Summary
हमने गंध संकेतों के नमूने और विश्लेषण के लिए एक प्रभावी पद्धति विकसित की है ताकि यह समझा जा सके कि उनका उपयोग पशु संचार में कैसे किया जा सकता है। विशेष रूप से, हम पशु गंध और सुगंध-चिह्नों के अस्थिर घटकों का विश्लेषण करने के लिए गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन का उपयोग करते हैं।
Abstract
हमने गंध संकेतों के नमूने और विश्लेषण के लिए एक प्रभावी पद्धति विकसित की है, हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन का उपयोग करके गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर, यह समझने के लिए कि उनका उपयोग पशु संचार में कैसे किया जा सकता है। यह तकनीक नमूने में घटकों की पृथक्करण और अस्थायी पहचान को सक्षम करके गंध स्राव के अस्थिर घटकों के अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है, जिसके बाद पीक क्षेत्र अनुपात के विश्लेषण के बाद उन रुझानों की तलाश की जाती है जो संकेत में शामिल यौगिकों को दर्शाता है। इस वर्तमान दृष्टिकोण की प्रमुख ताकत नमूना प्रकारों की सीमा है जिसका विश्लेषण किया जा सकता है; किसी भी जटिल नमूना तैयारी या निष्कर्षण की आवश्यकता की कमी; मिश्रण के घटकों को अलग करने और विश्लेषण करने की क्षमता; पता चला घटकों की पहचान; और पता लगाया घटकों पर अर्द्ध मात्रात्मक और संभावित मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने की क्षमता । कार्यप्रणाली की मुख्य सीमा स्वयं नमूनों से संबंधित है। चूंकि विशिष्ट रुचि के घटक अस्थिर हैं, और इन्हें आसानी से खो दिया जा सकता है, या उनकी सांद्रता बदल जाती है, यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों को उनके संग्रह के बाद उचित रूप से संग्रहीत और ले जाया जाता है। इसका मतलब यह भी है कि नमूना भंडारण और परिवहन की स्थिति अपेक्षाकृत महंगी है । इस विधि के नमूनों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है (मूत्र, मल, बाल और खुशबू ग्रंथि गंध स्राव सहित) । इन गंधों में जटिल मिश्रण होते हैं, जो मैट्रिस की एक श्रृंखला में होते हैं, और इस प्रकार व्यक्तिगत घटकों को अलग करने और जैविक ब्याज के यौगिकों को निकालने के लिए तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है।
Introduction
जानवरों में घ्राण संकेतों को रेखांकित करने वाले रासायनिक परिवर्तनों के बारे में बहुत कम जानकारी है1, गंध2के अस्थिर रासायनिक प्रोफाइल को रिकॉर्ड करने और मात्रा में पद्धतिगत चुनौतियों के कारण भी । अत्यधिक जटिल, रासायनिक मैट्रिस के साथ काम करते समय कई संभावित नुकसान होते हैं; ये शामिल है जब नमूना और गंध नमूने का विश्लेषण3.
रोसालिंद फ्रैंकलिन साइंस सेंटर, यूनिवर्सिटी ऑफ वुल्वरहैम्पटन में, हम गंध और खुशबू के विश्लेषण-अंकों को यह समझने के लिए उपक्रम कर रहे हैं कि उनका उपयोग जानवरों द्वारा कैसे किया जा सकता है। हम पशु संचार में घ्राण संकेतों द्वारा निभाई गई भूमिका की हमारी समझ में सुधार करने के लिए व्यवहार पारिस्थितिकी, एंडोक्राइनोलॉजी और साइटोलॉजी के साथ अर्धविज्ञान को जोड़ते हैं।
हमने एक पद्धति विकसित की है और फिर कई गैर-मानव वानरों (यानी, ताज पहनाया लेमर, लाल-रफ्ड लेमर, जापानी मकाक, जैतून लंगूर, चिंपांजी) और अन्य स्तनधारियों (यानी बिल्लियों, गायों) सहित विभिन्न प्रजातियों से गंध और चिह्नों का विश्लेषण किया है। हमने मूत्र, मल, बाल और सुगंध-ग्रंथि गंध स्राव सहित विभिन्न नमूनों को एकत्र और विश्लेषण किया है। इन गंधों और खुशबू के निशान यौगिकों के जटिल मिश्रण से मिलकर बनता है और इसलिए किसी भी उनके विश्लेषण के लिए इस्तेमाल की पद्धति को विभाजक तकनीक के कुछ फार्म शामिल करने की जरूरत है । जैसा कि सचित्र है, वे मैट्रिस की एक श्रृंखला में भी होते हैं जो ब्याज के घटकों को निकालने के लिए तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है।
Vaglio एट अल द्वारा पिछले अध्ययन4 और अन्य लेखकों5 गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) के साथ गतिशील हेडस्पेस निष्कर्षण (DHS) का इस्तेमाल किया, जबकि प्रत्यक्ष विलायक निष्कर्षण6 और जटिल विलायक निष्कर्षण7 भी इस्तेमाल किया गया है । विशेष रूप से, गतिशील हेडस्पेस नमूने में निष्क्रिय गैस की एक ज्ञात मात्रा के साथ हेडस्पेस को शुद्ध करना शामिल है जो अंततः नमूना मैट्रिक्स के लिए एक मजबूत आत्मीयता दिखाने वालों के अपवाद के साथ सभी अस्थिर यौगिकों को हटा देता है (उदाहरण के लिए, जलीय नमूनों में ध्रुवीय यौगिक)।
वर्तमान कार्यप्रणाली के लिए, हमने जीसी-एमएस के साथ मिलकर हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन (एचएस-एसपीएमई) की तकनीक अपनाई है। विशेष रूप से, हमने अपनी पिछली जीसी-एमएस प्रयोगशाला8,9,10में वग्लिओ एट अल द्वारा पहले से ही उपयोग की जाने वाली पद्धति को विकसित और बढ़ाया है।
सॉल्वैंटलेस निष्कर्षण तकनीक छोटे, अत्यधिक अस्थिर यौगिकों (जो अन्यथा एक नमूने से आसानी से खो सकती हैं) का विश्लेषण करने के लिए बहुत प्रभावी हैं क्योंकि ये विधियां एक स्थिर, ठोस चरण समर्थन पर यौगिकों को स्थिर करती हैं। एचएस-एसपीएमई नमूना हेडस्पेस में अस्थिर यौगिकों को पकड़ने या जलीय जैविक तरल पदार्थ11में विसर्जन द्वारा भंग यौगिकों को निकालने के लिए एक एसोरबेंट बहुलक के साथ लेपित फाइबर का उपयोग करता है। बहुलक कोटिंग यौगिकों को दृढ़ता से बांधती नहीं है, इसलिए जीसी के इंजेक्शन बंदरगाह में गर्म करके उन्हें हटाया जा सकता है। यह विधि विलायक निष्कर्षण तकनीकों की तुलना में अधिक शक्तिशाली है और डीएचएस की तुलना में अधिक प्रभावी भी है।
वर्तमान दृष्टिकोण नमूनों में कांच की शीशियों के भीतर निहित हैं। इन शीशियों को 40 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर गर्म किया जाता है ताकि जानवरों के शरीर के तापमान को अनुकरण किया जा सके ताकि शीशी के सिर-स्थान पर कब्जा करने के लिए सुगंध-निशान के अस्थिर घटकों को बढ़ावा दिया जा सके। एक एसपीएमई फाइबर, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन/डिविनिलबेनजेन (पीडीएमएस/डीवीबी) शर्बत सामग्री के 65 माइक्रोन के साथ लेपित, हेडस्पेस पर्यावरण के संपर्क में है और नमूने से अस्थिर घटकों को फाइबर पर सोख रहे हैं। जीसी-एमएस के इनलेट पोर्ट में फाइबर को गर्म करने पर, अस्थिर घटकों को फाइबर से अलग किया जाता है और फिर जीसी द्वारा अलग किया जाता है। एमएस का उपयोग करके प्रत्येक घटक के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रल विखंडन पैटर्न प्राप्त किए जाते हैं। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रल डेटाबेस के खिलाफ इन द्रव्यमान स्पेक्ट्रा की तुलना करके, सुगंध-चिह्न के घटकों को अंतरिम रूप से पहचानना संभव हो सकता है। एक ऑटो-पारखी के उपयोग के माध्यम से, हम लगातार तरीके से बैचों में कई नमूनों का विश्लेषण करने में सक्षम हैं।
यह देखते हुए कि प्रत्येक प्रकार के एसपीएमई फाइबर में ध्रुवीय रसायनों के साथ एक अलग आत्मीयता होती है, फाइबर को आमतौर पर ध्रुवीयता और/या लक्ष्य रासायनिक यौगिकों के आणविक वजन के आधार पर चुना जाता है । इसके अलावा, जीसी की स्थिति जीसी कॉलम के प्रकार और लक्ष्य रासायनिक यौगिकों की विशेषताओं के आधार पर बदल रहे हैं ।
यह तकनीक नमूने में घटकों की पृथक्करण और अस्थायी पहचान को सक्षम करके सुगंध-चिह्नों के अस्थिर घटकों के अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है, जिसके बाद पीक एरिया अनुपात के विश्लेषण के बाद उन रुझानों की तलाश की जाती है जो संकेत देने में शामिल होने वाले सुगंध-अंकन के घटकों को दर्शाता है।
इस वर्तमान दृष्टिकोण की प्रमुख ताकत हैं:
- नमूना प्रकारों की सीमा जिसका विश्लेषण किया जा सकता है।
- कोई जटिल नमूना तैयार करने या निष्कर्षण की आवश्यकता नहीं है।
- अस्थिर घटकों का विश्लेषण करने की क्षमता।
- मिश्रण के घटकों को अलग करने की क्षमता।
- पता लगाया घटकों की पहचान करने में सक्षम होना।
- पता लगाया घटकों पर अर्द्ध मात्रात्मक और संभावित मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने की क्षमता।
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Protocol
1. नमूना संग्रह
- नमूना गंध जो निम्नलिखित में से एक हैं:
- बाँझ फिल्टर पेपर (जैसे, खुशबू ग्रंथि गंध स्राव) या सीधे शीशियों (जैसे, मूत्र) पर खुशबू-अंकन के माध्यम से आदत अध्ययन विषयों (उदाहरण के लिए, चिड़ियाघर वानरों) द्वारा अनायास जारी एकत्र करें।
- सकारात्मक सुदृढीकरण प्रशिक्षण का उपयोग करके अध्ययन विषयों के प्रशिक्षण के बाद बाँझ कपास झाड़ू रगड़ द्वारा लीजिए।
- अध्ययन विषयों के बेहोश होने के बाद बाँझ कपास झाड़ू रगड़ कर लीजिए।
- बाँझ 10 एमएल पेंच में नमूने जगह स्पष्ट कांच शीशियों छाया हुआ है, और पेंच के साथ सील FTFE/सिलिकॉन सेप्टा को शामिल टोपियां सबसे ऊपर है । तुरंत उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: स्वच्छ व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जैसे नाइट्रिल दस्ताने; उन्हें बार-बार बदलें; नमूनों और शीशियों के साथ सीधे त्वचा संपर्क से बचें। यह ब्रांड नई शीशियों का उपयोग करने के लिए पसंद किया जाता है; हालांकि, उपयोग की गई शीशियों के मामले में, शीशियों को पूर्व-साफ करना महत्वपूर्ण है, और फिर उसी प्रोटोकॉल का उपयोग करें। - हर बार खुशबू-निशान एकत्र कर रहे हैं पर्यावरण रिक्त स्थान ले लो। उदाहरण के लिए, नमूनाकरण मीडिया (जैसे, फ़िल्टर पेपर या स्वैब) और एक हेडस्पेस शीशी एकत्र करें जो नमूना लेते समय पर्यावरण के संपर्क में आती है।
2. नमूना तैयार करना
- एक ब्लेड के साथ काटने के द्वारा क्षेत्र में नमूने तैयार एक खुशबू के निशान फिल्टर पेपर, या झाड़ू के सिर से एक लगभग 10 मिमी वर्ग, और यह एक 10 एमएल पेंच में रखने के सिर अंतरिक्ष शीशी में अव्वल रहा ।
- प्रत्येक नमूना तैयार किया गया है के बाद, निपटान या एक उपयुक्त जीवाणुरोधी पोंछ और/या शराब और सूखी अच्छी तरह से सूखी का उपयोग कर नमूना मीडिया में कटौती करने के लिए इस्तेमाल ब्लेड को साफ ।
- सभी नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: -20 डिग्री सेल्सियस पर पसंद किया गया या अन्यथा क्षेत्र में व्यावहारिक रूप से संभव के रूप में कम।
3. विश्लेषण के लिए तैयारी
- फ्रीजर से नमूने निकालें और कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान के लिए स्वाभाविक रूप से गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं।
- जीसी-एमएस पर विश्लेषणात्मक विधि इस प्रकार स्थापित करें:
- एसपीएमई विश्लेषण स्थितियों के लिए, पहले उपयोग से पहले एसपीएमई फाइबर को कंडीशन करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें: फाइबर प्री-कंडीशन (5 मिनट के लिए 260 डिग्री सेल्सियस), नमूना इनक्यूबेशन (2 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस), निष्कर्षण समय (15 मिनट), अवशोषण समय (2 मिनट), और फाइबर पोस्ट-कंडीशन (20 मिनट के लिए 260 डिग्री सेल्सियस)।
- निम्नलिखित जीसी शर्तों का उपयोग करें: कॉलम (एचपी 5-एमएस 30 मीटर x 0.25 मिमी; 0.25 माइक्रोन, इंजेक्टर तापमान (270 डिग्री सेल्सियस), प्रवाह दर (1 एमएल/न्यूनतम), इंजेक्शन मोड (स्प्लिटलेस), जीसी ओवन प्रोफाइल (2 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस; 4 डिग्री सेल्सियस/न्यूनतम से 170 डिग्री सेल्सियस; 20 डिग्री सेल्सियस/न्यूनतम से 300 डिग्री सेल्सियस), एमएसडी ट्रांसफर लाइन (280 डिग्री सेल्सियस) ।
नोट: नमूना प्रतिधारण समय स्थिरता के बीच सुधार करने के लिए विश्लेषणात्मक विधि प्रतिधारण समय बंद है)। - निम्नलिखित एमएसडी स्थितियों का उपयोग करें: सॉल्वेंट देरी (2.5 मिनट) और स्कैन रेंज (29 से 400 एएमयू)।
नोट: पिछले प्रोटोकॉल 4 में 10 से 400कीरेंज का इस्तेमाल किया गया था ।
- सुनिश्चित करें कि फाइबर कंडीशनिंग इकाई के लिए शुद्ध गैस की आपूर्ति चालू है।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि SPME विधानसभा सही ढंग से ऑटो पारखी में स्थापित है और यह ऑटो पारखी ट्रे, फाइबर कंडीशनिंग इकाई और जीसी इनलेट बंदरगाह के लिए गठबंधन किया है । गलत संरेखण के परिणामस्वरूप एसपीएमई फाइबर का नुकसान या विनाश हो सकता है।
4. विश्लेषण
- जीसी-एमएस ऑटो-पारखी ट्रे की पहली स्थिति में एक खाली हेडस्पेस शीशी (सिस्टम ब्लैंक के रूप में कार्य करने के लिए) रखें। ऑटो पारखी ट्रे की दूसरी पोजीशन में एनवायरमेंटल ब्लैंक रखें। ऑटो-सैंपल ट्रे के बाद की स्थितियों में विश्लेषण के लिए नमूने रखें।
- नमूना ट्रे के भीतर प्रत्येक नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक विश्लेषणात्मक अनुक्रम बनाएं।
- मासहंटर होम स्क्रीन में, सीक्वेंस | का चयन करें लोड अनुक्रम।
- उचित जानकारी डालने से सभी रिक्त स्थान और नमूनों के लिए अनुक्रम तालिका को पूरा करें। पूरा अनुक्रम तालिका को सहेजें।
नोट: अनुक्रम तालिका के लिए सटीक जानकारी तालिका के लिए स्वरूपण प्रयोगशालाओं पर निर्भर किया जाएगा । न्यूनतम जानकारी में सामान्य रूप से नमूना प्रकार, नमूना नाम, शीशी स्थान और संख्या, विश्लेषणात्मक विधि और डेटा फ़ाइल स्थान और नाम (डेटा फ़ाइल नाम का आवंटन जो नमूना नाम एड्स भविष्य डेटा प्रसंस्करण से मेल खाता है) शामिल होगा। विश्लेषण के दौरान अनुक्रम में अतिरिक्त नमूने जोड़े जा सकते हैं।
- अनुक्रम | का चयन करके अनुक्रम चलाएं रन अनुक्रम।
- विश्लेषण के बाद जितनी जल्दी हो सके फ्रीजर के लिए नमूने वापसी।
नोट: नमूनों का पुनर्विश्लेषण करना संभव हो सकता है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रारंभिक विश्लेषण के दौरान कुछ अस्थिर घटकों को पूरी तरह से निकाला गया हो सकता है और कुछ यौगिकों में थर्मल और बैक्टीरियल अपघटन 40 डिग्री सेल्सियस पर हो सकता है, इस प्रकार परिणामस्वरूप क्रोमोग्राम मूल सुगंध-अंकन का अच्छी तरह से प्रतिनिधि नहीं हो सकता है।
5. डेटा विश्लेषण
नोट: प्रारंभिक डेटा विश्लेषण में केमस्टेशन सॉफ्टवेयर और एनआईएसटी (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ स्टैंडर्ड्स एंड टेक्नोलॉजी) मास स्पेक्ट्रल डेटाबेस, संस्करण एमएसडी एफ 01.01.2317 का उपयोग करके चोटियों की अस्थायी पहचान के साथ प्रतिधारण समय और पीक क्षेत्र डेटा प्राप्त करने के लिए क्रोमेग्राम का एकीकरण शामिल है। डेटा विश्लेषण या तो मैन्युअल रूप से या अर्ध-स्वचालित विधि के माध्यम से किया जा सकता है। यदि अर्ध-स्वचालित विधि का उपयोग किया जाता है तो कभी-कभी अस्थायी पहचानों को सत्यापित करने के लिए मैनुअल डेटा विश्लेषण की डिग्री लेना फायदेमंद होता है।
- बाएं हाथ के नेविगेशन बार में उपयुक्त फ़ाइल पर क्लिक करके डेटा फ़ाइल खोलें। कुल आयन क्रोमेटोग्राम (TIC) डेटा विश्लेषण स्क्रीन की शीर्ष खिड़की में प्रदर्शित किया जाएगा।
- आरटीई इंटीग्रेटर का उपयोग करके टिक को एकीकृत करने के लिए, क्रोमटोग्राम | का चयन करें एकीकृत।
- एकीकरण मापदंडों को समायोजित करें ताकि 3 x बेसलाइन शोर से अधिक चोटियों को एकीकृत किया जा सके। क्रोमेटोग्राम | का चयन करें एमएस सिग्नल इंटीग्रेशन पैरामीटर्स। आउटपुट बॉक्स में न्यूनतम पीक क्षेत्र को उचित रूप से समायोजित करें (1.0 हमारे उदाहरणों में स्वीकार्य परिणाम पैदा करता है)।
- चोटियों की पहचान करने और एक सारांश रिपोर्ट उत्पन्न करने के लिए, निर्यात रिपोर्ट का चयन करें | पुस्तकालय खोज परिणाम XLS को रिपोर्ट।
नोट: स्पेक्ट्रल पुस्तकालयों को प्रदर्शित किए जाने वाले पुस्तकालय मैचों की संख्या के साथ एक साथ खोजा जाना चाहिए, पुस्तकालय खोज शुरू करने से पहले सॉफ्टवेयर के भीतर पूर्व निर्धारित करने की आवश्यकता है। - परिणामस्वरूप स्प्रेडशीट रिपोर्ट में प्रत्येक चोटी के लिए एकीकरण डेटा और पहचान प्रदान करने के लिए एक अस्थायी स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी मैच शामिल है। आमतौर पर, पुस्तकालय की गुणवत्ता/पुस्तकालय मैच >८० के लिए अनंतिम पहचान स्वीकार किया जाना चाहिए । स्प्रेडशीट को बचाएं।
- TIC से सीधे एक चोटी की पहचान करें।
- ब्याज की चोटी का चयन करें।
- यदि चोटी छोटी है, तो बाएं हाथ के माउस बटन को पकड़कर चोटी के चारों ओर एक बॉक्स खींचकर ज़ूम इन करें, बॉक्स को चोटी पर फैलाएं और रिलीज करें।
- कर्सर लाइन रखें ताकि यह चोटी के उच्चतम बिंदु पर हो (या बस के बाद)।
- डबल क्लिक करें दाहिने हाथ माउस बटन और चोटी के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम डेटा विश्लेषण स्क्रीन के निचले खिड़की में दिखाई देगा।
- स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी को सर्च करने के लिए स्पेक्ट्रल विंडो में कहीं भी कर्सर को मूव करें और राइट हैंड माउस बटन को डबल क्लिक करें। पुस्तकालय खोज परिणाम एक नई विंडो में दिखाई देंगे।
- ब्याज के स्पेक्ट्रम से पृष्ठभूमि शोर को हटाने के लिए, पहले सवाल में चोटी पर दाहिने हाथ माउस बटन पर डबल क्लिक करें। फिर ब्याज की चोटी के सामने तुरंत कोई चोटियों के साथ एक क्षेत्र में दाहिने हाथ माउस बटन पर डबल क्लिक करें। क्रोमेटोग्राम | का चयन करें घटाना स्पेक्ट्रा। घटाया स्पेक्ट्रम डेटा विश्लेषण स्क्रीन की निचली खिड़की में प्रदर्शित करेगा और विंडो हेडर में स्कैन डेटा के बगल में '(-) ' प्रदर्शित करेगा।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल के बाद, हमने अंतरिम रूप से 14 एनो-जननांग सुगंध-चिह्नों के विश्लेषण से कुल 32 अस्थिर रासायनिक यौगिकों की पहचान की, जो लाल-रफ्ड लेमर(वेरेसिया वेरगेटा रूब्रा)द्वारा फिल्टर पेपर पर अनायास जारी किए गए हैं और सिग्नलर12की विशेषताओं के साथ गंध प्रोफाइल की तुलना में। स्वाभाविक रूप से होने वाले अस्थिर यौगिकों, जैसे हाइड्रोकार्बन, टर्पेन, टर्पेन अल्कोहल और कीटोन्स, इन प्रोफाइल के भीतर मौजूद थे और इसमें ऐसे यौगिक शामिल थे जो पहले अन्य जानवरों की प्रजातियों में फिटनेस के लिए सेक्स फेरोमोन और संकेतों के रूप में कार्य करने के लिए पाए गए थे। जिन यौगिकों की अंतरिम रूप से पहचान की गई है, वे तालिका 1में सूचीबद्ध हैं । प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम (एक नियंत्रण से 1 और एक लेमूर खुशबू-निशान से 1) चित्र 1में दिखाया गया है । घटकों की संख्या और सापेक्ष बहुतायत विभिन्न अध्ययन विषयों में नमूना से नमूना करने के लिए विविध । हालांकि सभी नमूनों में छह यौगिक (बेंजाल्डिहाइड, 2-एथिल-1-हेक्सानोल, पी-क्रेसोल, सीआईएस-पी-मेंथा-2,8-डिएन-1-ओलिंपिक्स, 2-पिनेन-4-वन, पेंटाडेकेन) मौजूद थे।
इस अध्ययन के परिणामों ने सुझाव दिया कि लाल-रफ्ड लेमर सेक्स और महिला आयु के बारे में जानकारी देने के लिए खुशबू-अंकन का उपयोग करते हैं, जिसमें एनो-जननांग अंकन सामाजिक-यौन संचार में भूमिका निभा रहा है ।
इस प्रोटोकॉल के उपयोग के बाद एक और प्रतिनिधि परिणाम महिला जैतून लंगूरों(Papio anubis)(Vagliio एट अल अप्रकाशित डेटा) द्वारा प्रजनन विज्ञापन का हमारा अध्ययन था । हमने 385 महिला लंगूर योनि गंध नमूनों के विश्लेषण से कुल 74 अस्थिर यौगिकों की पहचान की। इन यौगिकों में स्वाभाविक रूप से होने वाले गंध अस्थिर यौगिकों जैसे कीटोन्स, अल्कोहल, एल्डिहाइड, टर्पेन, अस्थिर फैटी एसिड और हाइड्रोकार्बन की एक श्रृंखला शामिल थी। उपजाऊ और गैर-उपजाऊ अवधि से खाली नियंत्रण और मादा लंगूर योनि गंध के नमूनों की तुलना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट क्रोमेटोग्राम चित्र 2में दिखाए जाते हैं। हमने योनि गंध प्रोफाइल और महिला लंगूरों की यौन ग्रहणशीलता के बीच संबंधों की जांच की। हमारे परिणामों से पता चला है कि योनि गंध की कुल राशि प्रजनन क्षमता के साथ अलग है सुझाव है कि गंध महिला लंगूर प्रजनन क्षमता संकेत में एक भूमिका निभा सकता है । हम भी समूह प्रकार के बीच योनि गंध में अंतर पाया, लेकिन हम समूह संरचना, महिला आयु और समता के प्रभाव को अलग नहीं कर सका ।
चित्रा 1। उदाहरण क्रोमेटोग्राम; (शीर्ष क्रोमेटोग्राम -'कंट्रोल') नियंत्रण नमूना, संदूषकों को दिखाता है; (नीचे क्रोमोटोग्राम -'लेमूर खुशबू-मार्क') एक वयस्क मादा लाल-रफ्ड लेमूर एनो-जननांग गंध स्राव, संदूषकों और सार्थक जैविक यौगिकों को दिखाता है। लाल तीर छह सार्थक जैविक यौगिकों को इंगित करते हैं जो सभी नमूनों में पाए गए थे: (क) बेंजाल्डिहाइड; (ख) 2-एथिल-1हेक्सानॉल; (ग) पी-क्रेसोल; (घ) सीआईएस-पी-मेंथा-2,8-dien-1-ol; (ङ) 2-पिनेन-4-एक; (च) पेंटाडेकेन । इस आंकड़े को जांडा एट अल12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। उदाहरण क्रोमोग्राम से (शीर्ष क्रोमेटोग्राम -'नियंत्रण') नियंत्रण नमूना, प्रदूषक दिखाता है; (मध्य क्रोमाटोग्राम -'लंगूर गैर-उपजाऊ गंध') मादा जैतून लंगूर, गैर-उपजाऊ अवधि से योनि गंध नमूना; और (नीचे क्रोमेटोग्राम -'लंगूर उपजाऊ गंध') मादा जैतून लंगूर, उपजाऊ अवधि से योनि गंध नमूना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| प्रतिधारण समय (न्यूनतम) | अंतरिम कंपाउंड आईडी | आणविक वजन |
| 3.906 | हेक्सानल | 100 |
| 6.057 | 5-मिथाइल-3-हेक्सानोन | 114 |
| 7.413 | अल्फा-पाइने | 136 |
| 8.077 | 1-आइसोप्रोपिल-4-मेथिलेलेनबाइक्लो [3.1.0] हेक्स-2-वन | 134 |
| 8.268 | बेंजाल्डिहाइड | 106 |
| 8.623 | 3,7,7-ट्राइमेथाइल-1,3,5-साइक्लोहेप्टाट्राइन | 134 |
| 9.096 | फिनोल | 94 |
| 9.269 | 6-मेथॉक्सी-5-हेप्टन-2-एक | 126 |
| 10.72 | 2-एथिल-1-हेक्सानॉल | 130 |
| 12.362 | पी-क्रेसोल | 108 |
| 12.553 | सीआईएस-वर्बेनोल | 152 |
| 13.385 | सीआईएस-पी-मेंथा-2,8-dien-1-राजभाषा | 152 |
| 14.104 | 1,7,7-Trimethylbicyclo [2.2.1] हेप्टा-2-एक | 152 |
| 14.536 | एल-पिनोकर्वियोल | 152 |
| 14.791 | ट्रांस-वर्बेनोल | 152 |
| 15.605 | पी-एथिल-फिनोल | 122 |
| 15.928 | टर्पाइनन-4-राजभाषा | 154 |
| 16.415 | अल्फा-टेरपिनोल | 154 |
| 16.615 | माइटेनॉल | 152 |
| 17.047 | 2-पिनेन-4-एक | 150 |
| 18.252 | कार्वोन | 150 |
| 19.217 | पी-मेंथा-1,8-dien-3-एक | 150 |
| 23.283 | 4,7,7-Trimethylbicyclo [4.1.0] हेप्ट-3-ene-2-one | 150 |
| 23.443 | टेट्राडेकेन | 198 |
| 25.094 | गेरानिलासेटटोन | 194 |
| 25.899 | आइसोमिथाइलियोनोन | 206 |
| 26.513 | पेंटाडेकेन | 212 |
| 30.871 | 2,6,10-ट्राइमेथाइलपेन्टाडेकेन | 254 |
| 32.208 | हेप्टाडेकेन | 240 |
| 32.372 | 2,6,10-त्रिमेथाइलहेक्साडेकेन | 268 |
| 34.446 | एन-टेट्राकोसाने | 338 |
| 34.591 | 2,6,10,14-टेट्रामेथाइलहेक्साडेकेन | 282 |
तालिका 1. महिला लाल-रफ्ड लेमूर एनो-जननांग गंध स्राव से फिल्टर पेपर नमूनों में मौजूद अस्थिर यौगिकों ने केमस्टेशन सॉफ्टवेयर और एनआईएस्ट मास स्पेक्ट्रल डेटाबेस, संस्करण एमएसडी एफ 01.01.2317 का उपयोग करके अंतरिम रूप से पहचान की। इस तालिका को जांडा एट अलसेसंशोधित किया गया है ।
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Discussion
नियंत्रण नमूनों का उपयोग, नमूना संग्रह और सिस्टम रिक्त स्थान के समय बनाए गए दोनों पर्यावरणीय नियंत्रण, सुगंध-चिह्न नमूनों की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हैं। नमूना पर्यावरण या वाद्य प्रणाली के लिए जिम्मेदार किसी भी चोटियों को खुशबू-मार्क नमूनों से बाहर रखने की आवश्यकता है ताकि किसी भी व्याख्या में केवल रुचि की चोटियों को शामिल किया जा सके। ये नियंत्रण इंस्ट्रूमेंटेशन के 'स्वास्थ्य' का आकलन और निगरानी करने में भी भूमिका निभा सकते हैं।
प्रोटोकॉल से पहले और प्रत्येक निष्कर्षण के बाद फाइबर हालत के लिए कदम भी शामिल है । यह एक ऑटो-पारखी के उपयोग से आसान बना दिया जाता है और यह सुनिश्चित करता है कि नमूना से नमूना तक कोई क्रॉस संदूषण नहीं है।
कार्यप्रणाली की मुख्य सीमा स्वयं नमूनों से संबंधित है। संग्रह के बाद, यह महत्वपूर्ण है कि उन्हें संग्रहीत किया जाए और उचित रूप से ले जाया जाए। विशिष्ट रुचि के घटक अस्थिर हैं, और इन्हें आसानी से खो दिया जा सकता है, या उनकी सांद्रता बदल सकती है। वर्तमान में नमूनों को संग्रहीत किया जाता है और जमे हुए ले जाया जाता है, आमतौर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर। नतीजतन इन नमूनों के भंडारण और परिवहन में एक महत्वपूर्ण लागत शामिल है । विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला के लिए नमूनों के परिवहन में देरी इन लागतों में और वृद्धि होगी और संभवतः खुशबू से प्राप्त परिणामों को प्रभावित कर सकता है अंक । नमूनों से प्राप्त विश्लेषणात्मक परिणामों पर समय और भंडारण के प्रभाव को समझने के लिए आगे अनुसंधान की आवश्यकता है। चूंकि विशेष महत्व के घटक सुगंध-अंकों के अधिक अस्थिर घटक हैं, इसलिए यह संभव है कि इन घटकों के स्तर नमूना संग्रह के बाद बदल सकते हैं। कुछ नमूना प्रकारों के भीतर संभावित बैक्टीरियल प्रभावों पर भी विचार करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, मूत्र के नमूनों के अल्कोहल परीक्षण में, मूत्र में मौजूद बैक्टीरिया शराब का उत्पादन कर सकते हैं और इसलिए अल्कोहल के स्तर को बढ़ा सकते हैं।
वर्तमान पद्धति पहले उल्लिखित सभी आवश्यकताओं को पूरा करती है। यह अच्छी गुणवत्ता के परिणाम प्रदान करता है जिसमें से खुशबू के अंकों की संरचना के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त की जा रही है । हालांकि, विश्लेषण एक प्रयोगशाला आधारित तकनीक है जो प्रयोगशाला में प्रस्तुत किए जा रहे नमूनों पर निर्भर है। इस सीमा का एक संभावित समाधान पोर्टेबल जीसी-एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग के माध्यम से होगा, ऐसे उपकरण जिन्हें उस क्षेत्र में ले जाया जा सकता है जहां नमूने लिए जा रहे हैं । इस दृष्टिकोण की दुकान और परिवहन के नमूनों की जरूरत को कम करने और खुशबू के वास्तविक समय विश्लेषण-संभावित अंक के सबसे अस्थिर घटकों के बारे में अधिक से अधिक जानकारी प्रदान करने के निशान सक्षम होगा । कई पोर्टेबल जीसी-एमएस उपकरण उपलब्ध हैं। वे प्रयोगशाला आधारित इंस्ट्रूमेंटेशन में पाए जाने वाले विभिन्न तकनीक का उपयोग करते हैं, लेकिन तुलनीय परिणाम प्रदान करना चाहिए। एचएस-एसपीएमई एक्सट्रैक्लाइज तकनीक का इस्तेमाल अभी भी लागू है। हालांकि, पोर्टेबल होने के परिणामस्वरूप, उपकरण स्वचालित नमूना परिचय का विकल्प प्रदान नहीं करते हैं; फिर भी, यदि नमूनों का विश्लेषण किया जाता है जैसे ही वे एकत्र किए जाते हैं, तो मैनुअल इंजेक्शन के लिए दैनिक नमूना संख्या प्रबंधनीय होने की संभावना है। इसके अलावा, क्षेत्र निष्कर्षण के मामले में, देखभाल की जानी चाहिए कि एसपीएमई फाइबर उपयोग से पहले पर्यावरणीय रसायनों को जाल में नहीं आता है। वर्तमान में उपलब्ध उपकरणों बैटरी कुल पोर्टेबिलिटी को सक्षम करने के लिए संचालित कर रहे हैं, लेकिन बिजली की आपूर्ति के कुछ फार्म (यहां तक कि एक छोटे जनरेटर) के प्रावधान के साथ, इन उपकरणों समय की लंबी अवधि के लिए संचालित किया जा सकता है । उनके स्वभाव से इन उपकरणों को अक्सर न्यूनतम प्रशिक्षण और ज्ञान की आवश्यकता के साथ, संचालित करने के लिए सरल होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसका मतलब यह है कि उच्च प्रशिक्षित ऑपरेटरों के लिए उपकरण के साथ तैनात किया जाना आवश्यक नहीं हो सकता है और वे नमूने इकट्ठा करने वालों द्वारा संचालित किया जा सकता है । विश्लेषणात्मक परिणामों की विस्तृत व्याख्या दूर से या जब साधन आधार पर लौटता है प्राप्त किया जा सकता है ।
SPME फाइबर का उपयोग कर तरीकों के साथ एक और प्रमुख सीमा यह है कि नमूनों में बहुतायत में मौजूद केवल रासायनिक यौगिकों का विश्लेषण करना संभव है। विशेष रूप से, नमूनों में रसायन की बहुत बड़ी मात्रा तब भी मौजूद होती है जब अणुओं की मात्रा एसपीएमई फाइबर का उपयोग करके विश्लेषण के लिए उपथरहोल्ड होती है। इसके अलावा, पशु खुशबू के निशान और अन्य पशु रासायनिक संकेतों द्वारा जारी गंध स्राव के संदर्भ में, व्यक्तिगत जानवरों को छोटी मात्रा में रासायनिक यौगिकों का उपयोग करने के लिए अंय जानवरों के साथ संवाद करते है और/ दूसरे शब्दों में, पशु नाक और एसपीएमई निष्कर्षण के विभिन्न प्रदर्शन इस नमूना तकनीक की सफलता के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।
वर्तमान पद्धति का भविष्य विकास थर्मल अवशोषण प्रणालियों के साथ उपयोग के लिए वैकल्पिक शर्बत सामग्री या शर्बत ट्यूबों के उपयोग की जांच के साथ नमूना संग्रह के आसपास आधारित हो सकता है। इस तरह के घटनाक्रम नमूना भंडारण और परिवहन की स्थिति में मदद करने के लिए किसी तरह जा सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम वीडियो के उत्पादन के लिए Rosalind फ्रैंकलिन विज्ञान केंद्र, Wolverhampton, और बेन मेंटल में रासायनिक विश्लेषण के साथ उनकी सहायता के लिए कीथ होल्डिंग शुक्रिया अदा करते हैं । हम प्रो ग्लोरियानो मोनेटी, डॉ जूसेपे पियरासिनी और फ्लोरेंस विश्वविद्यालय के मास स्पेक्ट्रोमेट्री सेंटर, फ्लोरेंस के सदस्यों और सीएनआर की एआरए लैब, फ्लोरेंस के प्रो लुका कैलामाई और डॉ मार्को मिशेलोज्जी के भी आभारी हैं, इस पद्धति को स्थापित करने में उनकी मदद के लिए। अनुसंधान परियोजनाओं में पांडुलिपि में वर्णित नमूना और विश्लेषण विधियों को दो मैरी Skłodowska-क्यूरी इंट्रा यूरोपीय फैलोशिप (अनुदान समझौते की IDS: 327083, 703611), ग्रेट ब्रिटेन के रहनुमा सोसायटी से एक छोटा सा अनुदान ('संवेदी समृद्ध रहनुमा') द्वारा समर्थित किया गया था, और एक छोटे से अनुसंधान अनुदान ('क्या शिकारी-संग्रहकर्ताओं गंध की एक विशेष भावना है?') ब्रिटिश अकादमी/लीवरहुमे ट्रस्ट से एसवी तक इस पद्धति को स्थापित करने के लिए आवश्यक प्रयोगशाला कार्य को विज्ञान और इंजीनियरिंग की वार्षिक वित्तपोषण प्रतियोगिता (Wolverhampton) के संकाय से एसवी के लिए धन भी प्राप्त हुआ ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | - | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | - | Excel |
| Spectral library | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
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