Summary
Мы разработали эффективную методологию отбора проб и анализа сигналов запаха, чтобы понять, как они могут быть использованы в общении с животными. В частности, мы используем твердофазную микроэкстракцию пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией для анализа летучих компонентов запахов животных и запаховых меток.
Abstract
Мы разработали эффективную методологию отбора проб и анализа сигналов запаха, используя твердофазную микроэкстракцию пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией, чтобы понять, как они могут быть использованы в общении животных. Этот метод позволяет проводить полуциплиматический анализ летучих компонентов секреций запаха, позволяя разделять и предварительно идентифицировать компоненты в образце с последующим анализом соотношений пиковой площади для поиска тенденций, которые могут означать соединения, которые могут быть вовлечены в передачу сигналов. Ключевыми сильными сторонами этого нынешнего подхода являются диапазон типов образцов, которые могут быть проанализированы; отсутствие необходимости в какой-либо сложной пробоподготовке или извлечении; возможность разделения и анализа компонентов смеси; идентификация обнаруженных компонентов; и способность предоставлять полу количественно-количественную и потенциально количественную информацию об обнаруженных компонентах. Основное ограничение методологии касается самих образцов. Поскольку компоненты, представляющие особый интерес, являются летучими, и они могут быть легко потеряны или их концентрации изменены, важно, чтобы образцы хранились и транспортировались надлежащим образом после их сбора. Это также означает, что условия хранения и транспортировки образцов являются относительно дорогостоящими. Этот метод может быть применен к различным образцам (включая мочу, кал, волосы и выделения запаха ароматических желез). Эти запахи состоят из сложных смесей, встречающихся в ряде матриц, и, таким образом, требуют использования методов для разделения отдельных компонентов и извлечения соединений, представляющих биологический интерес.
Introduction
Очень мало известно о химических изменениях, лежащих в основе обонятельных сигналов у животных1,в том же время из-за методологических проблем в регистрации и количественной оценке летучих химических профилей запахов2. Существует несколько потенциальных ловушек при работе с очень сложными химическими матрицами; к ним относятся при отборе проб и анализе запаха образцов3.
В Научном центре Розалинд Франклин Университета Вулверхэмптона мы проводим анализ запахов и запахов, чтобы понять, как они могут использоваться животными. Мы объединяем семиохимию с поведенческой экологией, эндокринологией и цитологией, чтобы улучшить наше понимание роли обонятельных сигналов в общении животных.
Мы разработали методологию, а затем проанализировали запахи и маркировку различных видов, включая нескольких нечеловеческих приматов (то есть коронованных лемуров, красно-взъерошенные лемуры, японские макаки, оливковые бабуины, шимпанзе) и других млекопитающих (то есть кошек, коров). Мы собрали и проанализировали различные образцы, включая мочу, фекалии, волосы и выделения запаха пахлочек. Эти запахи и запаховые метки состоят из сложных смесей соединений, и поэтому любая методология, используемая для их анализа, должна включать некоторую форму сепараторного метода. Как показано на рисунке, они также встречаются в ряде матриц, что обусловливает необходимость использования методов извлечения интересующих компонентов.
Предыдущие исследования Vaglio et al.4 и других авторов5 использовали динамическую экстракцию в пространстве над головой (DHS) с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (GC-MS), в то время как прямая экстракция растворителем6 и комплексная экстракция растворителем7 также использовались. В частности, динамический отбор проб в пространстве над головой включает очистку пространства над головой известным объемом инертного газа, который в конечном итоге удаляет все летучие соединения, за исключением тех, которые демонстрируют сильное сродство к матрице образца (например, полярные соединения в водных образцах).
Для текущей методологии мы приняли метод твердофазной микроэкстракции пространства над головой (HS-SPME) в сочетании с GC-MS. В частности, мы разработали и усовершенствовали методологию, уже используемую Vaglio et al. в своей предыдущей лаборатории GC-MS8,9,10.
Методы экстракции без растворителя очень эффективны для анализа небольших, высоколетучих соединений (которые в противном случае могут быть легко потеряны из образца), поскольку эти методы иммобилизуют соединения на стабильной твердофазной опоре. HS-SPME использует волокно, покрытое адсорбентным полимером, для захвата летучих соединений в пространстве образца или для извлечения растворенных соединений путем погружения в водную биологическую жидкость11. Полимерное покрытие не связывает соединения сильно, поэтому нагреванием в инжекционном порту ГК их можно удалить. Этот метод является более мощным, чем методы экстракции растворителем, а также более эффективным, чем DHS.
При нынешнем подходе образцы содержатся в стеклянных флаконах. Эти флаконы нагревают до температуры 40 °C для имитации температуры тела животного, чтобы способствовать тому, чтобы летучие компоненты аромата занимали пространство головы флакона. Волокно SPME, покрытое 65 мкм сорбентного материала полидиметилсилоксана/дивинилбензола (PDMS/DVB), подвергается воздействию среды пространства над головой, и летучие компоненты из образца адсорбируются на волокно. При нагревании волокна во входном порту GC-MS летучие компоненты десорбируются от волокна, а затем отделяются GC. Паттерны масс-спектральной фрагментации получены для каждого компонента с использованием MS. Сравнивая эти масс-спектры с масс-спектральными базами данных, можно предварительно определить компоненты ароматического знака. Благодаря использованию автоматического пробоотборщика мы можем последовательно анализировать несколько образцов партиями.
Учитывая, что каждый тип волокна SPME имеет различное сродство с полярными химическими веществами, волокно обычно выбирают в зависимости от полярности и/или молекулярной массы целевых химических соединений. Кроме того, условия ГК изменяются в зависимости от типа колонки ГК и характеристик целевых химических соединений.
Этот метод позволяет проводить полуциплиматический анализ летучих компонентов запаховой маркировки, позволяя разделять и предварительно идентифицировать компоненты в образце с последующим анализом коэффициентов пиковой площади для поиска тенденций, которые могли бы означать компоненты ароматовой маркировки, которые могут быть вовлечены в сигнализацию.
Ключевыми сильными сторонами этого нынешнего подхода являются:
- Диапазон типов образцов, которые могут быть проанализированы.
- Не требуется сложная пробоподготовка или экстракция.
- Возможность анализа летучих компонентов.
- Возможность разделения компонентов смеси.
- Чтобы иметь возможность идентифицировать обнаруженные компоненты.
- Способность предоставлять полу количественное и потенциально количественное представление об обнаруженных компонентах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сбор образцов
- Образцы запахов, которые являются одним из следующих:
- Собирать спонтанно высвобождаемые привычными субъектами исследования (например, приматами зоопарка) через ароматизаторы на стерильной фильтровальной бумаге (например, выделения запаха паховой железы) или непосредственно во флаконы (например, мочу).
- Собирайте, втирая стерильные ватные тампоны после тренировки, изучайте предметы с помощью обучения с положительным подкреплением.
- Собирают путем растирания стерильными ватными тампонами после сакдации испытуемых.
- Поместите образцы в стерильные прозрачные стеклянные флаконы с винтовой крышкой 10 мл и запечатайте завинчивающимися крышками с FTFE / силиконовыми перегородками. Сразу же храните их при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизненно важно использовать чистые средства индивидуальной защиты, такие как нитриловые перчатки; часто меняйте их; избегать прямого контакта кожи с образцами и флаконами. Предпочтительно использовать совершенно новые флаконы; однако, в случае использования флаконов, жизненно важно предварительно очистить флаконы, а затем использовать тот же протокол. - Берите экологические заготовки каждый раз, когда собираются ароматические метки. Например, собрать пробы (например, фильтровальную бумагу или тампон) и флакон в пространстве над головой, которые подвергаются воздействию окружающей среды во время отбора проб.
2. Пробоподготовка
- Подготовьте образцы в полевых условиях, разрезав лезвием приблизительно 10 мм квадрат из ароматизированной фильтровальной бумаги или головки тампона и поместив его во флакон с винтовым верхом.
- После того, как каждый образец был подготовлен, утилизируйте или очистите лезвие, используемое для разрезания среды для отбора проб, используя соответствующую антибактериальную салфетку и/или спирт, и тщательно высушите.
- Храните все образцы при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно при -20°C или иным образом как можно ниже в полевых условиях.
3. Подготовка к анализу
- Извлеките образцы из морозильной камеры и дайте естественным образом нагреться до комнатной температуры не менее 1 ч.
- Настройте аналитический метод на GC-MS следующим образом:
- Для условий анализа SPME следуйте указаниям производителя по кондиции волокон SPME перед первым использованием: предварительное условие волокна (260 °C в течение 5 мин), инкубация образца (40 °C в течение 2 мин), время экстракции (15 мин), время десорбции (2 мин) и состояние волокна после (260 °C в течение 20 мин).
- Используйте следующие условия ГК: колонна (HP5-MS 30 м x 0,25 мм; 0,25 мкм), температура инжектора (270 °C), расход (1 мл/мин), режим впрыска (без разделения), профиль печи GC (45 °C в течение 2 мин; 4 °C/мин до 170 °C; от 20 °C/мин до 300 °C), линия передачи MSD (280 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения согласованности времени удержания между образцами аналитический метод блокирует время хранения). - Используйте следующие условия MSD: задержка растворителя (2,5 мин) и диапазон сканирования (от 29 до 400 аму).
ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон от 10 до 400 использовался в предыдущих протоколах4.
- Убедитесь, что подача продувочного газа в блок кондиционирования волокна включена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы сборка SPME была правильно установлена в автопробоотборнике и чтобы она была выровнена с лотками автопроблонксера, блоком кондиционирования волокна и входным портом GC. Неправильное выравнивание может привести к повреждению или разрушению волокна SPME.
4. Анализ
- Поместите пустой флакон с пространством над головой (чтобы действовать как системный бланк) в первое положение лотка автопроблемы GC-MS. Поместите заготовку окружающей среды во второе положение лотка автопроблемы. Поместите образцы для анализа в последующие положения лотка для автоматического отбора проб.
- Создайте аналитическую последовательность для анализа каждого образца в лотке для образцов.
- На главном экране MassHunter выберите Sequence | Последовательность загрузки.
- Заполните таблицу последовательностей для всех заготовок и образцов, вставив соответствующую информацию. Сохраните заполненную таблицу последовательностей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точная информация для таблицы последовательностей будет зависеть от форматирования таблицы лабораториями. Минимальная информация обычно включает тип образца, имя образца, местоположение и номер флакона, аналитический метод и местоположение и имя файла данных (выделение имени файла данных, соответствующего имени образца, облегчает будущую обработку данных). Дополнительные образцы могут быть добавлены к последовательности во время анализа.
- Запустите последовательность, выбрав Sequence | Последовательность выполнения.
- После анализа верните образцы в морозильную камеру как можно скорее.
ПРИМЕЧАНИЕ: возможно повторное анализ образцов, но следует отметить, что некоторые летучие компоненты, возможно, были полностью извлечены во время первоначального анализа, а некоторые соединения, возможно, подверглись термическому и бактериальному разложению при 40 °C, таким образом, полученная хроматограмма может быть не полностью репрезентативной для исходной ароматического маркировки.
5. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный анализ данных включает интеграцию хроматограмм для получения данных о времени удержания и площади пиков вместе с предварительной идентификацией пиков с использованием программного обеспечения ChemStation и баз данных масс-спектральных баз данных NIST (Национальный институт стандартов и технологий), версия MSD F.01.01.2317. Анализ данных может проводиться как вручную, так и полуавтоматическим методом. Если используется полуавтоматический метод, то иногда полезно провести ряд ручного анализа данных для проверки предварительных идентификаций.
- Откройте файл данных, щелкнув по соответствующему файлу на левой навигационной панели. Общая ионная хроматограмма (TIC) будет отображаться в верхнем окне экрана анализа данных.
- Чтобы интегрировать TIC с помощью интегратора RTE, выберите Хроматограмма | Интеграция.
- Настройте параметры интеграции таким образом, чтобы пики, превышающие 3 x базового шума, были интегрированы. Выберите | хроматограммы Параметры интеграции сигналов MS. В выходном поле отрегулируйте минимальную пиковую область соответствующим образом (1.0 дает приемлемые результаты в наших примерах).
- Чтобы определить пиковые пики и создать сводный отчет, выберите Экспорт отчетов | Отчет о результатах поиска библиотеки в XLS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральные библиотеки, которые будут искаться вместе с количеством отображаемых совпадений библиотек, должны быть предварительно установлены в программном обеспечении, прежде чем можно будет выполнить поиск библиотеки. - Полученный отчет электронной таблицы содержит данные интеграции для каждого пика и предварительное сопоставление спектральной библиотеки для назначения идентификатора. Как правило, соответствие качества библиотеки и библиотеки должно составлять >80, чтобы принять предварительную идентификацию. Сохраните электронную таблицу.
- Определите пик непосредственно из TIC.
- Выберите пик интереса.
- Если пик маленький, увеличьте масштаб, нарисовав поле вокруг пика, удерживая левую кнопку мыши вниз, растяните поле над пиком и отпустите.
- Поместите курсор так, чтобы она находились в самой высокой точке пика (или сразу после).
- Дважды щелкните правой кнопкой мыши, и масс-спектр для пика появится в нижнем окне экрана анализа данных.
- Чтобы выполнить поиск в спектральной библиотеке, переместите курсор в любое место в спектральном окне и дважды щелкните правой кнопкой мыши. Результаты поиска библиотеки появятся в новом окне.
- Чтобы удалить фоновый шум из спектра интереса, сначала дважды щелкните правой кнопкой мыши на рассматриваемом пике. Затем дважды щелкните правой кнопкой мыши в области без пиков непосредственно перед пиком интереса. Выберите | хроматограммы Вычтите спектры. Вычитанный спектр будет отображаться в нижнем окне экрана анализа данных и будет отображаться '(-)' рядом с данными SCAN в заголовке окна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя этому протоколу, мы предварительно идентифицировали в общей сложности 32 летучих химических соединения из анализа 14 аногелитических запаховых меток, спонтанно высвобождаемых на фильтровальной бумаге красно-взъерошенными лемурами (Varecia variegata rubra) и сравнили профили запаха с особенностями сигнальщика12. Встречающиеся в природе летучие соединения, такие как углеводороды, терпены, терпеновые спирты и кетоны, присутствовали в этих профилях и включали соединения, которые, как было ранее установлено, действуют как половые феромоны и сигналы к приспособленности у других видов животных. Соединения, которые были предварительно идентифицированы, перечислены в таблице 1. Репрезентативные хроматограммы (1 из контрольной и 1 из аромата лемура) показаны на фиг.1. Количество и относительное изобилие компонентов варьировалось от образца к образцу у разных субъектов исследования. Однако во всех образцах присутствовали шесть соединений (бензальдегид, 2-этил-1-гексанол, р-крезол, цис-п-мента-2,8-диен-1-ол, 2-пинен-4-он, пентадекан).
Результаты этого исследования показали, что красные лемуры используют запаховую маркировку для передачи информации о сексе и женском возрасте, причем аногенитальная маркировка играет роль в социально-сексуальной коммуникации.
Другим репрезентативным результатом после использования этого протокола было наше исследование рекламы фертильности самок оливковых бабуинов(Papio anubis)(Vaglio et al. неопубликованные данные). Мы идентифицировали в общей сложности 74 летучих соединения из анализа 385 образцов вагинального запаха женского бабуина. Эти соединения включали ряд встречающихся в природе пахучих летучих соединений, таких как кетоны, спирты, альдегиды, терпены, летучие жирные кислоты и углеводороды. Типичные хроматограммы, используемые для сравнения образцов вагинального запаха пустого контроля и самки бабуина из фертильного и неплодильного периодов, показаны на рисунке 2. Мы изучили взаимосвязь между профилями вагинального запаха и сексуальной восприимчивостью самок бабуинов. Наши результаты показали, что общее количество вагинального запаха отличается в зависимости от фертильности, предполагая, что запах может играть роль в сигнализации плодовитости самок бабуинов. Мы также обнаружили различия во вагинальном запахе между типами групп, но мы не могли различить эффекты состава группы, женского возраста и паритета.
Рисунок 1. Примеры хроматограмм; (верхняя хроматограмма - "контроль") контрольный образец, показывающий загрязняющие вещества; (нижняя хроматограмма - 'запах-метка лемура') у одной взрослой самки красно-встряхивания лемуров ано-генитального запаха, показывающий загрязняющие вещества и значимые биологические соединения. Красными стрелками обозначены шесть значимых биологических соединений, которые были обнаружены во всех образцах: а) бензальдегид; b) 2-этил-1гексанол; c) п-крезол; d) цис-п-мента-2,8-диен-1-ол; e) 2-пинен-4-один; f) пентадекан. Эта цифра была изменена по сравнению с Janda et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Пример хроматограммы из (верхняя хроматограмма -'контроль') контрольного образца, показывающего загрязняющие вещества; (средняя хроматограмма - 'бабуин неплодильный запах') самка оливкового бабуина, образец вагинального запаха из неплодильного периода; и (нижняя хроматограмма - "плодородный запах бабуина") самка оливкового бабуина, образец вагинального запаха из фертильного периода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Время удержания (мин. | Предварительный идентификатор соединения | Молекулярная масса |
| 3.906 | Гексанал | 100 |
| 6.057 | 5-метил-3-гексанон | 114 |
| 7.413 | Альфа-пинен | 136 |
| 8.077 | 1-изопропил-4-метиленбицикло[3.1.0]гекс-2-он | 134 |
| 8.268 | Бензальдегид | 106 |
| 8.623 | 3,7,7-триметил-1,3,5-циклогептатриен | 134 |
| 9.096 | фенол | 94 |
| 9.269 | 6-метокси-5-гептен-2-он | 126 |
| 10.72 | 2-этил-1-гексанол | 130 |
| 12.362 | п-Крезол | 108 |
| 12.553 | цис-Вербенол | 152 |
| 13.385 | цис-п-Мента-2,8-диен-1-ол | 152 |
| 14.104 | 1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепта-2-он | 152 |
| 14.536 | L-пинокарвеол | 152 |
| 14.791 | транс-Вербенол | 152 |
| 15.605 | п-этилфенол | 122 |
| 15.928 | Терпинен-4-ол | 154 |
| 16.415 | Альфа-терпинеол | 154 |
| 16.615 | Миртенол | 152 |
| 17.047 | 2-Пинен-4-он | 150 |
| 18.252 | Карвоне | 150 |
| 19.217 | п-Мента-1,8-диен-3-он | 150 |
| 23.283 | 4,7,7-триметилбицикло[4.1.0]гепт-3-ен-2-он | 150 |
| 23.443 | тетрадекан | 198 |
| 25.094 | Геранилацетон | 194 |
| 25.899 | Изометилионон | 206 |
| 26.513 | Пентадекан | 212 |
| 30.871 | 2,6,10-триметилпентадекан | 254 |
| 32.208 | Гептадекан | 240 |
| 32.372 | 2,6,10-триметилгексадекан | 268 |
| 34.446 | н-тетракозан | 338 |
| 34.591 | 2,6,10,14-тетраметилгексадекан | 282 |
Таблица 1. Летучие соединения, присутствующие в образцах фильтровальной бумаги из женских красно-взъероженных ано-генитальных выделений запаха лемуров, идентифицированных предварительно с использованием программного обеспечения ChemStation и баз данных масс-спектральных данных NIST, версия MSD F.01.01.2317. Эта таблица была изменена по сравнению с Janda et al.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование контрольных образцов, как экологических контрольных образцов, созданных во время отбора проб, так и системных заготовок, имеет решающее значение для интерпретации образцов с запаховым метками. Любые пики, приписываемые среде выборки или инструментальной системе, должны быть исключены из образцов ароматических меток, с тем чтобы в любую интерпретацию включались только пики, представляющие интерес. Эти средства контроля также могут играть роль в оценке и мониторинге «работоспособности» приборов.
Протокол включает в себя шаги по кондиционированию волокна до и после каждой экстракции. Это упрощается благодаря использованию автоматического пробоотборника и гарантирует, что от образца к образцу не будет перекрестного загрязнения.
Основное ограничение методологии касается самих образцов. После сбора важно, чтобы они хранились и транспортировались надлежащим образом. Компоненты, представляющие особый интерес, являются летучими, и они могут быть легко потеряны или их концентрации изменены. В настоящее время образцы хранятся и транспортируются замороженными, как правило, при -20°C. В результате возникают значительные затраты, связанные с хранением и транспортировкой этих образцов. Задержки с транспортировкой образцов в лабораторию для анализа еще больше увеличат эти расходы и потенциально могут повлиять на результаты, полученные от запаховых меток. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять влияние времени и хранения на аналитические результаты, полученные из образцов. Поскольку компоненты, имеющие особое значение, являются более летучими компонентами ароматических меток, возможно, что уровни этих компонентов могут изменяться после сбора проб. Возможно, также потребуется рассмотреть потенциальные бактериальные эффекты в некоторых типах образцов. Например, при тестировании образцов мочи на алкоголь бактерии, присутствующие в моче, могут продуцировать алкоголь и, следовательно, повышать уровень обнаруженного алкоголя.
Нынешняя методология отвечает всем изложенным выше требованиям. Он обеспечивает качественные результаты, из которых получается дополнительная информация о составе ароматических меток. Тем не менее, анализ является лабораторным методом, который зависит от образцов, представляемых в лабораторию. Одним из возможных решений этой проблемы было бы использование портативных приборов GC-MS, инструментов, которые можно было бы взять в поле, где берутся пробы. Такой подход уменьшил бы необходимость хранения и транспортировки образцов и позволил бы проводить анализ запаховых меток в реальном времени, что потенциально позволило бы получить более подробную информацию о наиболее летучих компонентах маркировки. Доступно несколько портативных приборов GC-MS. Они используют технологии, отличные от тех, которые можно найти в лабораторных приборах, но должны обеспечить сопоставимые результаты. Использование метода экстракции HS-SPME по-прежнему применимо. Однако в результате переносимости приборы не предлагают возможности автоматического введения образцов; тем не менее, если образцы анализируются сразу после их сбора, ежедневные номера образцов, вероятно, будут управляемы для ручной инъекции. Кроме того, в случае полевой экстракции следует позаботиться о том, чтобы волокно SPME не улавливало химические вещества окружающей среды перед использованием. Доступные в настоящее время приборы питаются от батарей, что обеспечивает полную портативность, но с предоставлением некоторой формы питания (даже небольшого генератора) эти приборы могут эксплуатироваться в течение более длительных периодов времени. Эти инструменты по своей природе часто спроектированы так, чтобы быть простыми в эксплуатации, с минимальной подготовкой и необходимыми знаниями. Это означает, что может отяготовиться от необходимости в развертывании высококвалифицированных операторов с прибором и что они могут эксплуатироваться теми, кто собирает образцы. Детальная интерпретация аналитических результатов может быть достигнута дистанционно или при возвращении прибора на базу.
Другим серьезным ограничением методов с использованием волокон SPME является то, что можно анализировать только химические соединения, которые в изобилии существуют в образцах. В частности, в образцах существует гораздо большее количество химического вещества, даже если количество молекул является подпороговым для анализа с использованием волокон SPME. Кроме того, в контексте секреции запаха, выделяемой запахами животных и другими химическими сигналами животных, отдельные животные, как правило, используют химические соединения в небольших количествах для связи с другими животными и / или обнаружения обонятельных сигналов от материалов. Другими словами, различные характеристики носа животных и экстракции SPME могут представлять собой серьезную проблему для успеха этого метода отбора проб.
Будущая разработка нынешней методологии может основываться на сборе проб с изучением использования альтернативных сорбентных материалов или сорбентных трубок для использования с системами термической десорбции. Такие разработки могут каким-то образом помочь условиям хранения и транспортировки образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Keith Holding за его помощь в химическом анализе в Научном центре Розалинд Франклин, Вулверхэмптон, и Бена Мантла за производство видео. Мы также благодарны профессору Глориано Монети, доктору Джузеппе Пьераччини и членам Центра масс-спектрометрии Университета Флоренции во Флоренции, а также профессору Луке Каламаю и доктору Марко Микелоцци из лаборатории ARCA CNR, Флоренция, за их помощь в создании этой методологии. Исследовательские проекты, которые включали методы отбора проб и анализа, описанные в рукописи, были поддержаны двумя внутриевропейскими стипендиями Марии Склодовской-Кюри (идентификаторы грантового соглашения: 327083, 703611), небольшим грантом(«Сенсорно обогащенный примат»)от Общества приматов Великобритании и небольшим исследовательским грантом(«Имеют ли охотники-собиратели особое обоняние?»)от Британской академии / The Leverhulme Trust для S.V. Лабораторные работы, необходимые для создания этой методологии, также получили финансирование от Ежегодного конкурса финансирования факультета науки и техники (Вулверхэмптон) для S.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | - | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | - | Excel |
| Spectral library | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
