära antikroppar. Bilder togs med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med en FITC-kub (för grön fluorescens), en TxRED kub (för Cy3) och en DAPI-kub (för DAPI).
Microwaving-medierad strippning eliminerar cross-reaktivitet.
Mus FFPE binjuresektioner färgas med hjälp av två primära kaninantikroppar. Utan strippning(figur 1A-C), den sekundära antikroppen för TH plockade upp 3βHSD (+) platser och gav röda signaler i binjurebarken(figur 1B). Bristen på strippning ledde till falska samlokaliseringssignaler som ses i gult (figur 1C). Denna korsreaktivitet kommer från (1) HRP-enzymet som katalyserade den första tyramidreaktionen och (2) antikroppsartens korsreaktivitet. För att ta bort antikroppskorsåteraktivitet och HRP från den första immunfärgning, testade vi en 1 min(Figur 1D-F)och en 8 min mikrovågsugn-medierad strippning(Figur 1G-I). Båda behandlingarna var tillräckliga för att eliminera den ospecifika signalen, vilket ger rena dubbla färgningsresultat(figur 1F,I). Den negativa kontrollen följde alla samma steg med undantag för inkubation med primära antikroppar(figur 1J). Ingen signifikant signal plockades upp i den negativa kontrollen. Vi fann att en 8 min strippning i en kokande citrat buffert var tillräcklig för att eliminera antikroppar korsreaktivitet för många antikroppar som vanligen används i binjuren(figur 2).
Begränsningen – effekten av den mikrovågsmedierade strippningen är antikroppsberoende.
Även om den mikrovågsmedierade strippningen som används i det här protokollet fungerar i de flesta fall finns det begränsningar för den här metoden. För vissa antikroppar kan en mikrovågsmedierad strippningsmetod med en citratbuffert inte helt ta bort antikroppskorsreaktiviteten. Till exempel, en 8 min strippning bort mest ospecifika signaler från musen anti-TH antikroppar och musen anti-CYP2F2 antikroppar, men en svag falsk positiv signal var fortfarande detekterbar (medulla i figur 3E och den inre cortex i figur 3K). Observera att en ökning av mikrowavingtiden till 20 min fortfarande inte helt tog bort antikroppskorsreaktivitet(figur 3H,K).
Figur 1: Representativ dubbel immunfärgning på P1 FFPE mus adrenals. FFPE mus adrenal sektioner färgas med två primära antikroppar från kaniner: anti-3βHSD (grön = cortex), anti-TH (röd = medulla). De tre grupperna av fläckar inkluderar de tre olika strippningförfaranden som används: (A-C) ingen strippning, (D-F) 1 min strippning, och (G-I)8 min strippning. Observera att utan mikrowaving, den sekundära antikropp med TH fortfarande plockade upp 3βHSD signaler, medan specifika färgning resultat erhölls i 1 min och 8 min mikrovågsugn behandlade grupper. Det finns ingen positiv signal i den negativa kontrollen, inte ruvad med primära antikroppar. Skalstång = 100 μm. DAPI = cellkärnor, blå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativ dubbel immunfärgning på P21 FFPE musadrenals. FFPE mus adrenal sektioner färgas med två primära antikroppar från kaniner i följande ordning: anti-β-catenin (grön = yttre cortex) och sedan anti-20αHSD (röd = inre cortex). Ett 8 min strippningssteg utfördes däremellan. Skalstång = 100 μm; DAPI = cellkärnor, blå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Vissa antikroppar får inte vara helt avskalade, vilket kan leda till svaga ospecifika signaler. FFPE mus adrenal sektioner färgas med två primära antikroppar från möss: anti-CYP2F2 (grön = inre cortex) och anti-TH (röd = medulla). Resultaten från no strippningsgruppen(A-C) visade att reaktionerna för att upptäcka CYP2F2-proteinet fortfarande färgade TH(+) området. En falsk colocalization sågs i binjuremedulla (C). Även om en 8 min och en 20 min mikrovågsbehandling minskade den gröna fluorescensintensiteten i medulla, finns fortfarande en märkbar bakgrund (D-I). Anti-CYP2F2-antikroppen är ett annat exempel som visar att korsreaktiviteten inte kan avlägsnas helt efter 20 minuters mikrowaving(J-L). Observera att det inte fanns någon positiv signal i den negativa kontrollen, inte ruvad med primära antikroppar, vilket indikerar att den falska positiva signalen var från antikroppens korsreaktivitet (M). Skalstång = 100 μm; DAPI = cellkärnor, blå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multiplex immunfärgning är användbart för att undersöka cellulär colocalization av två eller flera antigener. Denna allmänt använda teknik ger övertygande colocalization resultat när primära antikroppar är konjugerat med olika reportrar (direkt färgning). Direktfärgning ger dock vanligtvis svagare signaler jämfört med indirekt färgning, vilket innebär konjugerade sekundära antikroppar för att upptäcka de primära antikropparna. Vid indirekt färgning, en högkvalitativ multiplex immunfärgning resultat bygger på om de sekundära antikropparna kan skilja mellan de olika primära antikropparna. På grund av eventuell antikroppskorsreaktivitet ses multiplexfärgning med hjälp av den indirekta färgningsmetoden tydligare med primära antikroppar från olika värdarter. Carl och andra utvecklat ett protokoll med ett överskott av okonjugerade IgG F (ab) fragment för att blockera antikropps korsreaktivitet1. En liknande strategi används i "mus-på-mus" färgning som använder en F (ab) monomeric anti-mus antikropp för att förhindra anti-mus sekundära antikroppar från att upptäcka någon endogen mus immunglobulin i vävnaden. Emellertid, denna blockering metod är tidskrävande och får inte helt blockera antikroppar från tidigare steg, särskilt om detektering antigener är av högt överflöd2.
Värmemedierad strippning är en annan metod för att förhindra antikroppskorsåteraktivitet i multiplex immunfärgning. Konceptet liknar remsan och reprobe metoden för en västerländsk blot. Användningen av en mikrovågsugn för att koka bilderna i en citrat buffert hade en markant positiv effekt på att blockera antikroppskorsreaktivitet. Två 5 min mikrovågsbehandlingar mellan sekventiella rundor av kolorimetrisk immunfärgning tillåter detektion av flera antigener på samma bild med hjälp av mus monoklonala antikroppar2. Mikrovågsbehandlingar i kombination med metoden thyramid signalförstärkning (TSA), som använder fluoroffors-tyramid som substrat för HRP, är också användbara för immunfluorescens dubbel färgning3,6,7. Mikrovågsbehandlingen mellan den första och andra färgningscyklerna blockerar aktiviteten hos det första immunkomplexet utan att tvätta ut sin fluorescerande tyramidnederbörd. En mikrovågsbehandling kanske inte helt kan förhindra kontaminering vid färgning8. Även om vissa metoder med hjälp av olika typer av strippning buffertar kan ge en bättre strippning effekt, specialiserade buffertar med längre inkubationstider behövs, eller prover måste genomgå bildförvärv innan en annan fläck appliceras4,5,7,9,10,11. Här visar vi en enkel metod med ett mindre komplicerat förfarande och en vanlig buffert för mikrovågsmedierad antigenhämtning i multiplex immunfluorescerande färgning. Även om denna metod eliminerar de flesta cross-reactivity, användare bör vara medvetna om en eventuell svag falsk samlokalisering sett med vissa antikroppar även efter en 20 min mikrovågsbehandling.
Endogen biotin kan användas som en markör för steroidogena celler i binjurebarken12. Streptavidin-konjugatfluorat fluoroffor är tillräckligt för att upptäcka endogen biotin och lyser upp hela binjurebarken, särskilt i frysta sektioner. Eftersom endogen biotin är vanligtvis blockerad i FFPE prover, är avidin-biotin-peroxidasförfarandet (dvs. ABC kit) fortfarande allmänt används för att förstärka målen i FFPE adrenal prover. Det är viktigt att notera att antigenhämtningssteget också avmaskerar endogen biotin och inducerar dess immunaktivitet13. Eftersom vår metod kombinerar mikrovågsmedierad antigenhämtning och användning av streptavidin-konjugerade HRP, är det möjligt att endogen biotin kommer att leda till falska positiva signaler, särskilt i vävnader rika med endogen biotin (t.ex. lever, njurar och vissa tumörer)13. Om avidin-biotin-peroxidasförfarandet behövs för att förstärka signalen, kan ytterligare ett blockerande steg såsom preinkubation med gratis avidin och gratis biotin bidra till att minska den endogena biotinsignalen14. Medan vår metod ger en låg endogen biotin bakgrund på FFPE mus adrenals, Är det viktigt att alltid inkludera en negativ kontroll med varje prov hela tiden när du använder avidin-biotin-peroxidasförfarande. Den alternativa metoden är att använda en peroxidas-konjugerat sekundär antikropp i stället för den biotinylated sekundära antikroppar.
Våra resultat visar att mikrovågsbehandling med en citratbuffert är en användbar metod för multiplex immunfluorescensfärgning. Det bör dock noteras att inte alla korsaktiviteter kan blockeras helt. En svag falsk samlokalisering är möjlig. Detta protokoll kan användas som ett alternativt tillvägagångssätt när en lämplig kombination av primära antikroppar från olika värdarter inte finns tillgängliga. Användare bör vara medvetna om eventuella falska positiva från den återstående korsreaktivitet samt återvunna endogena biotin. Korrekt negativa kontroller bör alltid inkluderas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH R00 HD032636.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1,000 dilution |
| Microwave oven, 700 W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz | SC-25269 | 1:1,000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
