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Neuroscience

Modelagem 3D de Espinhos Dendríticas com Plasticidade Sináptica

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/60896
Automatic Translation
*1, *1
1Center for Mathematics, Computation and Cognition, Federal University of ABC
* These authors contributed equally

Summary

O protocolo desenvolve um modelo tridimensional (3D) de um segmento dendrático com espinhos dendráticos para modelagem da plasticidade sináptica. A malha construída pode ser usada para modelagem computacional do tráfico de receptores AMPA na plasticidade sináptica de longo prazo usando o programa de software Blender com CellBlender e MCell.

Abstract

A modelagem computacional da difusão e reação de espécies químicas em uma geometria tridimensional (3D) é um método fundamental para entender os mecanismos de plasticidade sináptica em espinhas dendríticas. Neste protocolo, a estrutura 3D detalhada dos dendritos e colunas dendríticas é modelada com malhas no blender de software com CellBlender. As regiões sinápticas e extrassinápticas são definidas na malha. Em seguida, o receptor sináptico e as moléculas de âncora sináptica são definidas com suas constantes de difusão. Finalmente, as reações químicas entre receptores sinápticos e âncoras sinápticas são incluídas e o modelo computacional é resolvido numericamente com o software MCell. Este método descreve o caminho espacial de cada molécula em uma estrutura geométrica 3D. Assim, é muito útil estudar o tráfico de receptores sinápticos dentro e fora das espinhas dendríticas durante a ocorrência de plasticidade sináptica. Uma limitação deste método é que o alto número de moléculas diminui a velocidade das simulações. A modelagem das espinhas dendríticas com este método permite o estudo da potencialização homossináptica e da depressão dentro de espinhas simples e plasticidade heterossináptica entre as espinhas dendríticas vizinhas.

Introduction

A plasticidade sináptica tem sido associada ao aprendizado e à memória1. A plasticidade sináptica, como a potencialização a longo prazo (LTP) e a depressão de longo prazo (LTD), está associada, respectivamente, à inserção e remoção de receptores AMPA (AMPARs) dentro e fora da membrana sináptica2. As sinapses AMPAR estão localizadas no topo das pequenas estruturas de volume chamadas espinhos dendríticas3. Cada coluna contém uma região densa de proteína na membrana pós-sináptica chamada densidade pós-sináptica (PSD). Proteínas âncoras no PSD prendem AMPARs na região sináptica. Há poucas cópias de AMPARs dentro de uma única sinapse e o tráfico e reação de AMPARs com outras espécies em espinhas dendríticas é um processo estocástico2,4. Existem vários modelos compartimentais de tráfico de receptores sinápticos em lombadas dendríticas5,,6,,7,8. No entanto, há falta de modelos computacionais estocásticos do tráfico de AMPARs associados à plasticidade sináptica nas estruturas 3D dos dendritos e suas espinhas dendríticas.

A modelagem computacional é uma ferramenta útil para investigar os mecanismos subjacentes à dinâmica de sistemas complexos, como a retração-difusão de AMPARs em lombadas dendríticas durante a ocorrência de plasticidade sináptica9,,10,,11,,12. O modelo pode ser utilizado para visualizar cenários complexos, variando parâmetros sensíveis e fazendo previsões importantes em condições científicas envolvendo muitas variáveis difíceis ou impossíveis de controlar o experimental12,13. Definir o nível de detalhe de um modelo computacional é um passo fundamental na obtenção de informações precisas sobre o fenômeno modelado. Um modelo computacional ideal é um delicado equilíbrio entre complexidade e simplicidade para capturar as características essenciais dos fenômenos naturais sem ser computacionalmente proibitivo. Modelos computacionais muito detalhados podem ser caros para calcular. Por outro lado, sistemas pouco detalhados podem não ter os componentes fundamentais essenciais para capturar a dinâmica do fenômeno. Embora a modelagem 3D de lombadas dendríticas seja computacionalmente mais cara que 2D e 1D, existem condições, como em sistemas complexos com muitas variáveis não lineares reagindo e difundindo no tempo e espaço 3D, para o qual a modelagem em nível 3D é essencial para obter insights sobre o funcionamento do sistema. Além disso, a complexidade pode ser reduzida cuidadosamente para preservar as características essenciais de um modelo de dimensão inferior.

Em um sistema estocástico com poucas cópias de uma determinada espécie dentro de um pequeno volume, a dinâmica média do sistema se desvia da dinâmica média de uma grande população. Neste caso, é necessária a modelagem computacional estocástica de partículas de difusão de reação. Este trabalho introduz um método para modelagem estocástica de difusão de reação de algumas cópias de AMPARs em espinhas dendríticas 3D. O objetivo deste método é desenvolver um modelo computacional 3D de um segmento dendrático com espinhas dendríticas e suas sinapses para modelagem da plasticidade sináptica.

O método usa o software MCell para resolver o modelo numericamente, Blender para a construção de malhas 3D e CellBlender para criar e visualizar as simulações MCell, incluindo a reação espessora-difusão de moléculas em malhas 3D14,,15,,16. Blender é uma suíte para a criação de malhas e CellBlender é um complemento para o liquidificador de software base. MCell é um simulador de Monte Carlo para a difusão de reação de moléculas únicas17.

A lógica por trás do uso desse método consiste na modelagem da plasticidade sináptica para obter uma melhor compreensão desse fenômeno no ambiente microfisiológico das espinhas dendríticas14. Particularmente, este método permite a simulação de potencialização homossináptica, depressão homossináptica e plasticidade heterossináptica entre espinhas dendríticas14.

As características deste método incluem a modelagem da estrutura geométrica 3D do dendrite e suas sinapses, a difusão por caminhada aleatória e as reações químicas das moléculas envolvidas com a plasticidade sináptica. Este método oferece a vantagem de criar ambientes ricos para testar hipóteses e fazer previsões sobre o funcionamento de um sistema complexo não linear com um grande número de variáveis. Além disso, este método pode ser aplicado não apenas para estudar a plasticidade sináptica, mas também para estudar a difusão de reações estocásticas de moléculas em estruturas de malha 3D em geral.

Alternativamente, as malhas 3D de estruturas dendríticas podem ser construídas diretamente no Liquidificador a partir de reconstruções seriais de microscópio eletrônico18. Embora as malhas baseadas em reconstruções seriais forneçam estruturas 3D, o acesso aos dados experimentais nem sempre está disponível. Assim, a construção de malhas adaptadas a partir de estruturas geométricas básicas, conforme descrito no presente protocolo, proporciona flexibilidade para desenvolver segmentos dendríticos personalizados com colunas dendríticas.

Outro método computacional alternativo é a simulação em massa de reações bem mistas em um volume regular9,10,11,19,20,21,22. As simulações a granel são muito eficientes na resolução das reações de muitas espécies dentro de um único volume bem misturado23,mas a abordagem em massa é extremamente lenta para resolver a difusão de reação de moléculas dentro de muitos voxels bem misturados em uma malha 3D de alta resolução. Por outro lado, o presente método utilizando simulações MCell de difusão de reação de partículas individuais funciona eficientemente em malhas 3D de alta resolução15.

Antes de usar este método, deve-se perguntar se o fenômeno estudado requer uma abordagem de retração estocástica em uma malha 3D. Se o fenômeno tem poucas cópias (menos de 1.000) de pelo menos uma das espécies reagindo difundindo em uma estrutura geométrica complexa com pequenos compartimentos de volume, como espinhos dendráticos, então a modelagem estocástica de difusão de reação em malhas 3D é apropriada para a aplicação.

Existem várias etapas necessárias para a construção de um modelo computacional 3D de um segmento dendrático contendo espinhos dendráticos com plasticidade sináptica. As principais etapas são a instalação do software adequado para a construção do modelo, a construção de uma única coluna dendrítica a ser usada como modelo para criar múltiplas lombadas, e a criação de um segmento dendrático conectado com múltiplas espinhas dendríticas. O passo para modelagem da plasticidade sináptica consiste na inserção de âncoras na região do PSD e AMPARs no segmento dendrático e colunas dendríticas. Em seguida, são definidas reações cinéticas entre as âncoras localizadas no PSD e AMPARs para produzir espécies complexas de anchor-AMPAR que prendem os AMPARs na região sináptica. Respectivamente, o aumento e diminuição da afinidade entre as âncoras e as AMPARs sinápticas criam o processo de LTP e LTD.

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Protocol

NOTA: Consulte o arquivo suplementar 1 para o glossário dos termos utilizados neste protocolo.

1. Instale liquidificador, CellBlender e MCell

NOTA: Este protocolo requer a instalação de MCell, Blender e Blender de células.

  1. Baixe e instale o software na página inicial do MCell (https://mcell.org/tutorials_iframe.html). Vá para downloads na parte superior da página e siga as instruções passo a passo para baixar e instalar o software no ambiente de escolha (por exemplo, Linux, Mac OSX ou Windows).
    NOTA: Todos os modelos computacionais e simulações descritos neste protocolo foram testados em um pacote CellBlender 1.1 que inclui Blender 2.78 com MCell 3.4 e CellBlender 1.1. Funcionou também no Blender 2.79b. Todos esses programas de software são de acesso aberto e não exigem permissão de reimpressão para serem usados. As instruções para a construção e simulação do modelo podem mudar ligeiramente de uma versão para outra. Partes deste protocolo foram adaptadas de Tcheco et al.16.

2. Crie uma única espinha dendrítica

NOTA: Este procedimento cria uma malha de uma única coluna dendrítica com uma cabeça de coluna e um pescoço de coluna usando uma esfera modificada.

  1. Configure a exibição 3D do Liquidificador no Painel Principal.
    1. Abra o Blender com o CellBlender já instalado. Pressione 5 no teclado para mudar de Perspectiva para visão ortogonal e pressione 1 para mudar para visão frontal. A visão de perspectiva tem profundidade, mas isso não é necessário agora. Mudar de perspectiva para visão ortogonal permite uma melhor visualização da malha. Pressione Shift+C para centralizar o cursor (Figura 1A).
  2. Crie a cabeça da coluna.
    1. Pressione Shift+A para abrir a paleta de malha. Selecione a Malhação e selecione Esfera UV. Uma esfera UV é uma malha mapeada para a superfície 3D de uma esfera. A esfera UV representa a cabeça esférica de uma espinha dendrítica de cogumelo. O software pressupõe que as unidades da esfera UV são micrômetros.
    2. Altere os parâmetros no painel Adicionar esfera UV. Alterar tamanho para 0,25 e Anéis para 32 (Figura 1B). Pressione + ou – no teclado para, respectivamente, ampliar e ampliar a visualização da malha. Alternativamente, use o botão de rolagem no mouse para ampliar e sair(Figura 1C).
      NOTA: O tamanho do parâmetro dimensiona o tamanho da esfera original e os anéis de parâmetro definem a resolução da malha.
  3. Faça a parte de cima da cabeça plana.
    1. Pressione a guia para alternar o Liquidificador do Modo Objeto, o modo de interação padrão do objeto,para editar o modo. Trabalhe no Modo editar para modificar os componentes de uma malha existente.
    2. Uma vez que a malha criada tenha sido automaticamente selecionada, pressione a para desmarcar a malha criada. Pressione z para tornar a malha transparente, o que ajuda a visualizar as peças que serão editadas. Aproxime-se da malha. Pressione b para selecionar o topo 3/4 da esfera com o mouse (Figura 2A). Pressione excluir,selecione vérticese digite para remover os vértices(Figura 2B).
    3. Pressione b e selecione a parte superior. Pressione e, s, 0,e digite para selar a parte superior com os vértices ainda selecionados. Mova a seta azul para baixo para se alinhar à parte superior da cabeça da coluna vertebral(Figura 2C). Pressione z para mudar para visão sólida(Figura 3A). Pressione 7 para mudar para a visão superior.
      NOTA: A parte superior da esfera é feita plana para modelar a região PSD da cabeça da coluna vertebral.
  4. Para aumentar a resolução da malha na parte superior da coluna, selecione primeiramente Ferramenta e Faca. Corte um círculo com a faca ao redor do centro da parte superior(Figura 3B). Selecione Ferramenta e Corte e Slide de loop. Repita este passo quatro vezes para criar quatro círculos concêntricos ao redor do centro da parte superior (Figura 3C).
    NOTA: Os círculos concêntricos são usados para adicionar novos voxels que aumentarão a resolução do PSD.
  5. Crie o pescoço da coluna.
    1. Pressione para desmarcar a malha. Pressione 1 para mudar para a visão frontal. Pressione z para tornar a malha transparente. Pressione b e selecione a parte inferior da malha(Figura 4A). Pressione apagar e vertices (Figura 4B). Pressione b e selecione a parte inferior da malha(Figura 4C). Pressione e e z, -0.45 para criar uma extrusão (Figura 4D).
      NOTA: Isso cria uma extrusão na posição do eixo z a -0,45 μm. Pressione para desmarcar toda a malha.
    2. Pressione b e selecione a parte inferior do pescoço. Pressione e, s,e 0 para selar a parte inferior(Figura 4E). Pressione para selecionar toda a malha.
  6. Torne a malha compatível com MCell.
    1. Pressione Crtl+T para triangular a malha. A malha é transformada em um conjunto de triângulos interconectados. Este é um procedimento necessário para tornar a malha compatível com mCell. Selecione ferramenta e remova duplas. Use as ferramentas Remover Doubles para remover vértices duplicados, se houver, que tenham as mesmas coordenadas ou estejam muito próximos um do outro, para tornar a malha compatível com MCell.
      NOTA: Vértices duplamente sobrepostos podem ter sido acidentalmente criados durante o processo de criação e edição de malha.
    2. Selecione Objetos de modelo no painel CellBlender. Altere o nome do Objeto Ativo para coluna e pressione + para criar a coluna vertebral do objeto. No painel CellBlender,selecione Análise de malha e clique em Analisar malha (Figura 4F). Este procedimento analisará as propriedades da malha criada, incluindo o número de vértices, bordas, faces, área de superfície, volume e topologia de malha.
      NOTA: A análise imprimirá as informações no Painel de Análise de Malha e deverá ser Normales Impermeáveis, Manifolde Outward-Facing. Esta etapa é necessária para garantir que a malha funcione em MCell. Caso contrário, um passo provavelmente foi perdido. Neste caso, exclua a malha e comece novamente a partir do passo 2.1.
    3. Pressione z para visualizar a visão sólida da coluna vertebral. Pressione arquivo e salve para ter uma cópia do seu arquivo de liquidificador com a coluna vertebral no disco.
      NOTA: As dimensões (ou seja, comprimento, diâmetro, tamanho) das malhas estão em micrômetros. Consulte o glossário para obter o significado de cada atalho de teclado.

3. Criando um dendrite com múltiplas espinhas

  1. Gerar uma coluna vertebral como descrito anteriormente nas seções 2.1-2.6. Pressione para desmarcar a coluna. Digite Shift+C para centralizar o cursor.
  2. Crie um dendrite. Pressione Shift+A para abrir a paleta de malha. Selecione Malha e, em seguida, Cilindro. Alterar os parâmetros no menu Adicionar cilindro: Raio = 0,3 μm, Profundidade = 2 μm. Pressione Enter.
    NOTA: Os parâmetros raio e profundidade são definidos de acordo com as características geométricas do dendrite.
  3. Insira uma coluna na dendrita.
    1. Pressione r e tipo 90 para girar o cilindro 90° (Figura 5A). Use a seta azul para arrastar o cilindro até a parte inferior da coluna. Pressione 3 no teclado para ter uma visão frontal do cilindro.
    2. Pressione z para tornar a malha transparente. Use o mouse para mover a seta azul normal do cilindro para baixo para mover a base da coluna para o interior do cilindro(Figura 5B). Pressione para desmarcar todos os objetos.
    3. Use o botão direito do mouse para selecionar o dendrite(Figura 5C). Selecione Modificador no painel Liquidificador(Figura 5D),selecione Adicionar modificador. Em seguida, selecione Boolean,selecione Operação Uniãoe selecione Coluna de objeto. Pressione Aplicar para criar uma malha articular do dendrite e da coluna vertebral(Figura 5E). Esta operação cria uma nova malha mesclando duas malhas em uma única.
      NOTA: A nova malha será o dendrite combinado e a coluna vertebral. O dendrite isolado desaparece quando as diferentes malhas são combinadas, mas a malha isolada da coluna permanece sobreposta com a nova malha e é usada para gerar múltiplas cópias da mesma coluna vertebral. Exclua todas as espinhas isoladas após terminar a malha. É fundamental ter uma sobreposição completa entre o pescoço da coluna vertebral e o dendrite, caso contrário, a malha não será impermeável.
  4. Coloque o objeto dendrite no ambiente CellBlender.
    1. Pressione para desmarcar as malhas. Clique com o botão direito do mouse com o mouse para selecionar apenas o dendrite. Selecione CellBlender, Model Objectse altere Objeto Ativo para Dendrite e pressione + para criar o objeto Dendrite.
  5. Insira novas espinhas no dendrite.
    1. Pressione 1 para mudar para a visão lateral do cilindro. Use o mouse para selecionar a malha da coluna isolada. Para inserir mais colunas, siga o passo 3.3, alterando a posição e o ângulo para inserir cada uma delas para obter uma distribuição fisiológica.
  6. Torne a malha compatível com MCell. Para isso, pressione Tab para ir ao modo de edição. Pressione para selecionar toda a malha. Pressione Crtl+T para triangular a malha. Selecione Ferramenta no painel Liquidificador e selecione Remover duplos.
  7. Estilize as malhas.
    1. Suavize a malha. Pressione a guia para alterar para o modo objeto. Selecione Ferramenta no painel Liquidificador e selecione Smooth. Selecione CellBlender, Model Objectse selecione Adicionar um material.
    2. Torne a malha transparente selecionando objeto transparente e transparente de material. Mude alfa para 0,5 e entre para deixar a malha parcialmente transparente. Pressione z para mudar para uma visão sólida.
  8. Confirme se a malha ainda é compatível com mCell. Para isso, selecione Análise de malha no painel CellBlender para ter certeza de que a malha ainda é impermeável, malha de coletorese voltada para fora normal.
  9. Salve o arquivo do liquidificador como dendrite_with_spines.blend.

4. Defina regiões superficiais

NOTA: Este procedimento cria as regiões superficiais da malha que mais tarde serão usadas para configurar como as regiões interagem com as moléculas.

  1. Abra o arquivo dendrite_with_spines no ambiente do Liquidificador. Para isso, selecione Arquivo, Abrir , dendrite_with_spines.blende Arquivo de Liquidificador Aberto.
  2. Prepare a malha para definir as regiões superficiais. Para isso, pressione Tab para alterar para editar o modo. Pressione z para alterar para exibição transparente(Sombreamento de porta de exibição, wireframe). Pressione a para selecionar toda a malha do dendrite com espinhas. Selecione Objetos de modelo. Selecione Dendrite. Pressione para ocultar o painel CellBlender e visualize melhor toda a malha no painel principal.
    1. Use + e – no teclado para ampliar e sair ou rolar com o mouse. Isso é necessário para uma melhor visualização da parte superior das lombadas para selecionar e definir as regiões superficiais. Pressione para desmarcar o objeto. Pressione a guia para alterar para Editar o modo. Pressione para mostrar o painel CellBlender novamente.
  3. Defina a região da superfície do PSD. Para isso, pressione b e selecione a parte superior de uma coluna dendrítica com o mouse (Figura 6A,6B). Pressione + em Regiões de Superfície Definidas. Alterar o Nome da Região para PSD1 e clicar em Atribuir ( Figura6C). Pressione para desmarcar o objeto.
  4. Defina a região da superfície extrassináptica. Para isso, pressione b e selecione a região ao redor da parte superior da coluna dendrítica com o mouse(Figura 6D). Repita o passo 4.3 para o Nome da Região para Extra_syn1. Repita a etapa 4.3 para as demais colunas para definir as demais regiões da malha (PSD2, PSD3, PSD4, Extra_syn2, Extra_syn3e Extra_syn4) (Figura 6F). Pressione para desmarcar o objeto.
  5. Defina as regiões superficiais das extremidades do dendrite. Para isso, pressione b e selecione a extremidade esquerda do dendrito. Alterar o Nome da Região para Left_end e clicar em Atribuir. Pressione para desmarcar o objeto. Pressione b e selecione a extremidade direita do dendrito (Figura 6E). Alterar o Nome da Região para Right_end e clicar em Atribuir.
    NOTA: Mova a malha para encontrar a melhor posição para selecionar cada Região Definida.

5. Criar moléculas

  1. Criar AMPARs. Para isso, selecione Moléculas no Painel CellBlender. Selecione + em Moléculas Definidas para inserir uma nova molécula e alterar nome para AMPAR. Alterar tipo de molécula para molécula de superfície e difusão Constante para 0,05e-8 cm2/s14 para definir a constante de difusão de AMPARs na membrana (Figura 7A).
  2. Criar âncoras. Para isso, selecione Moléculas no Painel CellBlender. Selecione + em Moléculas Definidas para inserir uma nova molécula e alterar nome para ancorar. Alterar tipo de molécula para molécula de superfície e alterar difusão Constante para 0,001e-8 cm2/s14 para definir a constante de difusão das âncoras na membrana(Figura 7A).
  3. Para criar âncoras vinculadas a AMPARs, selecione Moléculas no Painel CellBlender. Selecione + em Moléculas Definidas para inserir uma nova molécula. Mude o nome para anchor_AMPAR. Alterar tipo de molécula para molécula de superfície. Alterar difusão Constante para 0,001e-8 cm2/s14.
  4. Crie o anchor_LTP e anchor_AMPAR_LTP. Para isso, repita o passo 5.2. Nomeie a molécula anchor_LTP. Repita o passo 5.3. Nomeie a molécula anchor_AMPAR_LTP.
    NOTA: O anchor_LTP tem alta afinidade com a AMPAR; assim, os AMPARs aumentam nas regiões sinápticas.
  5. Crie o anchor_LTD e anchor_AMPAR_LTD. Para criar uma âncora_LTD,repita o passo 5.2., Nomeie a molécula anchor_LTD. Repita o passo 5.3. Nomeie a molécula anchor_AMPAR_LTD.
    NOTA: O anchor_LTD tem baixa afinidade com a AMPAR; assim, os AMPARs diminuem na região sináptica.

6. Defina classes de superfície

NOTA: Este procedimento define as classes com as propriedades associadas às regiões superficiais. As regiões extrassinápticas refletem as âncoras e âncoras livres vinculadas à AMPAR. As extremidades laterais do dendrite refletem todas as moléculas.

  1. Defina as propriedades das regiões extrassinápticas.
    1. Pressione a guia para alterar para o modo objeto. Selecione classes de superfície no painel CellBlender. Pressione + na Classe Surface para definir uma nova classe de superfície.
    2. Faça com que a região extrassináptica reflita o AMPAR ligado às moléculas âncoras.
      NOTA: Este procedimento irá prender as âncoras e tudo o que está ligado a elas dentro da região sináptica.
      1. Alterar o nome da classe surface para reflective_extra_syn. Pressione + sobre reflective_extra_syn Propriedades para associá-lo a uma molécula. Selecionar moléculas | Molécula única. Selecione anchor_AMPAR. Selecione Orientação = Ignorar. Selecionar tipo = Reflexivo para fazer a região mostrar as moléculas anchor_AMPAR.
      2. Repetindo o passo 6.1.2.1 para anchor_AMPAR_LTP e anchor_AMPAR_LTD.
    3. Faça a região extrassináptica refletir as âncoras.
      1. Pressione + sobre reflective_extra_syn Propriedades para associá-lo a uma molécula. Selecionar moléculas | Molécula única. Selecione âncora. Selecione Orientação = Ignorar. Selecione o tipo = Reflexivo para fazer a região refletir as moléculas âncoras.
      2. Repetindo o passo 6.1.3.1 para anchor_LTP e anchor_LTD.
  2. Defina as propriedades das extremidades do dendrite. Para isso, pressione + na Surface Class para definir uma nova classe de superfície. Alterar o nome da classe surface para reflective_ends. Pressione + em Propriedades para associá-lo a uma molécula. Properties Selecionar moléculas | Todas as moléculas de superfície. Selecionar orientação | Ignore. Selecionar tipo | Reflexivo para fazê-lo refletir todas as moléculas da superfície.

7. Atribuir as classes criadas a cada região de superfície

NOTA: Esta etapa atribui as classes de superfície às regiões superficiais.

  1. Atribua as propriedades das extremidades do dendrite.
    1. Pressione + para atribuir uma classe de superfície com uma região. Selecione reflective_ends para Nome de Classe De superfície (Figura 7C). Selecione Dendrite para Nome do Objeto. Selecione Região Especificada para Seleção de Região. Selecione Left_end para Nome da Região.
    2. Repita o passo 7.1.1 para o Right_end (Figura 7D).
  2. Atribua as propriedades das regiões extrassinápticas.
    1. Pressione + para atribuir uma classe de superfície com uma região. Selecione reflective_extra_syn para Nome de Classe De superfície. Selecione Dendrite para Nome do Objeto. Selecione Região Especificada para Seleção de Região. Selecione Extra_syn1 para Nome da Região.
    2. Repita o passo 7.2.1 para Extra_syn2, Extra_syn3e Extra_syn4.

8. Coloque moléculas na malha

NOTA: Esta etapa coloca as AMPARs, âncorase AMPAR ligadas a âncoras na malha.

  1. Para colocar moléculas AMPAR na malha, selecione A colocação de moléculas no painel CellBlender. Pressione + sobre os sites de lançamento/colocação para criar um novo site de lançamento. Alterar nome do site para relAMPAR (Figura 7B). Molécula selecionada = AMPAR. Objeto/Região = Dendrite[ALL]-(Dendrite[Left_end]+Dendrite[Right_end]). Quantidade para Liberação = 1.000.
  2. Coloque moléculas de âncora na Malha.
    1. Selecione a colocação da molécula no painel CellBlender. Pressione + sobre os sites de lançamento/colocação para criar um novo site de lançamento. Alterar o nome do site para rel_anchor_PSD1. Selecione âncorade molécula. Objeto/Região = Dendrite[PSD1]. Quantidade para Liberação = 200.
    2. Repetir a etapa 8.2.1 para PSD2, PSD3e PSD4.
  3. Coloque moléculas anchor_LTP na malha. Para isso, selecione A colocação de moléculas no painel CellBlender. Pressione + sobre os sites de lançamento/colocação para criar um novo site de lançamento. Alterar o nome do site para rel_anchor_LTP_PSD1. Selecionar molécula = anchor_LTP. Objeto/Região = Dendrite[PSD1]. Quantidade para Liberação = 0.
    NOTA: anchor_LTP é uma âncora com alta afinidade de ligação para AMPARs.
  4. Coloque anchor_LTD Moléculas na Malha repetindo o passo 8.3 para anchor_LTD.
    NOTA: anchor_LTD é uma âncora com baixa afinidade de ligação para AMPARs.

9. Crie as reações químicas

  1. Criando a reação entre âncora e AMPARs.
    1. Selecione Reações (Figura 7D) para criar as reações. Pressione + para incluir uma nova reação. Reagentes = âncora' + AMPAR'. Tipo de reação = <->. Isso define uma reação bidirecional. Produtos = anchor_AMPAR'. Taxa de avanço = 0,03. Taxa de retrocesso = 0,05.
  2. Crie a reação entre ANCHOR_LTP e AMPARs. Para isso, repita o passo 9.1, mas substitua a âncora por anchor_LTP, e use uma Taxa Retrógrada = 0,005 para aumentar a afinidade entre os reagentes.
  3. Crie a reação entre anchor_LTD e AMPARs e salve o arquivo. Para isso, repita o passo 9.2, mas substitua a âncora por anchor_LTD, e use uma Taxa Retrógrada = 0,5 para diminuir a afinidade entre os reagentes. Em seguida, salve o arquivo.

10. Plote a saída do modelo

  1. Âncoras de enredo vinculadas a AMPARs no PSD1 durante a condição basal. Para isso, selecione Configurações de saída de parcelas. Pressione + para definir as moléculas. Selecione anchor_AMPAR em Molécula. Selecione dendrite no Objeto. Selecione PSD1 na Região. Repita a etapa 10.1 para todas as regiões do PSD.
    NOTA: É útil observar o número basal de AMPARs presos ao PSD de cada coluna dendrítica. O número de âncoras vinculadas às AMPARs pode aumentar ou diminuir em comparação com as condições basais durante a LTP e a LTD.
  2. Âncoras de enredo vinculadas a AMPARs no PSD1 durante o LTP. Faça isso repetindo o passo 10.1. Substitua anchor_AMPAR por anchor_AMPAR_LTP, em seguida, as âncoras de enredo vinculadas aos AMPARs no PSD1 durante a LTD e, finalmente, repita o passo 10.1, mas substitua anchor_AMPAR_LTP por anchor_AMPAR_LTD.

11. Execute as simulações

  1. Para executar a condição basal, selecione Simulação de execução. Selecione Iterações = 30.000. Etapa de tempo definida = 1e-3 s. Pressione exportação e execução. Espere até a simulação acabar. Pode levar de minutos a horas.
    NOTA: Na condição basal, não há liberação de moléculas de anchor_LTP e rel_anchor_LTD . Quanto aos parâmetros da simulação, o número de iterações precisa ser longo o suficiente para poder observar a difusão de AMPARs dos dendritos e sua ancoragem no PSD. Pequenos passos de tempo são mais precisos, mas mais lentos para completar a simulação.
  2. Selecione Dados de visualização da recarga. Selecione a animação de reprodução para visualizar os resultados espesso(Figura 8). Selecione Configurações de saída de parcela. Gráfico de imprensa.
    NOTA: Os gráficos gerados pelo CellBlender são séries temporais isoladas das espécies químicas selecionadas. Programas de terceiros podem ser usados para importar os dados salvos de várias simulações para criar parcelas sobrepostas de várias condições (por exemplo, basal, LTP, LTD; ver Figura 8).
  3. Executar a condição de potencialização homossináptica (ou seja, LTP; ver Figura 8). Para isso, selecione A colocação de moléculas no painel CellBlender. Selecione rel_anchor_LTP_PSD1 nos sites de liberação/colocação.
  4. Alterar quantidade para liberação = 200. Selecione rel_anchor_LTD_PSD1 nos sites de liberação/colocação. Alterar quantidade para liberação = 0. Selecione rel_anchor _PSD1 nos sites de liberação/colocação. Alterar quantidade para liberação = 0. Repetir as etapas 11.1-11.2.
  5. Executar a condição de depressão homossináptica (i.e., LTD; ver Figura 8). Para isso, libere 200 rel_anchor_LTD_PSD1 em vez de rel_ANCHOR_LTP_PSD1. Definir rel_anchor e rel_anchor_LTP_PSD1 a zero. Repetir as etapas 11.1-11.2.

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Representative Results

Esses resultados fornecem os passos para a construção de uma malha 3D que simula uma coluna dendrítica com cabeça de coluna e pescoço de coluna(Figura 1 a Figura 4). Além disso, múltiplas espinhas dendríticas podem ser inseridas em um único segmento dendrático (Figura 5) para estudar a plasticidade heterossináptica de AMPARs14. O PSD na parte superior da cabeça da coluna vertebral (Figura 6) é o lugar onde as âncoras sinápticas se ligam aos AMPARs e as prendem temporariamente na sinapse (Figura 7, Figura 8).

A plasticidade sináptica pôde ser verificada aproximadamente através de alterações no número de espécies de anchor_AMPAR, anchor_AMPAR_LTPe anchor_AMPAR_LTD em cada coluna. Para o cálculo exato da ocorrência de plasticidade sináptica, recomenda-se calcular a variação no número total de AMPARs ancorados e livres na sinapse. Isso pode ser realizado usando programas de terceiros para abrir os dados salvos da simulação para resumir a série temporal dos AMPARs gratuitos e dos AMPARs ancorados em cada PSD (Figura 8).

A liberação de AMPARs na malha permitiu a observação de sua difusão por uma caminhada aleatória estocástica ao longo das espinhas dendrito e dendrítica. Fatores que modificam a afinidade das AMPARs para as âncoras, como modificações pós-translacionais e alterações das taxas de endocitose e excitose, podem prender as AMPARs no PSD24,,25,,26. A vinculação de AMPARs com as âncoras localizadas no PSD aprisionou uma alta densidade de AMPARs na sinapse. A potencialização homossináptica (Figura 9) e a depressão(Figura 10) puderam ser verificadas respectivamente através de aumentos e reduções no número de AMPARs ancorados causadas por alterações na afinidade de AMPARs por âncoras em comparação com a condição basal(Figura 11). Fatores que reduziram a afinidade das AMPARs com as âncoras liberaram múltiplos AMPARs de uma coluna dendrítica (ou seja, depressão homossináptica) e induziram a potencialização heterossináptica nas espinhas vizinhas. Além disso, fatores que aumentaram a afinidade das AMPARs para as âncoras em uma coluna induziram a potencialização homossináptica naquela coluna vertebral e a depressão heterossináptica nas espinhasvizinhas 14. Dessa forma, a plasticidade heterossináptica foi observada como o efeito oposto nas espinhas vizinhas da plasticidade homossináptica induzida em uma determinada coluna. Por exemplo, a indução homossináptica de LTP em uma única coluna criou um efeito LTD heterossináptico nas espinhas vizinhas(Figura 8E,F,G).

Figure 1
Figura 1: Criação da cabeça dendrítica da coluna usando uma malha esférica. (A) Adicionando a esfera UV. (B) Configuração das dimensões da esfera. (C)Observando a esfera criada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Construção da região superior. (A) Selecionando a região superior da esfera. (B) Remoção da região selecionada para torná-la plana. (C) Selar a parte superior plana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Criando áreas concêntricas na parte superior da coluna. Visualizandoa parte superior. (B) Utilização de uma faca para definir uma região concêntrica. (C) Criação de múltiplas regiões concêntricas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Criando o pescoço da coluna dendrítica. (A) Selecionando a parte inferior da esfera modificada. (B) Deletar os vértices selecionados. (C) Selecionando a parte inferior. (D)Extrusão da parte inferior para criar o pescoço da coluna. (E) Selar a parte inferior do pescoço da coluna. (F) Analisando a coluna criada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Criação do dendrite com múltiplas espinhas. (A) Usando a malha cilíndrica para criar um dendrite. (B) Alinhar a coluna dendrítica com o cilindro. (C) Juntando o cilindro com a coluna vertebral. (D) A operação booleana para juntar as malhas. (E) A nova malha combinada. (F) Adicionando a segunda coluna. (G) Adicionando a terceira coluna. (H) Adicionando a quarta coluna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Definindo a região do PSD e a zona perisináptica. (A)Seleção da região do PSD. (B) Visão detalhada do PSD criado. (C) Definição da região da superfície do PSD. (D) Selecionar e definir a zona perisináptica em torno do PSD. (E) Selecionar e definir a superfície lateral do dendrite. (F) Regiões de superfície definidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Definindo as moléculas da superfície. (A) Definição de AMPAR, âncora e AMPAR vinculados à ancoragem. (B) Definindo a localização e quantidade de cópias AMPAR. (C) Definindo as Classes de Superfície. (D) Atribuindo as Classes de Superfície. (E) Criação das reações químicas entre as moléculas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Resultados representativos da plasticidade sináptica. (A) Diferentes malhas de um segmento dendrático com duas, quatro ou oito espinhas. (B) Uma visão diferente do segmento dendrático com oito espinhas. (C) Visão detalhada de uma coluna dendrítica com AMPARs e âncoras no PSD. (D) Diagrama do tráfico de AMPARs dentro e fora do PSD através de suas interações com as âncoras. (E-G) As curvas mostram o número de AMPARs sinápticos em cada PSD para a condição basal e durante a LTP e LTD. A indução de LTP homossináptico ou LTD em uma única coluna criou um efeito heterossináptico nas espinhas próximas para a malha com duas espinhas(E),quatro colunas(F)e oito colunas(G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Resultado representativo da condição de LTP. (A) O eixo x é o tempo e o eixo y é o número do complexo anchor_LTP_AMPAR no PSD1. Houve um lançamento de 200 anchor_LTP grátis no início da simulação. Um maior número de títulos com âncoras foi formado em comparação com a condição basal (Figura 11) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Resultado representativo da condição LTD. (A) O eixo x é o tempo e o eixo y é o número do complexo anchor_LTD_AMPAR no PSD1. Houve um lançamento de 200 anchor_LTD grátis no início da simulação. Foi formado menor número de ligações com âncoras em comparação com a condição basal (Figura 11). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: Resultado representativo durante a condição basal. (A) O eixo x é o tempo e o eixo y é o número do complexo anchor_AMPAR no PSD1. Houve um lançamento de 200 âncoras grátis no início da simulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo complementar 1. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Este artigo apresenta um método para a construção de malhas 3D para modelagem de processos de plasticidade sináptica de reação-difusão em um segmento dendrático com espinhas dendríticas. O modelo desenvolvido contém um segmento dendrítica com poucas espinhas dendríticas. A difusão lateral e a reação de AMPARs com âncoras sinápticas permitem a simulação da dinâmica basal. Os passos críticos do protocolo são o corte da esfera para a criação da parte superior da cabeça da coluna vertebral (Figura 1, Figura 2, Figura 3), a extrusão para criar o pescoço da coluna vertebral(Figura 4), e a junção do dendrite e das espinhas em uma única malha(Figura 5). É fundamental ter uma sobreposição completa entre os pescoços da coluna vertebral e o dendrite; caso contrário, a malha não será impermeável. Outras etapas críticas são a seleção das regiões de membrana e a definição das classes superficiais(Figura 6, Figura 7). Salve os arquivos para cada etapa crítica com um nome diferente.

Use a ferramenta de análise de malha para garantir que a malha esteja impermeável, coletora e voltada para fora normalmente após a criação da coluna vertebral única e depois de criar o dendrite combinado com a coluna vertebral. Se a malha falhar nesta análise, retorne à última versão correta salva. Algumas etapas podem ser ligeiramente diferentes dependendo da versão do software instalado, do sistema operacional e do tipo de teclado.

Este protocolo simula o tráfico de moléculas AMPAR na malha 3D (Figura 8, Figura 9, Figura 10, Figura 11), que é fundamental para a transmissão excitatória neuronal e plasticidade sináptica. O tráfico de moléculas únicas em uma malha 3D é uma característica valiosa deste modelo em relação aos métodos existentes baseados em volumes bem misturados com distribuições homogêneas das moléculas21,22, que não é a condição fisiológica nas sinapses27. Uma limitação desta técnica é o alto custo computacional e a velocidade lenta das simulações que usam um alto número de cópias de cada molécula e um alto número de reações químicas entre elas. Essa restrição pode ser superada reduzindo o número de cópias de cada espécie.

A construção de um sistema com uma malha 3D realista e rastreamento espacial de moléculas é uma poderosa ferramenta para testar cenários mecânicos que podem dar grandes insights sobre o funcionamento de sistemas com um alto número de variáveis não lineares.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de Ciência do Estado de São Paulo (FAPESP) #2015/50122-0 e IRTG-GRTK 1740/2, pela bolsa IBM/FAPESP #2016/18825-4, e pela concessão da FAPESP #2018/06504-4.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blender Blender Foundation https://www.blender.org/
CellBlender University of Pittsburgh https://mcell.org/
Mcell University of Pittsburgh https://mcell.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurociência Edição 159 tráfico de receptores AMPA difusão de reação plasticidade sináptica colunas dendríticas modelagem computacional potencialização a longo prazo depressão a longo prazo plasticidade heterossináptica
Modelagem 3D de Espinhos Dendríticas com Plasticidade Sináptica
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Antunes, G., Simoes de Souza, F. M. 3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity. J. Vis. Exp. (159), e60896, doi:10.3791/60896 (2020).

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