Summary
O objetivo deste protocolo é manipular diretamente os receptores da área tegmental ventral para estudar sua contribuição para a liberação de dopamina subsegundo.
Abstract
A liberação de dopamina phasic (DA) da área tegmental ventral (VTA) para o núcleo accumbens desempenha um papel fundamental no processamento de recompensas e aprendizado de reforço. Entender como as diversas entradas neuronais na liberação da DA de controle VTA podem fornecer uma melhor imagem dos circuitos que controlam o processamento de recompensas e o aprendizado reforçado. Aqui, descrevemos um método que combina infusões de cânulas intra-VTA de agonistas farmacológicos e antagonistas com a liberação de DA fásica evocada por estimulação (infusão e estimulação combinada, ou CIS) medida pela voltametria cíclica in vivo de varredura rápida (FSCV). Usando CIS-FSCV em ratos anestesiados, uma resposta da DA fásica pode ser evocada estimulando eletricamente o VTA com um eletrodo bipolar equipado com uma cânula durante a gravação no núcleo do núcleo accumbens. Agonistas ou antagonistas farmacológicos podem ser infundidos diretamente no local de estimulação para investigar os papéis específicos dos receptores de VTA na liberação da DA fásica. Um grande benefício do CIS-FSCV é que a função receptorA VTA pode ser estudada in vivo, com base em estudos in vitro.
Introduction
A liberação de dopamina phasic (DA) da área tegmental ventral (VTA) para o núcleo accumbens (NAc) desempenha um papel vital em comportamentos relacionados à recompensa. Os neurônios VTA DA mudam de um disparo tônico (3-8 Hz) para um disparo em forma de estouro (>14 Hz)1, que produz a liberação da DA phasic no NAc. O VTA expressa uma variedade de receptores somatodendritic que estão bem posicionados para controlar o interruptor de tônica para estouro2,3,4,5. Identificar quais desses receptores, e seus respectivos insumos, controlarão a liberação da DA phasic aprofundará nossa compreensão de como os circuitos relacionados à recompensa são organizados. O objetivo da metodologia aqui descrita, infusão combinada e estimulação com voltametria cíclica de varredura rápida (CIS-FSCV), é avaliar de forma rápida e robusta a funcionalidade dos receptores VTA na liberação da DA fásica.
O termo infusão e estimulação combinada (CEI) refere-se a receptores farmacologicamente manipuladores em um grupo de neurônios (aqui o VTA) e estimular esses neurônios a estudar a função do receptor. No rato anestesiado, estimulamos eletricamente o VTA para evocar um grande sinal da fásico (1-2 μM) no núcleo NAc, medido pela voltammetry cíclica de varredura rápida (FSCV). Infusões de fármacos farmacológicos (ou seja, agonistas receptores/antagonistas) no local de estimulação podem ser usadas para medir a função dos receptores VTA observando a mudança subsequente na liberação da FAsica evocada. FSCV é uma abordagem eletroquímica que desfruta tanto de alta resolução espacial (50-100 μm) quanto temporal (10 Hz), e é adequada para medir eventos da DA relacionados à recompensa6,7. Esta resolução é mais fina do que outras medidas neuroquímicas in vivo, como a microdiálise. Assim, em conjunto, o CIS-FSCV é adequado para avaliar a regulação do receptor VTA da liberação de dopamina fásica.
Uma maneira comum de investigar a função do receptor de VTA é usando uma combinação de abordagens eletrofisiológicas que abordam como esses receptores alteram a taxa de disparo dos neurônios1,8. Esses estudos são altamente valiosos para entender quais receptores estão envolvidos na condução de disparos da promotoria após a ativação. No entanto, esses estudos só podem sugerir o que pode acontecer a jusante no terminal de axônio (ou seja, liberação de um neurotransmissor). O CIS-FSCV baseia-se nesses estudos eletrofisiológicos, respondendo como a saída de disparo de VTA, liberação de DA fásica, é regulada por receptores localizados em dendritos de VTA e corpos celulares. Assim, o CIS-FSCV é adequado para se basear nesses estudos de eletrofisiologia. Como exemplo, a ativação do receptor nicotínico pode induzir o disparo de explosão no VTA9, e o CIS-FSCV no rato anestesiado foi usado para mostrar que a ativação do receptor de acetilcolina nicotínica (nAChR) no VTA também controla a liberação da Fásica no NAc10,11.
O exame mecanicista da regulação da da afásica também é comumente estudado usando preparações de fatias juntamente com a aplicação de banho de drogas. Esses estudos muitas vezes se concentram na regulação pré-sináptica da liberação da DA afásica dos terminais de dopamina, uma vez que os corpos celulares são frequentemente removidos da fatia12. Essas preparações são valiosas para estudar efeitos de receptores pré-sinápticos nos terminais de dopamina, enquanto o CIS-FSCV é mais adequado para estudar efeitos do receptor somatodendritico em neurônios de dopamina, bem como entradas pré-sinápticas no VTA. Essa distinção é importante, pois a ativação do receptor somatodendritic no VTA pode ter um efeito diferente da ativação do receptor pré-sináptico NAc. De fato, bloquear nAChRs pré-sinápticas dopaminérgicos no NAc pode elevar a liberação de dopamina afásica durante o estouro13, enquanto o oposto é verdadeiro no VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV é uma abordagem ideal para estudar a capacidade dos receptores VTA de regular a liberação da DA fásica. É importante ressaltar que essa abordagem pode ser realizada em um rato intacto, seja anestesiado ou em movimento livre. Esta abordagem é adequada para estudos agudos, para estudar a função receptora em seu estado de base10,14, bem como estudos de longo prazo que possam avaliar alterações funcionais em um receptor após exposição a medicamentos ou manipulação comportamental11,15.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia nacional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (NIH) e aprovados pelo Elizabethtown College e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale (IACUC). Este protocolo é específico para a preparação anestésima de ratos de utilização do CIS-FSCV.
1. Preparações pré-úrgicas
- Preparação da solução de eletrodos
- Para fazer a solução de enchimento de eletrodo, prepare uma solução de acetato de potássio de 4 M com cloreto de potássio de 140 mM16.
- Preparação de eletrodos
- Utilizando sucção a vácuo, insira uma fibra de carbono T-650 (7 μm de diâmetro) em um capilar de vidro borossilicato (comprimento = 100 mm, diâmetro = 1,0 mm, diâmetro interno = 0,5 mm).
- Uma vez que a fibra de carbono tenha sido colocada dentro do capilar de vidro, coloque o capilar de vidro em um puxador de eletrodo vertical, com o elemento de calor aproximadamente no meio do capilar. Coloque o aquecedor em 55 com o ímã desligado.
- Depois que o capilar é puxado, levante cuidadosamente o suporte capilar superior para que a ponta do eletrodo não seja cercada pelo elemento de aquecimento.
- Usando uma tesoura afiada, corte a fibra de carbono que ainda está conectando os dois pedaços do capilar. Isso resultará em duas microeletrodas separadas de fibra de carbono.
- Sob um microscópio leve, corte cuidadosamente a fibra de carbono exposta com um bisturi afiado, de modo que a fibra de carbono se estenda aproximadamente 75-100 μm além da extremidade do vidro.
- Usando um microscópio leve, certifique-se de que o eletrodo esteja livre de rachaduras ao longo do capilar. Certifique-se também de que o selo, onde a fibra de carbono sai do capilar, é difícil de notar e livre de rachaduras.
NOTA: Um bom selo ajudará a reduzir o ruído durante as gravações. Veja os estudos publicados17,18,19 para um protocolo mais detalhado.
- Fabricação de eletrodos de referência
- Soldar um pino de ouro para um fio de prata de 5 cm.
- Conecte o ânodo a um clipe de papel metálico ou outro condutor, o cátodo a um pino, e aplique uma tensão (~2 V) enquanto o clipe de papel e o fio de prata estão submersos em 0,1 M HCL.
- Pare a tensão quando um revestimento branco (AgCl) aparecer no fio de prata.
- Preparação de eletrodo para implantação
- Soldar um pino dourado para um fio isolado fino (~10 cm de comprimento, <0,50 mm de diâmetro).
- Remova ~5 cm de isolamento do fio oposto ao pino dourado.
- Encha o eletrodo aproximadamente na metade com a solução de eletrodo.
- Insira fio isolado no eletrodo.
NOTA: O fio deve fazer contato com a fibra de carbono dentro do eletrodo.
2. Implantações de eletrodos
- Dar aos ratos adultos, machos, Sprague Dawley (250-450 g) uma injeção intraperitoneal (1,5 g/kg ou 1 mL/kg) de 0,5 g/mL de uretano dissolvido em soro fisiológico estéril. Comece com uma dose inicial de uretano de 1,0−1,2 g/kg. Se o animal ainda responder ao teste de estímulo nocivo (pinça traseira) 20 min após a administração da uretano, administre um uretano adicional de 0,3−0,5 g/kg para uma dose total de 1,5 g/kg.
NOTA: Para a preparação da solução de 0,5 g/mL de uretano, adicione 10 g de uretano a 10 g (~10 mL) de soro fisiológico. Ouretano é um cancerígeno e deve ser tratado com cuidado. O uretano é um anestésico importante, pois não altera os níveis de dopamina, assim como outros anestésicos como cetamina/ xilazina e hidrato de cloral20,21. - Uma vez que o animal é profundamente anestesiado e não responde a estímulos nocivos (por exemplo, pinça do dedo do dedo), coloque-o no quadro estereotaxic. Aplique lubrificante oftálmico em cada olho do rato.
NOTA: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência, mas uma boa técnica asséptica é incentivada. - Limpe o couro cabeludo do rato usando um esfoliante de dois estágios (ou seja, um esfoliante de iodopovidona seguido de um esfoliante de 70% de etanol; realize com uma repetição de 3 ciclos).
- Corte o tecido do couro cabeludo usando pinças esterilizadas do nariz da agulha e tesoura cirúrgica. Remova uma quantidade significativa de tecido para abrir espaço para as várias implantações descritas abaixo.
- Limpe suavemente a superfície do crânio usando aplicadores de ponta de algodão esterilizados. Em seguida, aplique 2-3 gotas de 3% de peróxido de hidrogênio para ajudar a identificar a lambda e bregma.
- Utilizando uma furadeira estereotaxica ou manual (1,0 mm, ~20.000 rpm), fure um orifício de 1,5 mm de diâmetro 2,5 mm anterior ao bregma e 3,5 mm lateral ao bregma. Parcialmente (cerca de metade, até que esteja firmemente no lugar) implante um parafuso (1,59 mm de O.D., 3,2 mm de comprimento) neste orifício. Recomenda-se o uso de soro fisiológico estéril para irrigar durante a perfuração para evitar ferimentos térmicos.
- Para o eletrodo de referência, perfurar um orifício de 1,0 mm de diâmetro 1,5 mm anterior e 3,5 mm lateral para o bregma, no hemisfério esquerdo.
- À mão, insira ~2 mm de fio de referência neste orifício, enquanto envolve o fio de referência ao redor e sob a cabeça do parafuso implantado.
- Implante totalmente o parafuso, fixando o eletrodo de referência no lugar.
- No hemisfério direito, perfurar um orifício de 1,5 mm de diâmetro 1,2 mm anterior e 1,4 mm lateral para o bregma.
- Remova suavemente a dura usando pinças.
- Para o eletrodo estimulante, faça um orifício quadrado (2 mm anterior-posterior, 5 mm medial-lateral) centrado em 5,2 mm posterior e 1,0 mm lateral para o bregma.
- Usando as barras de braço estereotáticos, abaixe a cânula estimulante/guia bipolar 5 mm abaixo da dura. Em caso de sangramento durante a implantação do eletrodo, use cotonetes e gaze estéreis para minimizar o sangramento.
NOTA: O eletrodo estimulante bipolar utilizado neste método é pré-adaptado com uma cânula guia(Tabela de Materiais). A cânula interna usada com este item deve ser lavada com as pontas do eletrodo estimulante bipolar quando totalmente inserida na cânula guia. Isso permitirá que a cânula interna fique diretamente entre as duas pontas do estimulador, que ficam a cerca de 1 mm de distância. Um protocolo semelhante é descrito em outro lugar14. - Usando as barras de braço estereotáticos, baixe a fibra de carbono microeletrodes 4 mm abaixo da dura. Este local é na parte mais dorsal do estriado.
- Conecte o fio de referência e a fibra de carbono a um potencialiostat.
- Aplique uma forma de onda triangular (-0,4−1,3 V, 400 V/s) por 15 min a 60 Hz, e novamente por 10 min a 10 Hz.
NOTA: Normalmente, ao aplicar formas de onda a microeletrodos de fibra de carbono no cérebro, grupos de óxido são adicionados à superfície da fibra de carbono. O equilíbrio desta reação deve ser alcançado antes da gravação; caso contrário, ocorrerá uma deriva significativa19. Pedalar o eletrodo em frequências mais altas (60 Hz) permite que a fibra de carbono alcance o equilíbrio mais rapidamente.
3. Otimizando a fibra de carbono e estimulando locais de cânula/guia
- Defina o estimulador para produzir uma forma de onda elétrica bipolar, com uma frequência de 60 Hz, 24 pulsos, corrente de 300 μA e largura de pulso de 2 ms/fase.
- Abaixe suavemente o estimulador em incrementos de 0,2 mm de 5 mm a 7,8 mm abaixo da dura. A cada incremento, estimule o VTA.
NOTA: Em profundidades mais dorsais (5-6 mm), a estimulação do cérebro normalmente (~80% do tempo) faz com que os bigodes do rato se contraiam. Em profundidades posteriores, os bigodes cessarão a contração, o que ocorre entre 7,5 e 8,2 mm abaixo da dura. Quando os bigodes cessarem, o eletrodo estimulante estará próximo ou no VTA. Isso não ocorrerá em todos os ratos, e a falta de contração de whisker não deve ser tomada como um sinal de que a cânula de eletrodo/infusão estimulante bipolar é extraviada. A contração do whisker pode não ocorrer para todos os anestésicos (por exemplo, isoflurane). - Continue a baixar a cânula estimulante bipolar/cânula guia até que uma estimulação produza a liberação da DA fásica na microeletroda de fibra de carbono (atualmente no estriato dorsal).
NOTA: A liberação de DA no estriado dorsal nem sempre ocorrerá se o eletrodo bipolar for implantado no VTA, mas a observação da liberação de DA no estriado dorsal sobre a estimulação do VTA é geralmente um bom sinal de que um bom sinal será observado no núcleo NAc. - Abaixe a microeletrídola de fibra de carbono até que esteja pelo menos 6,0 mm abaixo da dura. Esta é a parte mais dorsal do núcleo NAc.
- Estimule o VTA e regise o pico de amplitude do pico da DA.
- Abaixe ou eleve a microeletríd latroc de fibra de carbono no local que produz a maior liberação da DA.
- Certifique-se de que o pico da resposta da DA é um pico claro de oxidação em 0,6 V e um pico de redução em -0,2 V. Esses picos são indicativos de DA.
4. Infusão de combinação e gravação de FSCV
NOTA: A Figura 1 mostra a linha do tempo para gravação antes e depois da microinfusão VTA.
- Uma vez otimizada a fibra de carbono e a localização da cânula estimulante/ guia, estimule por ~20-30 min.
NOTA: Sob os parâmetros de estimulação atuais, não estimule mais de uma vez a cada 3 minutos, para permitir a recarga vesicular22. - Depois de alcançar uma linha de base estável (variação de <20% sobre cinco estímulos), abaixe suavemente a cânula interna à mão na cânula guia que é pré-adaptada para o estimulador bipolar.
- Faça gravações adicionais de 2-3 para garantir que a inserção da cânula em si não tenha causado uma alteração no sinal evocado. Em alguns casos, a inserção e remoção da cânula interna podem causar danos ao VTA. Se o sinal mudar drasticamente durante este período de linha de base (>20%), então faça mais 3-4 gravações até que a linha de base se reestilizar.
- Utilizando uma bomba de seringa e microsinga, infundir 0,5 μL de solução (por exemplo, 0,9% salino, N-metil-D-aspartato [NMDA], (2R)-amino-5-ácido fosfosorórico [AP5]) no VTA durante um período de 2 min.
- Pós-infusão, deixe a cânula interna por pelo menos 1 minuto antes da remoção.
NOTA: Algumas drogas podem exigir deixar a cânula interna por mais tempo com base na cinética da droga, e a remoção da cânula interna pode fazer com que a droga volte a viajar pela cânula interna. Se houver preocupação, pode-se deixar a cânula interna na cânula guia durante toda a gravação. Caso contrário, a gravação pode começar após este intervalo de 1 minuto. - Continue gravando a cada 3 minutos para medir os efeitos pós-infusão.
NOTA: Se infundir uma solução de controle e nenhum efeito for observado, é possível infundir uma segunda vez10. Se houver uma liberação de DA alterada causada pela inserção da cânula interna ou infusão salina, o sinal normalmente se recupera para a linha de base dentro de 30 minutos.
5. Verificação histológica da colocação de eletrodos
- No final do experimento, crie uma pequena lesão no local de gravação usando a microeletroda de fibra de carbono.
- Se o eletrodo deve ser preservado para calibração pós-experiência, use então um fio de tungstênio colocado em um capilar de vidro salientes ~100 μm além da ponta capilar. Neste caso, levante o eletrodo do cérebro, substitua o eletrodo de gravação pelo eletrodo de tungstênio, e abaixe-o para a mesma coordenada dorsoventral.
NOTA: A fibra de carbono também pode ser usada para lesar o cérebro e fornecerá uma representação mais precisa da localização do local de gravação; no entanto, o experimentador perderá a capacidade de calibrar esses eletrodos.
- Se o eletrodo deve ser preservado para calibração pós-experiência, use então um fio de tungstênio colocado em um capilar de vidro salientes ~100 μm além da ponta capilar. Neste caso, levante o eletrodo do cérebro, substitua o eletrodo de gravação pelo eletrodo de tungstênio, e abaixe-o para a mesma coordenada dorsoventral.
- Para lesionar o local de gravação, aplique tensão usando uma fonte de alimentação. Comece em 1 V e aumente em 1 V a cada 10 s até que 10 V seja alcançado.
- Eutanize o animal usando uma injeção intraperitoneal letal de pentobarbital (150 mg/kg).
- Perfuse o rato usando uma solução de 4% de formalina.
- Remova a cabeça do rato usando uma guilhotina afiada.
- Usando rongeurs, remova o tecido conjuntivo e o crânio ao redor do cérebro, e desaloja suavemente o cérebro de qualquer tecido restante.
- Armazene o cérebro em 4% de formalina por 1 dia e depois transfira para 30% de sacarose.
NOTA: A perfusão com 4% de formalina não é necessária para ver o local da lesão, embora como prática recomendada irá melhorar a reconstrução do local da lesão. - Crie fatias de 30 μm do cérebro usando um criostat.
- Monte as fatias em slides e cubra com um deslizamento de tampa.
- Denote a localização da lesão de microeletrodes de fibra de carbono e localização da cânula de estimulação/infusão bipolar usando um microscópio leve.
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Representative Results
CIS-FSCV foi utilizado para estudar a função de receptores de pós-metila-d-aspartato (NMDAR), receptores de acetilcolina nicotínica (nAChRs) e receptores de acetilcolina muscarínica (mAChRs) na liberação da DA fásica no núcleo NAc. A Figura 2 mostra dados representativos para um controle negativo, infusão de 0,9% salina, antes (linha de base) e 9 min de pós-infusão (soro fisiológico). A Figura 2 mostra um enredo de cor com potencial no eixo y, tempo no eixo x e corrente (representado como cor falsa) no eixo z, traços de corrente versus tempo (IVT), bem como um voltammograma cíclico tomado no pico evocado resposta para demonstrar que o analito medido corresponde ao DA. Como esperado, a infusão salina não alterou a liberação da FAfá estimulada.
Para demonstrar que o CIS-FSCV pode produzir efeitos bidirecionais ao usar agonistas e antagonistas, comparamos os efeitos da infusão do agonista NMDAR, NMDA (500 ng; Figura 3A) ao antagonista NMDAR, AP5 (1 μg; Figura 3B). A infusão de NMDA produziu um aumento robusto na liberação da dafástica estimulada(Figura 3A, 9 minutos após a infusão), enquanto o antagonista competitivo NMDAR, AP5 (1 μg), produziu uma diminuição robusta(Figura 3B, 9 minutos após a infusão). Para demonstrar a utilidade do CIS-FSCV usando antagonistas que visam diferentes classes de receptores de acetilcolina, comparamos os efeitos da infusão do antagonista não seletivo nAChR antagonista mecamylamine (3 μg; Figura 4A) e a scopolamina antagonista mAChR não-seletiva e competitiva (67 μg; Figura 4B). Ambas as drogas produziram reduções robustas na liberação da Fásica Estimulada(Figura 4, 9 min pós-fusão). Um resumo dos resultados da Figura 2, Figura 3e Figura 4 são replotados na Figura 5, onde o período de linha de base é mediado ao longo de cinco estímulos e o período de drogas é exibido como uma porcentagem da média da linha de base.
Figura 1: Cronograma para gravação antes e depois da microinfusão VTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cor representativa e parcelas ivT de infusão de linha de base (esquerda) e salina (veículo) em liberação de DA esférica estimulada no núcleo NAc em um único rato Sprague Dawley masculino. A barra azul representa estimulação. A gravação da linha de base ocorre em t = 0, antes da cânula interna ser colocada na cânula guia no estimulador bipolar. A gravação salina foi feita 9 min (t = 9) pós-fusão. Os insets ciclicos de voltamograma correspondem ao pico das parcelas ivT, mostrando um pico de oxidação em 0,6 V e redução de pico em -0,2 V, indicativo de DA. Nenhuma mudança na liberação evocada estimulada deve ser observada após a infusão de VTA salina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos da infusão do agonista NMDAR (NMDA) e antagonista (AP5). (A) Cor representativa e parcelas ivT de linha de base (esquerda) e 500 ng da infusão agonista NMDAR (direita) na liberação de DA afásica estimulada no núcleo NAc em um único rato sprague dawley masculino. A infusão de NMDA aumentou a liberação de DAfástica estimulada (gravação tomada de 9 min pós-infusão). (B) Cor representativa e parcelas ivt de linha de base (esquerda) e 1 μg do antagonista NMDAR (2R)-amino-5-fosfonovaleric para infusão (AP5) na liberação da DA fásica estimulada no núcleo NAc em um único rato Sprague Dawley masculino. Infusão AP5 reduziu a liberação de DA linfática estimulada (gravação tomada de 9 min pós-infusão). As gravações da linha de base ocorreram em t = 0, antes da cânula interna ser colocada na cânula guia no estimulador bipolar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos da infusão de mecamilamina e escopolamina. (A) Cor representativa e parcelas ivT de linha de base (esquerda) e 3 μg da infusão não-eletrônica do receptor de acetilcolina nicotinática antagonista mecamylamina (MEC) na liberação da DA esférica estimulada no núcleo NAc em um único rato escolado da Rosga Dawley masculino. (B) Cor representativa e parcelas ivT de linha de base (esquerda) e 67 μg da infusão de receptor de acetilcolina muscarína não-esteriva (SCOP) (direita) na liberação da DA esférica estimulada no núcleo NAc em um único rato macho Sprague Dawley. A gravação da linha de base ocorreu em t = 0, antes da cânula interna ser colocada na cânula guia no estimulador bipolar. As gravações do MEC e do SCOP foram feitas 9 minutos após a infusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resumo de dados mostrando efeitos de drogas ao longo do tempo. O período de pré-infusão (linha de base) foi mediado ao longo de cinco estímulos, e o período pós-infusão (a partir de t = 3) é apresentado como uma porcentagem da linha de base. Em 9 min de pós-infusão, observamos que o sinal da da evocado era de 103% da linha de base após a infusão salina, 196% após a infusão de NMDA, 18% após infusão de AP5, 49% após infusão do MEC e 43% após infusão de SCOP. n = 1 por condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O CIS-FSCV oferece uma oportunidade única para investigar os mecanismos receptores VTA subjacentes à liberação da DA fásica. Há duas etapas críticas para garantir uma gravação adequada. Em primeiro lugar, uma gravação de linha de base estável deve ser alcançada, com pouca deriva no sinal de DA evocado. Uma maneira importante de aumentar a probabilidade de estabelecer um registro estável é garantir que o eletrodo tenha tido tempo de sobra para pedalar tanto a 60 Hz quanto a 10 Hz (tipicamente 15 min a 60 Hz, e 10 min a 10 Hz). À medida que a fibra de carbono está sendo cicloviária, a própria fibra de carbono oxida e se torna gravada, diminuindo a área da superfície, mas produzindo nova superfície para adsorção de dopamina23. Isso pode levar a um aumento da sensibilidade ao DA. Assim, pode-se ver um ligeiro aumento na liberação estimulada de dopamina ao longo do tempo no experimento devido a este aumento da gravura, em vez de qualquer manipulação farmacológica. Além disso, iniciar uma gravação dentro de 90 a 120 minutos de anestesia inicial aumentará a probabilidade de um registro estável por longos períodos de tempo. Como tal, como o rato se aproxima da morte por anestesia, é típico que a liberação da Promotoria evocada diminua lentamente.
O segundo passo crítico neste procedimento é garantir que a cânula de infusão seja gentilmente inserida no eletrodo estimulante bipolar. As chaves estereotaxas podem se mover se muita pressão for colocada ao inserir a cânula interna e, como resultado, o sinal de dopamina pode aumentar ou diminuir artificialmente, pois o local de estimulação pode ser diferente. Se houver uma mudança significativa no sinal evocado após a inserção da cânula, um novo período de linha de base deve ser estabelecido. Além disso, se houver uma liberação alterada de DA causada pela inserção da cânula interna ou infusão do veículo, o sinal normalmente se recupera para a linha de base dentro de 30 minutos. Caso haja alterações extensivas na liberação da DA para a infusão do veículo, a taxa de infusão ou o volume podem ser reduzidos. Os investigadores também podem realizar uma gravação adicional depois de inserir a cânula interna antes da infusão para avaliar se a inserção da própria cânula pode alterar a liberação. Relacionalmente, é importante verificar se a infusão ocorreu, e que não há bloqueio da cânula interna. Uma maneira de fazer isso é fazer uma pequena bolha na tubulação de infusão, e marcar isso com uma caneta ou marcador. A bolha deve estar mais longe do marcador após a infusão. Outra maneira de garantir que a infusão ocorreu corretamente é ligar a bomba de infusão depois que a cânula interna foi removida do cérebro, e se ainda houver solução se formando na ponta, então uma infusão bem sucedida provavelmente ocorreu.
O CIS-FSCV pode ser adaptado para estudar receptores de VTA em animais comportamentais e treinados para estudar mudanças na função receptora ao longo do tempo11. O CIS-FSCV também pode ser modificado para medir 5-HT e norepinefrina (NE)24,25. O CIS-FSCV também é altamente adequado para experimentos de comportamento acordados e pode ser integrado com abordagens optogenéticas26,27. É importante notar que os eventos de liberação eletricamente evocados são distintos dos eventos de liberação transitórios frequentemente observados em estudos em movimento livre, e menos frequentemente na preparação anestesiada. Eventos de liberação transitório, por exemplo, podem não ser necessariamente impulsionados pela despolarização direta de neurônios de dopamina ao contrário dos eventos de liberação eletricamente evocados28. Como tal, a atividade neural fásica pode ser dissociável a partir dos eventos de liberação de dopamina detectados via FSCV. Além disso, a versão da DA evocada opticamente mostrou-se diferente dos eventos de liberação do DA eletricamente evocados. Uma comparação recente entre estimulação opticamente e eletricamente evocada revelou que a estimulação eletricamente evocada produz regulação multissináptica da liberação da FAfá, enquanto a estimulação opticamente evocada pode limitar a estimulação a circuitos mais específicos29.
Algumas abordagens recentes têm utilizado métodos optogenéticos e fluorescentes para investigar os circuitos subjacentes à dinâmica rápida da dopamina in vivo30. Por exemplo, trabalhos recentes de Sun e colegas mostraram que a estimulação optogenética de neurônios de dopamina na substantia nigra produz elevações rápidas de DA no estriado, medida através da expressão de sensores da DA (GRABDA)baseados em receptores de proteína G30. Abordagens optogenéticas e fluorescência combinadas poderiam ser usadas para estimular ou inibir insumos específicos diferentes ao VTA enquanto mediam a liberação de DA no NAc. O CIS-FSCV não pode estimular os afferents tão especificamente quanto a estimulação optogenética, mas tem uma vantagem em que pode abordar questões sobre receptores pré-sinápticos e pós-sinápticos dentro do VTA. Embora ambas as abordagens fluorescentes e FSCV tenham resolução temporal suficiente (subsegundo) e sensibilidade ao DA (1-10 nM) para medir comparativamente as alterações na liberação da DAphasic 30,31, uma vantagem que o FSCV pode ter sobre o monitoramento fluorescente do DA phasic in vivo é que não são necessárias manipulações genéticas para registro. De fato, um experimento CIS-FSCV pode ser concluído em poucas horas, enquanto abordagens optogenéticas e fluorescência combinadas requerem tempo suficiente (semanas) para expressão suficiente usando construções virais.
Um benefício fundamental do CIS-FSCV é que a regulação específica do receptor VTA da liberação da Fásica da DA pode ser estudada no cérebro intacto, a partir de outros estudos in vivo que medem as propriedades eletrofísicas dos neurônios VTA ou estudos in vitro que avaliam a regulação pré-sináptica da liberação da DA3,12. Uma ressalva do CIS-FSCV é que essas gravações devem ser feitas em uma área relativamente rica em DA. Isto é por duas razões: Primeiro, existem alguns limites para a sensibilidade do FSCV, que só podem detectar concentrações de DA na faixa de nanomolar e acimade 6,19. Em segundo lugar, o FSCV tem problemas para dissociar a norepinefrina da DA, porque seus voltammogramas cíclicos são quase idênticos. Assim, esses estudos podem limitar-se à avaliação de áreas com alto DA, como algumas partes do córtex pré-frontal medial, NAc, estriatum e o tubérculo olfativo32. Estudos futuros podem ser capazes de empregar algumas das abordagens de FSCV que permitem uma melhor discriminação entre DA e NE, bem como outros neurotransmissores eletroativos como a adenosina33 e serotonina12.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado pela Elizabethtown College (R.J.W, M.L., e L.M.), por uma Bolsa de Pós-Graduação da NSF (R.J.W.) e pela Yale School of Medicine (N.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
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