Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Summary

Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.

Abstract

Patiënt-afgeleide xenografts (PDX), gegenereerd wanneer resected patiënt tumorweefsel rechtstreeks wordt geënt in immuungecompromitteerde muizen, blijven biologisch stabiel, waardoor het behoud van moleculaire, genetische en histologische kenmerken, evenals heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor. Echter, het gebruik van deze modellen om een veelheid van experimenten uit te voeren, met inbegrip van screening op geneesmiddelen, is onbetaalbaar, zowel in termen van kosten en tijd. Driedimensionale (3D) cultuursystemen worden algemeen gezien als platforms waarin kankercellen hun biologische integriteit behouden door middel van biochemische interacties, morfologie en architectuur. Ons team heeft uitgebreide ervaring met het kweken van PDX cellen in vitro met behulp van 3D matrices bestaande uit hyaluronzuur (HA). Om muisfiblast stromalcellen in verband met PDX's te scheiden, gebruiken we rotatiecultuur, waarbij stromale cellen zich hechten aan het oppervlak van weefselkweekbehandelde platen terwijl gescheiden PDX-tumorcellen zweven en zichzelf associëren in meercellige clusters. Ook drijvend in de supernatant zijn enkele, vaak dode cellen, die een uitdaging vormen bij het verzamelen van levensvatbare PDX-clusters voor downstream inkapseling in hydrogels voor 3D-celcultuur. Om deze enkele cellen te scheiden van levende celclusters, hebben we dichtheidsstapgradiëntcentrifugatie gebruikt. Het hier beschreven protocol zorgt voor de uitputting van niet-levensvatbare enkele cellen uit de gezonde populatie van celclusters die zullen worden gebruikt voor verdere in vitro experimenten. In onze studies nemen we de 3D-culturen op in microfluïde platen die mediaperfusie tijdens de cultuur mogelijk maken. Na de beoordeling van de resulterende culturen met behulp van een fluorescerende image-based levensvatbaarheidstest van gezuiverde versus niet-gezuiverde cellen, tonen onze resultaten aan dat deze extra scheidingsstap het aantal niet-levensvatbare cellen uit onze culturen aanzienlijk verminderde.

Introduction

In de afgelopen tien jaar heeft het gebied van kankeronderzoek aangetoond hernieuwde enthousiasme voor patiënt-afgeleide xenografts (PDXs) als een instrument voor de beoordeling van kankercel traject afhankelijkheid en drug gevoeligheid¹. De meest voorkomende PDX-modellen worden vastgesteld door onderhuidse of orthotopische implantatie van menselijke tumorcellen - een tumorfragment, een cluster van gescheiden tumorcellen of een monster van geïsoleerde circulerende tumorcellen (CTC's) -in een knaagdierhost. Als de tumor "nemen" succesvol is, zullen de xenograft cellen zich vermenigvuldigen, vasculariseren en anderszins interageren met het gastheerweefsel om een tumor te creëren, die kan worden geoogst op een optimale grootte, onderverdeeld en opnieuw geïmplanteerd in andere gastheren. Onder hun vele voordelen als modelsysteem behouden PDX's doorgaans een aanzienlijk deel van de heterogeniteit van de inheemse tumorcelpopulatie en maken het de beoordeling van mensspecifieke trajecten en celreacties^{mogelijk 2,3}. De in vivo context maakt tumorinteractie met vasculatuur en andere aangrenzende stroma mogelijk en recapituleert weefselkenmerken zoals drugsdiffusiedynamiek, zuurstofspanning en extracellulaire matrix die de progressie van de tumor biologisch en mechanisch beïnvloeden. Een negatief aspect van PDXs is hun afhankelijkheid van een knaagdier gastheer, zowel voor tumor expansie en uiteindelijk voor hypothese testen. Omdat veel PDX's zich niet kunnen aanpassen aan de traditionele tweedimensionale (2D)-cultuur op weefselkweek polystyreen zonder veel van hun wenselijke kenmerken te verliezen, is er een minimale middenweg voor onderzoekers tussen deze relatief gecontroleerde in vitro-methode en de aanzienlijke toename van de kosten, faciliteiten en tijdsvereisten voor in vivo PDX-gebruik.

We hebben meerdere in vitro modellen beschreven die 3D-celcultuur implementeren binnen een ondersteunende matrix, en onlangs uitgebreid dat werk aan te tonen de ex vivo cultuur van meervoudige prostaatkanker (PCa)-afgeleide PDX's, zowel alleen als in co-cultuur met beenmerg-afgeleide fibroblasten^4,5. Hyaluronzuur (HA)-gebaseerde hydrogelmatrices bieden aanpasbare en biologisch relevante ondersteuning voor beide celtypen, met facile controle over hydrogelkenmerken en optische helderheid voor beeldvorming door de hydrogeldiepte⁶.

Volwassen PDX tumorweefsels bestaan uit een variabel mengsel van heterogene menselijke kankercellen en muisstroma (fibroblasten, endotheelcellen, enz.). Om cel-type specifieke bijdragen aan tumorprogressie in vitro te bestuderen, kan het voordelig zijn om tumoren te scheiden, de celpopulaties te scheiden en experimenteel op een georganiseerde manier op te nemen om trajecten van intercellulaire communicatie te ontleden. De gemengde celpopulaties in weefselvertgates hebben differentiële compatibiliteit met specifieke kweekomstandigheden. Bijvoorbeeld, tumor-geassocieerde fibroblast levensvatbaarheid vereist ofwel oppervlak aanhankelijkheid of 3D matrices gefunctionaliseerd met integrin liganden, terwijl epitheel-afgeleide PDX cellen hebben meestal niet deze eisen, in plaats daarvan ten gunste van celcel interacties. Deze verschillen kunnen worden benut om een effectieve scheiding van PDX-cellen van besmettende muisstromalcellen te bereiken. Rotatiecultuur van weefselvert verteert maakt stromale celtrouw aan het weefselkweekoppervlak mogelijk, terwijl celcelverklevingen PDX-cellen drijven die boven het roterende kweekoppervlak zweven om meercellige clusters in het supernatant te vormen in 24−48 uur. De specifieke kenmerken van deze clusters variëren met de PDX (bijvoorbeeld grote, strakke, zeer bolvormige clusters of kleinere, lossere aggregaten die lijken op trossen druiven), maar zijn meestal van biologisch relevante afmetingen (50−250 μm diameter), voldoende voor het beoordelen van cellulaire interacties die afhankelijk zijn van intercellulaire contacten.

Tumor retrieval en verwerking onvermijdelijk resulteert in een zekere mate van collateral cell dood, hetzij als gevolg van schade op korte termijn van mechanische / enzymatische verstoring, of op lange termijn onverenigbaarheid van subpopulaties met de gekozen cultuur voorwaarden. Ondanks het nut van rotatiecultuur als eerste bulkscheiding, worden dode of stervende cellen onvermijdelijk overgebracht met de PDX clusters en kunnen de resulterende cultuur beïnvloeden. Deze dode cellen zijn vaak individuele PDX cellen die niet werden geïntegreerd in een cluster, muis stromale fibroblasten die niet kunnen overleven in geselecteerde cultuuromstandigheden, of bijzonder fragiele endotheelcellen. Dergelijke stervende cellen kunnen experimentele resultaten van "overlevenden" beïnvloeden en kunnen een aanzienlijke invloed hebben op kwantificering, bijvoorbeeld via fluorescerende op beelden gebaseerde screeningtesten op basis van beeld. Om de selectie van levende PDX-cellen uit deze methode te verbeteren, hebben we centrifugatiemethoden aangepast met dichtheidsstappen om individuele dode/stervende cellen gemakkelijk te verwijderen uit PDX-mengsels en overwegend levende meercellige clusters te behouden.

Om de studie van resulterende PDX-afgeleide clusters in de 3D-cultuur te verbeteren, hebben we gebruik gemaakt van een microfluidics-gebaseerde perfusiecultuurplatform, de OrganoPlate (figuur 1), een hoog-doorvoerorgaan-op-een-chip-platform dat simultane cultuur van maximaal 96 individuele perfusie, 3D-culturen op een 384-wellitert microbordbasis (Figuur 1A)^7,8. In de 2-baans microfluidic plaat wordt een enkele weefselchip verbonden door twee microfluïde kanalen (Figuur 1B, gelkanaal: rood, perfusiekanaal: blauw) die vier putten op een rij omspannen. De twee microfluidic kanalen worden gescheiden door een korte plastic nok genaamd een Phaseguide die overloop van een kanaal in zijn aangrenzende buurman kanaal voorkomt, en tegelijkertijd zorgt voor een membraan-vrije interface tussen de inhoud van de gel en perfusie kanaal⁹. Omdat de bodem van de microfluidic plaat bestaat uit microfluïde glas, kunnen de culturen in het observatievenster via de bodem van de plaat worden bekeken met een standaard of geautomatiseerde microscoop. Perfusie is gevestigd in de microfluïde plaat met een programmeerbare rocker, met behulp van de zwaartekracht om media te rijden door de microfluïde kanalen, tussen reservoirputten (Figuur 1C). De perfusie stroom-nabootst meer samenvatten de tumor micromilieu dan statische cultuur, waardoor voor de integratie van schuifspanning en verbeterde distributie van gassen en voedingsstoffen. De voordelen van het behoud van een geperfundeerde kankercelcultuur in de microfluïde plaat zijn eerder beschreven als geperfundeerde borstkankerculturen die een optimale levensvatbaarheid vertoonden in vergelijking met een statische 3D-cultuur van dezelfde cellen⁷.

Het onderhavige rapport beschrijft een aangepaste dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode voor het isoleren van levende meercellige PDX-clusters en toont zijn nut bij het vestigen van 3D PDX-culturen binnen perfusable microfluïde platen. Omdat een toenemend aantal onderzoekslaboratoria methoden zoekt om het gebruik van PDX te vergemakkelijken, verwachten we dat de hier gepresenteerde protocollen van onmiddellijke nut zullen zijn.

Protocol

Tumorweefsel werd verkregen met toestemming van de patiënt en volgens een goedgekeurd Institutional Review Board (IRB) protocol. Xenografts werden geïmplanteerd, geteeld en geoogst volgens een geaccepteerd Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocol.

OPMERKING: Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een steriele biologische veiligheidskast om de steriliteit te behouden. Alle stappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders bepaald.

1. Bereiding van materialen voor PDX-verwerking

1. Autoclave tang en scalpel handvat of scheermesjes.
2. Dooi dissociatie enzym oplossing bij 4 °C 's nachts of bij kamertemperatuur op dezelfde dag als weefsel dissociatie.
   OPMERKING: Ontdooien bij 37 °C wordt afgeraden, omdat dit sommige dissociatieenzymen kan inactiveren.
3. Bereid ten minste 100 mL PDX-kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium-nutriëntenmengsel F-12 [DMEM-F12] met 100 U/mL penicilline en streptomycin en 30% foetaal runderserum [FBS]), en ten minste 25 mL PDX-verwerkingsmedium (DMEM-F12 met 100 U/mL penicilline en streptomycine en geen FBS). Bewaar op 4 °C tot het gebruiksklaar is.

2. PDX-dissociatie en initiële zuivering van stromale component

1. Verzamel autoclaved gebruiksvoorwerpen, 70 μm cel strainers (2−3), 60 mm ronde weefselkweekschotels (2), 6-well weefselkweekplaten, steriele 50 mL conische centrifugebuizen en steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Warme cultuurmedium tot 37 °C en laat dissociatie enzym oplossing te komen tot kamertemperatuur.
2. Wanneer PDX-weefsel een diameter van 1,0−1,5 cm in een muishost heeft bereikt, verwijder de tumor chirurgisch uit de muis met standaardmiddelen (bijvoorbeeld onder geaccepteerde anesthesie) en bewaar op ijs in een buis van 50 mL met PDX-kweekmedium (Figuur 2A). Verwerk het weefsel onmiddellijk, via de onderstaande stappen, om de levensvatbaarheid van de cel te maximaliseren, bij voorkeur binnen 1−2 uur na de oogst.
3. Breng tumorweefsel over naar een voorgewogen steriele 50 mL conische buis. Spoel 6x met 30 mL steriele PBS om bloed en verontreinigingen te verwijderen. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof en weeg het tumorweefsel.
4. Breng tumorweefsel naar een 60 mm ronde weefselkweekschaal en gehakt in ~1 mm^3-stukken met behulp van een steriel scheermesje of scalpel.
5. Voeg 5 mL PDX-verwerkingsmedium toe om tumordrijfmest te verzamelen en over te brengen naar een nieuwe steriele buis van 50 mL. Spoel de kweekschotel met nog eens 5 mL PDX-verwerkingsmedium, vervolgens met dissociatieenzymoplossing (10 mL/g tumor, ten minste 5 mL), waarbij alle spoelingen aan de 50 mL-buis worden toegevoegd.
6. Incubeer 20 min bij 37 °C met zacht schudden. Draai de buis zachtjes halverwege de incubatietijd.
7. Pipet zachtjes op en neer met een serologische pipet om klonten te breken. Filtercellen met een 70 μm celzeef geplaatst over een nieuwe steriele 50 mL buis.
   LET OP: Er kan meer dan één zeef nodig zijn.
8. Centrifuge op 200 x g gedurende 5 min tot pelletcellen. Verwijder supernatant en resuspend in 2−3 mL van PDX cultuurmedium. Tel cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.
9. Gebruik tabel 1 om het vereiste aantal gescheiden PDX-afgeleide cellen te schatten dat nodig is om de gewenste celdichtheid per chip te bereiken.
   OPMERKING: De waarden in tabel 1 zijn bedoeld als uitgangspunt. Werkelijke waarden zullen variëren als gevolg van weefsel levensvatbaarheid / cellulaire en celverlies van bevriezing / herstel. PDX tumoren zijn individuen, zelfs binnen een bepaald type kanker, zodat deze waarden empirisch moeten worden aangepast.
10. Van het getal berekend in stap 2.9, plaat 1−2 x 10⁶ cellen in 5 mL van PDX cultuurmedium per put van een 6-well weefsel kweekplaat. Incubatie (37 °C, 5% CO₂, 95% luchtvochtigheid) voor 48 uur met zacht schudden (50−55 tpm) om clustervorming te bevorderen (figuur 2B). Nadat cluster is gevormd, gaat u verder naar sectie 3 voor centrifugatie.
11. Cryopreserve ongebruikte PDX cellen van de initiële dissociatie in 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimethylsulfoxide (DMSO) of een commercieel verkrijgbaar primair celbevrief medium.
    OPMERKING: Aanhangende muis stromal cellen kunnen ook worden hersteld van het weefsel plaat oppervlak, indien gewenst, door spoelen kort met cultuur medium en uit te breiden met standaard middelen.
12. Voor later gebruik van cryopreserved PDX tumorcellen/muis stroma, dooicellen in een 37 °C waterbad gedurende 2 min. Tel en plaat in een 6-well weefselkweekplaat zoals beschreven in stap 2.10 voordat u doorgaat naar sectie 3. Verhoog het aantal PDX-cellen met ~ 20% om levensvatbaarheid verliezen van cryopreservatie tegemoet te komen.

3. Dichtheidsgradiëntcentrifugatiegebaseerde scheiding van PDX-afgeleide clusters uit afzonderlijke cellen

1. Bereid 20 mL van 100% dichtheidgradiëntoplossing voor door 18 mL dichtheidsgradiëntecentrifugatieoplossing grondig te mengen met 2 mL steriele 10x Hanks' uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in een steriele conische buis van 50 mL. Maak 10 mL elk van 20%, 30%, 40% en 55% dichtheidgradiëntoplossingen door deze 100% oplossing te verdunnen met steriele 1x HBSS en goed te mengen.
   OPMERKING: Deze volumes zijn voldoende voor twee 15 mL gradiënten die kunnen worden gebruikt om ~15 x 10⁶ cellen per stuk te scheiden. Als het scheiden van minder dan ~ 15 x 10⁶ cellen, moet het tweede verloop worden gebruikt als een evenwicht voor centrifugatie.
2. Voeg 3 mL van 55% dichtheidgradiëntoplossing toe aan de onderkant van een conische buis van 15 mL. Houd de buis onder een hoek, zeer voorzichtig laag 3 mL van 40% dichtheid gradiënt oplossing op de top van de 55% laag, langzaam af te geven van de vloeistof op de schuine kant van de buis om te voorkomen dat het mengen van de lagen. Herhaal dit met de 30% dichtheidgradiëntoplossing.
3. Verzamel de supernatant van PDX rotatieculturen met een 5 mL serologische pipet, spoelplaat oppervlak voorzichtig. Centrifuge op 200 x g gedurende 2 min tot pelletcellen.
4. Verwijder supernatant en resuspend de celpellet in 3 mL van 20% dichtheidgradiënt oplossing op basis van het aantal gradiënten die nodig zijn om de cellen te scheiden. Voorzichtig laag 20% dichtheid gradiënt oplossing met cellen op de bovenkant van het verloop(en). Als u slechts één verloopbuis voor cellen gebruikt, staat u bovenaan de balansgradiëntbuis met een 20% dichtheidsgradiëntoplossing van 20%.
5. Dop de buizen en centrifuge in een zwenk emmer rotor centrifuge voor 30 min bij 4 °C, 2.000 x g, en 0 rem.
6. Na centrifugatie zullen breuken zichtbaar zijn (figuur 2C). Verzamel 2−3 mL fracties in verse buizen van 15 mL. Voeg 3−4 volumes steriele 1x HBSS toe aan elke fractie en om te keren om grondig te mengen.
7. Centrifuge op 1.000 x g gedurende 3 min tot pelletcellen. Verwijder supernatant en resuspend de celpellet in 1−2 mL van PDX verwerkingsmedium.
   OPMERKING: Levensvatbare PDX-celclusters worden meestal gevonden op de 40-55% dichtheidsgradiëntoplossingsinterface (Figuur 2D) met enkele dode/stervende cellen die zich ophopen op de 20−40% dichtheidsgradiëntoplossingsinterface voor de meeste geteste PDX's.
8. Verwijder een klein, representatief aliquot (50−100 μL) voor re-dissociatie met een gelijk volume van dissociatieenzymoplossing om celnummer in de geclusterde celsuspensie te beoordelen. Tel cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.

4. Hydrogelbereiding en microfluïde plaatverzaaiing

1. Reconstitute HA hydrogel oplossingen (thiol-modified HA, HA-SH; thiol-reactive polyethyleen glycol diacrylaat, PEGDA) volgens de instructies van de fabrikant.
2. Voeg met behulp van een multichannel pipet 50 μL HBSS toe aan alle putten in de kolommen van het observatievenster (kolom 3, 7, 11, 15, 19, 23) van een 2-baans microfluïde plaat om de vochtigheid van de cultuur en optimale beeldomstandigheden te behouden.
3. Bereken het volume van de celsuspensie van sectie 3 die nodig is voor 50 μL hydrogel bij de gewenste celdichtheid (d.w.z. 5.000 cellen/μL). Voor het zaaien van een microfluïde plaat, aliquot het berekende volume in elk van 4 steriele 1,5 mL centrifuge buizen.
   LET OP: HA hydrogels hebben een vaste tijd tot gelatie. Pas het volume van de geloplossing aliquots voor de efficiëntie van de gebruiker bij het afgeven als voortijdige gelatie optreedt.
4. Pas de pH van de HA-SH-oplossing direct voor gebruik aan op 8.0 met 1 N NaOH. Voer een testgelatie uit door 40 μL HA-SH te mengen met 10 μL PEGDA en gelatie na verloop van tijd te monitoren. Gelation begint meestal 5−8 min na het mengen van HA-SH met de PEGDA crosslinker.
5. Centrifuge cel suspensie aliquots gedurende 2 min (200 x g, kamertemperatuur) tot pelletcellen. Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend cellen in het juiste volume van HA-SH.
   OPMERKING: De uiteindelijke hydrogel is een 4:1 HA-SH:PEGDA-oplossing (in volume) zodat cellen opnieuw moeten worden opgetrokken in 40 μL HA-SH voor een eindvolume van 50 μL.
6. Voeg 10 μL PEGDA toe aan één aliquot van cellen in HA. Meng goed en wacht 1−3 min (afhankelijk van de gelatietijd vanaf stap 4.4) voordat u de microfluïde plaat zaait.
   OPMERKING: Het toestaan van de gelatiereactie van start voor het zaaien helpt om de celbezinking te minimaliseren.
7. Breng een tip aan voor het afgeven van 1,5 μL-volumes op een herhaalpipet met één kanaal en laad met cellen in HA hydrogel-oplossing. Vergeet niet om de hydrogel aliquot goed gemengd te houden om een gelijkmatige celverdeling te garanderen.
8. Om de microfluidic plaat te zaaien, lijnt upijppunt loodrecht op de plaat terwijl u voorzichtig de punt in het midden van de gelinlaat plaatst (kolommen 1, 5, 9, 13, 17, 21) om contact te garanderen, maar geen druk bij het afgeven van de hydrogel-oplossing. Werken snel om voortijdige hydrogel stolling te voorkomen, afzien van 1,5 μL gel oplossing in elke gel inham.
9. Observeer de vulstatus van de microfluïde kanalen door vanaf de bovenkant van de plaat, de onderkant van de plaat of per microscoop te bekijken en beoordeel de belasting, met behulp van figuur 3 als leidraad (succesvol laden in figuur 3A, pipetpositioneringsbegeleiding in figuur 3B, gemist in figuur 3C, niet gevuld om te eindigen in figuur 3D, overloop in figuur 3E). Identificeer de noodzakelijke aanpassingen in de techniek die het vulsucces voor de volgende ronde chips kunnen verbeteren (zie discussie voor tips voor het oplossen van problemen).
10. Herhaal stap 4.6−4.9 met de overige 3 aliquots cellen in HA-oplossing. Omkeren van de plaat tijdens de voorbereiding van de volgende aliquot (~ 1 min).
    OPMERKING: De wachttijd van 1 min en de inversie van de plaat verbeteren de 3D-verdeling van de cellen door de celbezinking te verminderen naarmate gelatie optreedt.
11. Nadat alle chips zijn gevuld, ontcunificeren de plaat bij 37 °C in een bevochtigde couveuse tot gelatie is voltooid (~ 45 min).
12. Zorg er met behulp van de meegeleverde handleiding voor dat de perfusierotator in de celkweek incubator wordt geïnstalleerd met de juiste perfusie-instellingen (14° hoek, intervallen van 4 min).
13. Voeg 50 μL PDX-kweekmedium toe aan alle medium inhammen (kolommen 2, 6, 10, 14, 18, 22) en controleer of de kanalen goed gevuld worden door de plaat om te draaien. Tik de plaat voorzichtig tegen een oppervlak om de vloeistof aan te moedigen om de microfluïde kanalen te vullen.
14. Voeg 50 μL DMEM-F12 (10% FBS) toe voor alle middelgrote verkooppunten (kolom 4, 8, 12, 16, 20, 24). Als er luchtbellen in het perfusiekanaal zitten, verwijder dan door de plaat voorzichtig tegen een oppervlak te tikken.
15. Met behulp van een microscoop en plaat lay-out vorm (Aanvullende figuur 1), record chip vullen succes. Sluit verkeerd gevulde chips uit voor verder experimenteel gebruik.
16. Plaats de plaat op een kantelende tuimelschakelaar die op een 14° kanteling en een 4 min cyclus wordt geplaatst om perfusie te beginnen. Vervang PDX-kweekmedium om de 2 dagen (eerst 50 μL in de inlaat, dan 50 μL in uitlaat).

5. Celvlekken, beeldvorming en beeldkwantificering

1. Bereid een cel levensvatbaarheid test oplossing met drie fluorescerende kleurstoffen (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
   1. Bereid voorraadoplossingen van elke kleurstof als volgt voor: Hoechst 33342 bij 1,6 mM (1 mg/mL) in gedeïmiseerd water; calcein AM op 4 mM in watervrije DMSO; ethidium homodimer-1 bij 2 mM in DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      LET OP: De stock calcein AM en ethidium homodimer-1 oplossingen zijn opgenomen in de nota kit in Table of Materials.
   2. Bereid een enkele werkoplossing voor in HBSS of fenol roodvrij medium, met alle drie de kleurstoffen. Optimaliseer de uiteindelijke werkconcentratie voor elk celtype en -matrix, binnen het bereik van 1,6−8,0 μM voor Hoechst 33342, 0,1−10 μM voor calceine AM en 0,1−10 μM voor ethidium homodimer-1.
2. Verwijder kweekmedium en breng de werkbare heidskleurstofoplossing aan op gewenste microfluïde chips (75 μL in inlaat, 25 μL in uitlaat) en plaats 1 uur lang terug op de perfusierocker in de celkweek incubator.
3. Afbeelding van de observatievensters van de gekleurde culturen met behulp van een handmatige of geautomatiseerde confocale microscoop(Tabel van materialen) met fluorescerende filters (vermeld als excitatie / emissie golflengten, in nm) alle kernen (Hoechst 33342, 350/461), dode celkernen (ethidium homodimer-1, 528/617) en levend celcytoplasma (calcein AM, 494/517) waar te nemen.
4. Leg 140 μm Z-stacks vast met een stapgrootte van ≤1 μm met behulp van een 20x luchtdoelstelling. Er zijn drie gezichtsvelden nodig om het hele microkanaal met een kleine overlapafbeelding te maken. Om dubbele bemonstering te voorkomen, afbeelding slechts twee velden van de weergave per chip.
   OPMERKING: Beeldvormingscondities moeten worden geoptimaliseerd om een goede NyQuist-bemonstering te garanderen. In de ervaring van auteurs is een snel beeldvormingssysteem, gebaseerd op deconvolutie van een conventionele epifluorescentiebron of resonantiescanmodus op een confocale, noodzakelijk om een complete Z-stack, met drie laserkleuren, binnen een redelijke hoeveelheid tijd volledig te testen op een plaat (ongeveer 3,5 uur met geautomatiseerde beeldvorming, inclusief setup).
5. Met behulp van software voor beeldanalyse u de Z-stack-afbeeldingen testen op de gewenste gekwantificeerde gegevens, zoals morfologie, aggregatiestatus of andere functies. Als u de levensvatbaarheid van cellen wilt kwantificeren, telt u het aantal dode cellen (rood) en de totale celkernen (blauw).

Representative Results

Een programmeerbare perfusie rocker werd bereid in een standaard water-jacked cel cultuur incubator, en twee-lane microfluïde platen werden bereid in een standaard biosafety kast voor het laden (Figuur 1). Een MDA-PCA-118b PDX tumor werd uitgebreid in vivo, geoogst wanneer het een maximale grootte had bereikt, en gescheiden zoals beschreven in protocol sectie 2 om een drijfmest suspensie van cellen te creëren, op ongeveer een eencellige toestand (Figuur 2A). De drijfmest werd afgegeven in 6-well weefsel kweekplaten, en geplaatst op een XY rotator zoals beschreven, voor 48 uur. Muis stroma bevestigd aan de onderkant van de weefselkweekplaat, zoals eerder is beschreven, en de menselijke PDX-cellen bleven drijvend in het medium, geassembleerd in clusters (Figuur 2B). Ongemonteerde enkele cellen waren zichtbaar in de hele oplossing ook.

Een stapdichtheidsgradiënt werd vastgesteld in een centrifugebuis met behulp van de methoden in protocolsectie 3. De supernatant suspensie van PDX cellen werd voorzichtig aangezogen vanaf de multiwell plaat, geladen op de stap gradiënt, en centrifuged zoals beschreven. Na centrifugatie was een wazige band, met de PDX-clusters, zichtbaar in de buurt van de interface tussen fracties 2 en 3, en werden enkele cellen geïdentificeerd op de interface tussen fracties 1 en 2(figuur 2D). Breuken werden verzameld zoals beschreven, verder verdund in HBSS, en opnieuw centrifugeerd om de dichtheidgradiënt oplossing te verwijderen. De supernatant werd aangezogen, en de resulterende cel pellets werden opnieuw opsuspended in PDX verwerking medium. Een kleine aliquot van elke verwerkte fractie werd beoordeeld door microscoop, om te bevestigen dat de verwachte fractie PDX-cluster bevatte, en dat de afzonderlijke fractie voornamelijk enkele cellen bevatte.

HA hydrogel oplossingen werden gereconstitueerd zoals beschreven in protocol sectie 4, en PDX clusters werden opnieuw opgemaakt in de hydrogel oplossing. PDX-oplossingen werden in chips op de microfluidic plaat geladen en beoordeeld op een succesvolle belasting (figuur 3). In de meeste gevallen werd >90% van de chips na enige oefening met succes geladen met de techniek en aanpassing van laadvolumes. Na het laden van het gewenste aantal chips, en uitbroeden voor gelatie zoals beschreven, PDX cultuur medium werd toegevoegd aan de microfluïde plaat, en de plaat werd gekweekt met perfusie.

Met behulp van fluorescerende kleurstoffen en de methoden in protocol sectie 5, en confocale microscopie, 3D microfluïde PDX cultuur levensvatbaarheid en morfologie werden geëvalueerd in zowel ongescheiden en dichtheid gradiënt centrifugatie gescheiden voorwaarden (Figuur 4A). Beelden van deze platen werden opgenomen als Z-stacks op de confocale microscoop en beoordeeld op cel levensvatbaarheid in beeldanalyse software. Op dag 1, die culturen die de scheidingsmethode ondergingen tentoongesteld 10-voudige minder enkele, dode cellen (rood), in vergelijking met ongescheiden culturen (Figuur 4B). Belangrijk is dat de gescheiden clusters voornamelijk bestonden uit levende cellen (groen). Er werd geen statistisch significant verschil vastgesteld voor de clustergrootteverdeling(figuur 4C).

Culturen werden verder gehandhaafd in de microfluïde plaat gedurende zeven dagen (Figuur 5A). De monsters werden periodiek beoordeeld met dezelfde beeldvormings- en kwantificeringsmethoden als hierboven. Het totale aantal levende cellen bleef consistent (figuur 5B) en clusters behield ~ 80% levensvatbaarheid (Figuur 5C) over het leven van de cultuur. De celdichtheid in de ongescheiden toestand is ongeveer een derde van de gescheiden aandoening omdat enkele cellen in leven zijn tijdens het tellen van cellen, maar snel sterven binnen de hydrogel. Er is ook meer variabiliteit in clustergrootte zonder de dichtheidsgradiëntscheiding.

Figuur 1: De 2-baans perfusable microfluïde plaat. (A) De 2-baans microfluïde plaat is een standaard 384-well microtiterplaat met een gewijzigde bodem bestaande uit microfluïde kanalen ingebed tussen glasplaten. Elke plaat bestaat uit 96 tissue chips voor 3D celcultuur. (B) Zoals vanaf de bovenkant van de plaat wordt bekeken, bestaat één tweebaans microfluïde chip uit 4 putten op een rij die zijn verbonden door het gelkanaal (rood) en perfusiekanaal (blauw); de gelinlaat, perfusie-inlaat, observatieraam en perfusieuitlaat. (C) Perfusie wordt bereikt in de microfluïde plaat met een programmeerbare tuimelschakelaar die zwaartekracht gebruikt om media te drijven tussen perfusie-inlaat- en uitlaatputten die mediareservoirs zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: PDX-clusterisolatie. (A) Ontleden primaire PDX weefsel en dissociate in een enkele cel suspensie met zowel menselijke PCa cellen en muis tumor stroma. Ofwel cryopreserve gescheiden celmengsel of (B) toe te voegen aan rotatie cultuur om tumorcellen recluster en laat muis stromale cellen te houden aan het weefsel cultuur plaat (48 h). (C) Gebruik dichtheidsgradiëntcentrifugatie om resterende dode enkele cellen te verwijderen en (D)levensvatbare PDX-clusters te verzamelen op de interface tussen dichtheidsgradiëntlagen 40% en 55% (rood gestreept vak). (E) Herstel PDX-clusters, resuspend in hydrogel precursoroplossing en doseer op de plaat met een herhalende pipet. (F) Voorbeeldberekeningen, overeenkomend met tabel 1,tonen de nodige initiële celnummers aan die nodig zijn om een uiteindelijke gewenste celconcentratie voor alle chips over een plaat te bereiken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Monitoring van het laden van microfluïde platen. Het laden van succes en fouten, kan worden beoordeeld door het oog (in boven-en onderkant uitzicht), met bevestiging door microscoop. (A) Succesvol laden wordt geïdentificeerd door een open (heldere) perfusiebaan in het boven- en onderzicht en een iets donkerdere gelbaan in het onderste zicht. Visualisatie door microscoop bevestigt dat de gel lane volledig was gevuld met cellen en gel precursor, zonder morsen over in de aangrenzende rijstrook. (B) Cartoon waaruit blijkt juiste pipet tip plaatsing tijdens gel afgifte, met de juiste plaatsing net boven de inlaatpoort (links) en onjuiste plaatsing wordt off-centered (midden) of het toepassen van kracht op de inlaatpoort (rechts). (C) Heldere rijstroken in alle weergaven geven een gemiste lading, wat suggereert dat de pipet tip niet correct was geplaatst in de gel inham. (D) Een gedeeltelijke vulling van de gelbaan (niet tot het einde gevuld) wordt geïdentificeerd door de rode pijl, die aangeeft waar de oprukkende gel oplossing voorzijde werd onderbroken, hetzij door een gevangen luchtbel, of een voortijdige pauze in het laden. De rode pijl in de microscoopweergave identificeert dezelfde locatie. (E) De inhoud van de gel lane overstroomde de PhaseGuide, morsen in de perfusie rijstrook en uiteindelijk blokkeren. Deze overloop is zichtbaar in het onderste zicht door de donkere verschijning van zowel gel en perfusie rijstroken. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Celvlekken en beoordeling van de levensvatbaarheid in de microfluïde plaat. (A) Met behulp van fluorescerende vlekken werd de levensvatbaarheid beoordeeld in ongescheiden en gescheiden PCa-celclusters die in de microfluïde plaat zijn gezaaid (alle kernen: Hoechst 33342, blauw; dode cellen: ethidium homodimer-1, rood; en levende cellen: calcein AM, groen). Schaalbalk = 50 μm. (B) Totale dode cellen werden gekwantificeerd op dag 1 van de cultuur en gescheiden MDA-PCa-118b PDX culturen toonden een significante afname van het aantal dode cellen. (C) De kwantificering van de clustergrootte voor PCa-PDX's in gescheiden en ongescheiden culturen vertoonde een lichte stijging, maar geen statistisch significant verschil. Balken en foutbalken in paneel B vertegenwoordigen de gemiddelde en standaarddeviatie van 4 afbeeldingen per voorwaarde (2 chips met 2 image/chip). Sterretje (*) vertegenwoordigt statistisch significante verschillen (p < 0,05) ten opzichte van de ongescheiden toestand met behulp van de t-toets van een student. Voor de doos en snorharen plot in paneel C, het kruis pictogram geeft het gemiddelde, en de horizontale lijn vertegenwoordigt de mediaan, van 4 beelden per voorwaarde (2 chips met 2 beeld / chip). Het vak bevat 50% van de gegevens, terwijl de snorharen zich uitstrekken tot de minimale en maximale clusterdiameter voor elke aandoening. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Karakterisering van gescheiden MDA-PCa-118b in de microfluïde plaat. (A) Gescheiden (links) en ongescheiden (rechts) PCa kankercelclusters werden gezaaid in de microfluïde plaat en geperfundeerd voor maximaal zeven dagen. Culturen werden gekleurd met drie kleurstoffen specifiek voor alle kernen (Hoechst 33342, blauw), dode cellen (ethidium homodimer-1, rood), en levende cellen (calceine AM, groen). Schaalbalk = 50 μm. (B,C) Kwantificering van het aantal cellen en de levensvatbaarheid van de kweek van afbeeldingen gedurende een week met een zaaidichtheid van 8.000 cellen/μL. Balken en foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde en standaardafwijking van vier beelden per aandoening. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Uiteindelijke gewenste celdichtheid in enkele chip (cellen/μL)	Volume geladen per chip (μL)	Aantal chips op microfluïde plaat	Mutiplier voor extra volume	Figuur 2C: Aantal gescheiden cellen dat nodig is voor een volledige microwellplaat (stap 3.8)	Multiplier voor celverliezen (stromaverwijdering, celdood)	Figuur 2B: Beginnummer van gescheiden PDX-cellen voor protocol (stap 2.8)
2,500	1.5	96	1.3	4,7E+05	3	1,4E+06
5,000	1.5	96	1.3	9,4E+05	3	2,8E+06
10,000	1.5	96	1.3	1,9E+06	3	5,7E+06
20,000	1.5	96	1.3	3,7E+06	3	1,1E+07

Tabel 1: Bij benadering eerste en definitieve PDX-materiaal dat nodig is om één 2-baans microfluïde plaat te laden.

Aanvullende figuur 1: De 2-baans microfluïde plaatlay-out. Na het zaaien van de microfluïde plaat, record individuele chip laden succes (succesvol, gemiste laden, niet gevuld tot einde, of overloop) met behulp van de 2-lane plaat lay-out. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Hier beschrijven we een methode voor het verwerken en kweken van levensvatbare PDX-afgeleide tumorcellen in een hoge doorvoer, geperfuseerd 3D-kweeksysteem. Hoewel dit protocol pca PDX-weefsel gebruikt, is het even effectief voor andere epitheliale tumoren. Tumorkenmerken variëren tussen individuele PDX-lijnen, zelfs binnen hetzelfde weefsel van oorsprong (prostaat, borst, enz.). Sommige PCa PDX lijnen zijn meer fibrotische en moeilijk te isoleren levensvatbare cellen uit, terwijl anderen zijn meer cellulaire. De tumor grootte hier opgemerkt kan worden gevarieerd binnen IACUC richtlijnen om meer weefsel voor bijzonder lage opbrengst tumoren. Bovendien kunnen tumorfragmenten worden verzameld na stap 2.7, opnieuw verteerd en samengevoegd met de eerste spijsvertering om de opbrengst te verhogen. Dit is vooral handig voor meer extracellulaire matrix-zware tumoren. Extra rondes van de spijsvertering voorbij twee meestal resulteren in een lage levensvatbaarheid en lage opbrengst en worden niet aanbevolen.

De zuivering van PDX-afgeleide populaties, om dode/stervende cellen te verwijderen of gastheercellen te besmetten, is gunstig voor de uitgebreide 3D-cultuur en kwantificering van de gewenste kankercellen. De eerste stap van de hier beschreven zuivering -suspensie cultuur in een relatief groot volume van de media, samen met XY rotatie bij matige snelheden-bevordert 1) de selectieve extractie van zeer hechting-afhankelijke cellen, meestal muis stromal fibroblasten, en 2) de vorming van cel aggregaten te leveren pro-survival cel-cel contact. De efficiëntie van het extraheren van gastheer-afgeleide muis fibroblasten tijdens de 48 h XY rotatie stap is zeer hoog, zoals beschreven in Fong et al.⁵. Opzettelijke PCa-fibroblast co-culturen zijn zeker haalbaar, zoals we hebben aangetoond, maar vereisen een afgestemde matrix (ter ondersteuning van fibroblast adhesie aan matrix) en een groter deel van fibroblasten. De occasionele PDX, meestal die met meer mesenchymale kenmerken, zal zich gemakkelijker hechten aan weefsel cultuur oppervlakken tijdens de 48-uurs rotatie cultuur stap. PDX-lijnen moeten nauwlettend worden gevolgd wanneer dit protocol voor het eerst wordt uitgevoerd en immunostained voor HNA om het aandeel menselijke cellen in de aanhangende en niet-aanhangende populaties te identificeren. Niet-weefselkweek behandelde platen moeten worden gebruikt voor clustervorming met deze PDXs. Muis stromale cellen zullen uiteindelijk nog steeds aan het oppervlak hechten, maar scheiding zal niet zo efficiënt zijn.

Na rotatiecultuur wordt het supernatant dat de niet-aanhangende populatie bevat, verwerkt via de beschreven dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode. Het hier gerapporteerde protocol kan worden vereenvoudigd om ten minste één dichtheidsstap uit te sluiten (bijvoorbeeld met alleen de oplossingen van 20%, 40% en 55%), maar alle vier moeten worden gebruikt bij het vaststellen van deze methode bij elke nieuwe PDX. Meercellige clusters zijn gemakkelijk gescheiden van individuele cellen door deze methode, en grotendeels behouden hun geclusterde fenotype en andere kenmerken. De afgedankte eencellige populatie vertegenwoordigt ofwel (a) cellen die dood /sterven voorafgaand aan de 48 uur rotatie stap, en dus nooit geïntegreerd in een cluster, of (b) cellen die in leven bleven na de 48 uur rotatie, maar nog steeds niet integreren in clusters. Het is belangrijk op te merken dat groep (b) cellen kan bevatten die sommige onderzoekers wenselijk vinden; bijvoorbeeld, sommige rapporten hebben beschreven primaire celculturen die vroege stam / voorloper cellen, of resistente cellen, die zweven binnen supernatant als slecht-aanhangende enkele cellen boven een anders aanhangende bevolking¹⁰. Relevant voor kankerstudies, circulerende tumorcellen (CTC's), tumorinitierende cellen (TDC's) of andere soortgelijke metastasebevorderende celtypen kunnen deel uitmaken van deze eencellige populatie. Daarom moeten onderzoekers die ons protocol gebruiken, de afgedankte eencellige populatie zorgvuldig analyseren om ervoor te zorgen dat er geen cellen van belang verloren zijn gegaan. In onze handen, de overgrote meerderheid van deze enkele cellen zijn ofwel een kleine fractie van kankercellen die dood / sterven als gevolg van de eerste weefsel dissociatie protocol, of knaagdier fibroblasten die al verder gaan via anoikis.

Het wordt sterk aanbevolen om de techniek van het zaaien van de microfluïde plaat met minder kostbare cellen te oefenen om succes te garanderen bij het werken met beperkt en waardevol PDX-materiaal. Wees u bewust van de plaatsing van de fooi tijdens het geven van dispensatie, omdat onjuiste techniek waarschijnlijk zal resulteren in 1) overloop als druk wordt uitgeoefend tijdens het laden, of 2) lege of gedeeltelijk gevulde kanalen als de tip niet gecentreerd is over de inlaatpoort. Voortijdige gelatie zal er ook toe leiden dat kanalen niet tot het einde worden gevuld. Als dit gebeurt, verlaag dan de wachttijd tussen toevoeging van de PEGDA-crosslinker en het afgeven van de geloplossing, of werk met kleinere aliquots geloplossing tegelijk. De doseervolumes die in dit protocol worden gebruikt, zijn goed geoptimaliseerd voor succes met HA hydrogels. Het gebruik van meer viskeuze oplossingen zoals Matrigel in dit systeem vereist een toename van het doseervolume tot ~2 μL voor een goede vulling van de microfluïde kanalen. Merk ook op dat de keuze van 50 μL stappen in stap 4.3, de voorbereiding van vier celpellets in dezelfde stap, en de herhaalde resuspensions in stap 4.10 opzettelijk zijn; hoewel ze meer materiaal opleveren dan nodig is, bieden ze ook overdrijving om rekening te houden met verliezen van de herhalende pipet.

Opgemerkt moet worden dat elke PDX waarschijnlijk een unieke morfologie en grootteverdeling heeft binnen dit 3D-cultuurmodel. In zekere zin wordt dit verwacht, vanwege de diversiteit van de ziekte van patiënten, weefselgeschiedenis, matrixparameters en vele andere factoren. Een uitgebreide beoordeling van meerdere prostaatkankerlijnen in Matrigel toonde deze potentiële diversiteit^{aan 11}. Toch kunnen onderzoekers verbaasd zijn om een grote variatie in de bovenstaande parameters te vinden. In een manuscript in voorbereiding presenteren we een brede blik op verschillende PDX's op dit cultuurplatform; de cellen behouden een consistente respons binnen elk PDX-type, maar kunnen aanzienlijk variëren tussen de exemplaren, wat resulteert in clusters die bijvoorbeeld groot zijn met een hoge celdichtheid per cluster, of kleiner, met lossere intercellulaire verbindingen. Het specifieke gedrag van elke PDX moet worden beoordeeld door onderzoekers over meerdere proeven, om een voorspelbare en karakteristieke morfologie te bevestigen. Onderzoekers kunnen verwachten dat specimens het algemene gedrag in deze paper volgen.

Samengevat biedt het gepresenteerde protocol onderzoekers een nieuwe methode voor het gebruik van PDXs ex vivo in een platform dat het mogelijk maakt om de cultuuromstandigheden te verfijnen en relevante 3D-milieusignalen zoals weefselspecifieke extracellulaire matrix (ECM) en perfusiestroom mogelijk te maken, waardoor een langere celoverleving over meerdere dagen of weken mogelijk is. Gedetailleerde karakterisering van deze culturen werd bereikt door de kleuring en morfologische analyses die hier werden aangetoond. Bovendien kunnen, indien nodig, culturen worden voorgelegd aan plaatlezer-gebaseerde tests, immunofluorescente etikettering, of gebruikt voor de voorbereiding van lysates die verdere moleculaire karakterisering mogelijk maken. Hoewel we eerder een aantal elementen van PDX 3D-cultuur binnen hydrogels hebben gepubliceerd, is deze toepassing van multistep zuivering nieuw, gemakkelijk te gebruiken in een standaardlaboratorium en succesvol in het behouden van representatieve culturen met een hoge levensvatbaarheid. Het OrganoPlate-platform, in zijn 2-baans en 3-baans variëteiten, biedt verdere complexiteit door zijn model van weefselperfusie, en een belangrijke kans om nog minder cellen per experiment te gebruiken. In vergelijking met onze vorige modellen, de microfluïde platform verminderde cel eisen met een factor van ~ 30, per experiment, dat is een enorm voordeel, gezien de schaarse beschikbaarheid van PDX tumorweefsel in de meeste laboratoria. Het microfluïde systeem maakt uitgebreide beeldvorming, immunosconificatie en facile imaging mogelijk, over een celpopulatie die groot genoeg is (n = ~ 2.000−4.000 cellen per beeldvormingsvenster) om kwantificering van fenotype binnen de context van ruimtelijke organisatie mogelijk te maken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable