Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Karakterisering av In Vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved RNA-Seq Analyse

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60905
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en trinnvis prosedyre for in vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved kontakthemming etterfulgt av karakterisering på molekylært nivå ved RNA-seq analyse.

Abstract

Humane primære keratinocytter brukes ofte som in vitro-modeller for studier på epidermal differensiering og relaterte sykdommer. Metoder er rapportert for in vitro differensiering av keratinocytter dyrket i todimensjonale (2D) nedsenket manerer ved hjelp av ulike induksjonsforhold. Beskrevet her er en prosedyre for 2D in vitro keratinocytt differensieringsmetode ved kontakthemming og påfølgende molekylær karakterisering av RNA-seq. Kort sagt, keratinocytter dyrkes i definert keratinocytt medium supplert med vekstfaktorer til de er helt samløpet. Differensiering induseres av nære kontakter mellom keratinocytter og ytterligere stimulert ved å ekskludere vekstfaktorer i mediet. Ved hjelp av RNA-seq analyser, er det vist at begge 1) differensierte keratinocytter viser distinkte molekylære signaturer under differensiering og 2) det dynamiske genuttrykksmønsteret ligner i stor grad celler under epidermal stratifisering. Som for sammenligning med normal keratinocytt differensiering, keratinocytter bærer mutasjoner av transkripsjonsfaktor p63 viser endret morfologi og molekylære signaturer, i samsvar med deres differensiering defekter. Til slutt beskriver denne protokollen trinnene for 2D in vitro keratinocyttdilateriering og molekylær karakterisering, med vekt på bioinformatisk analyse av RNA-seq-data. Fordi RNA-ekstraksjon og RNA-seq prosedyrer har blitt godt dokumentert, er det ikke fokus for denne protokollen. Den eksperimentelle prosedyren for in vitro keratinocyttdilateriering og bioinformatisk analyserørledning kan brukes til å studere molekylære hendelser under epidermal differensiering i sunne og syke keratinocytter.

Introduction

Humane primære keratinocytter avledet fra den menneskelige huden brukes ofte som en cellulær modell for å studere biologien til epidermis1,2,3,4. Stratifiseringen av epidermis kan modelleres av keratinocytt differensiering, enten i en 2D nedsenket monolayer mote eller 3D luftløft organotypisk modell2,3,5,6,7. Selv om 3D-modeller har blitt stadig viktigere for å vurdere epidermal struktur og funksjon, er 2D differensieringsmodeller fortsatt mye brukt, på grunn av deres bekvemmelighet og muligheten til å generere et stort antall celler for analyser.

Ulike forhold har blitt brukt for å indusere keratinocytt differensiering i 2D, inkludert tilsetning av serum, høy konsentrasjon av kalsium, lavere temperatur og hemming av epidermalvekstfaktorreseptorer 2,3. Hver av disse metodene har blitt validert av en rekke keratinocytt differensieringsmarkørgener og vist seg å være effektive for å vurdere keratinocyttdilatering, inkludert under patologiske forhold. Disse induksjonsforholdene viser imidlertid også forskjeller i differensieringseffektivitet og kinetikk når spesifikke paneler av markørgenerundersøkes 2,3.

En av disse metodene innebærer keratinocyte kontakthemming og uttømming av vekstfaktorer i kulturmediet8. Det har vist seg at keratinocytter kan differensiere spontant når cellene når full tetthet.  Å ekskludere vekstfaktorer i kulturmediet kan ytterligere styrke differensieringen. Metoden som kombinerer kontakthemming og nedbrytende vekstfaktorer har vist seg å generere differensierte keratinocytter med genuttrykksmønstre som ligner på den normale stratifiserte epidermis når du bruker flere epidermale markører3, noe som tyder på at denne modellen er egnet for å studere normal keratinocyttdifferensiering. Nylig har to omfattende genuttrykksanalyser av keratinocyttdilateriering ved hjelp av denne modellen blittrapportert 9,10. Forskere validerte denne modellen på molekylært nivå og viste at den kan brukes til å studere normal og syk keratinocyttdilateriering.

Denne protokollen beskriver prosedyren for in vitro differensieringsmetoden og molekylær analyse av differensierte celler ved hjelp av RNA-seq. Det illustrerer også karakterisering av transkripsjon av celler på differensiering dag 0 (spredning stadium), dag 2, dag 4, og dag 7 (tidlig, midten, og sen differensiering, henholdsvis). Det er vist at differensierte keratinocytter viser genuttrykksmønstre som i stor grad ligner celler under epidermal stratifisering. For å undersøke om denne metoden kan brukes til å studere hudpatologi, brukte vi den samme eksperimentelle og analyserørledningen for å undersøke keratinocytter som bærer mutasjoner av transkripsjonsfaktoren p63 som er avledet fra pasienter med ectrodactyly, ectodermal displasia og kløft leppe / gane (EEC)syndrom 11,12. Denne protokollen fokuserer på in vitro differensiering av keratinocytter samt påfølgende bioinformatisk analyse av RNA-seq. Andre trinn i den komplette prosedyren som RNA-ekstraksjon, RNA-seq prøveklargjøring og bibliotekkonstruksjon, er godt dokumentert og kan enkelt følges, spesielt når du bruker mange vanlige kommersielle sett. Derfor er disse trinnene bare kort beskrevet i protokollen. Dataene viser at denne rørledningen er egnet for å studere molekylære hendelser under epidermal differensiering i sunne og syke keratinocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hudbiopsier ble tatt fra stammen av friske frivillige eller pasienter med p63 mutasjoner, for å sette opp den primære keratinocyttkulturen. Alle prosedyrer for etablering av menneskelige primære keratinocytter ble godkjent av den etiske komiteen ved Radboud University Nijmegen Medical Centre ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). Informert samtykke ble innhentet.

1. Human primær keratinocytt differensiering ved kontakthemming

  1. Forbered keratinocyttvekstmedium (KGM) fra Keratinocyte Basal Medium (Materials table) når det er nødvendig.
  2. Lag 500 ml spredningsmedium ved hjelp av forhåndsforberedte bestander (KGM-pro, se tabell 1).
  3. Lag 500 ml differensieringsmedium (KGM-dif; se tabell 2).
    MERK: KGM med kosttilskudd kan oppbevares ved 4 °C i to uker. For lengre lagring, kan det bli aliquoted og lagret ved -20 ° C.
  4. Frø primære keratinocytter i tettheten av 5,0-20 x 103 celler / cm2, avhengig av cellen proliferativ kapasitet. Tilsett tilstrekkelig KGM-pro medium for å dekke celler.
    MERK: 1) Detaljer om vanlig cellekultur i KGM medium finner du på nettsiden til Lonza13. 2) Såetettheten skal testes for hver cellelinje. For eksempel kan en normal primær keratinocyttlinje seedes med en tetthet på 5,0 x 103 celler / cm2, mens en linje som bærer mutasjoner i transkripsjonsfaktoren p63 som er mindre proliferativ, bør seedes med en tetthet på 20 x 103 celler / cm2. 3) Avhengig av eksperimentell oppsett, bør flere retter eller brønner av celler seedes for å tillate innsamling av prøver på forskjellige differensieringsdager i kopier.
  5. Oppdater celler med KGM-pro-mediet i to dager etter såing (seeding på dag 0, forfriskende for førstegang på dag 3). Etterpå kan du oppdatere med KGM-pro medium annenhver dag. Sjekk celler regelmessig, minst annenhver dag.
  6. Indusere celledilatering når celler er mer enn 90% samløpet ved å endre mediet til KGM-dif. Dagen for å bytte medium til KGM-dif er definert som differensieringsdag 0. Samle celler for ytterligere RNA-analyser ved først å vaske 2x med DPBS, og legg deretter i lysisbufferen (fra et RNA-ekstraksjonssett).
    MERK: Med ovennevnte såetetthet bør cellene nå samløpet innen 7–10 dager. Celler kan seedes med en høyere innledende tetthet for å nå samløpet tidligere. Hvis cellene ikke er proliferative, kan lengre ventetid ikke gi opphav til fullt sammenføyde celler. En høyere såetetthet kan være nødvendig.
  7. Oppdater celler med KGM-dif medium hver dag og samle celler på differensiering dag 2, 4. og 7 for ytterligere RNA-ekstraksjon.

2. RNA ekstraksjon

  1. Isoler totalt RNA. Dette kan utføres ved hjelp av et kommersielt RNA-isolasjonssett (for eksempel Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA), eller ved hjelp av fenol14. Et isolasjonssett som inneholder en DNAse-behandling anbefales imidlertid sterkt for RNA-seq-prøver for å forhindre DNA-kontaminering og fenol. Et eksempel på et kommersielt RNA-isolasjonssett er gitt i Materials tabell.
  2. Mål RNA-konsentrasjon med et spektrometer. Både DNA og RNA har en absorpsjonstopp på 260 nm.
    MERK: 1) Forholdet mellom absorbansene ved 260 nm og 280 nm brukes til å vurdere renheten til RNA. Et forhold på rundt 2,0 er allment akseptert som "ren" RNA. Hvis forholdet er vesentlig lavere enn 2,0, kan prøven være forurenset med forurensninger som absorberer ved 280 nm som proteiner, fenoler eller andre stoffer. 2) Forholdet mellom absorbansene ved 260 nm og 230 nm måler nukleinsyre renhet. Det forventes et forhold mellom 2,0 og 2,2. Hvis forholdet er vesentlig lavere, kan prøven være forurenset med forurensninger som absorberer ved 230 nm som EDTA, etanol eller andre stoffer.

3. RNA kvalitetskontroll

  1. Kjør RNA enten på en bioanalyzer RNA Pico chip for å validere RNA Integrity Number (RIN) kvantitativt, eller på en gel for et kvalitativt tiltak. Generelt er en RIN på minst åtte svært tilrådelig. Men når du trekker ut RNA fra vev, kan RIN være lavere.
    MERK: Du kan eventuelt utføres kvalitetskontroll av qPCR på RNA-materialet.

4. RNA-seq bibliotek forberedelse

MERK: RNA-seq-bibliotekforberedelsen utføres ofte med et kommersielt sett eller under kommersielle innstillinger. Den beskrevne protokollen er tilpasset fra et kommersielt sett, KAPA RNA HyperPrep Kit med RiboErase (Illumina), med en kort beskrivelse av alle nødvendige trinn: rRNA depletion med oligo hybridisering til menneskelig ribosomal RNA, RNA fragmentering, første-strand syntese, andre-strand syntese og A-tailing, og opprydding etter hverttrinn 15. Andre bibliotekforberedelsessett kan også brukes til dette formålet. Det anbefales å utføre dette trinnet ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett, da kvaliteten på generert cDNA-bibliotek ofte er mer konsekvent. 2) Følgende trinn er beskrevet for 1x bibliotek forberedelse. Hvis du forbereder flere prøver, gjør masterblandinger med 10% ekstra volum.

  1. Oligo hybridisering og rRNA uttømming
    1. Klargjør oligo hybridisering master mix (totalt = 11 μL, med 4,4 μL hybridisering buffer, 4,4 μL hybridisering oligos, og 2,2 μL RNase-fritt vann) og uttømming master mix (totalt = 5,5 μL, med 3,3 μL uttømming buffer og 2,2 μL av RNase H).
    2. Sett opp PCR-reaksjonsprogrammet på en termocycler: 95 °C i 2 min; rampe ned til 45 °C ved -0,1 °C/s; 45 °C pause; 45 °C i 30 min; 4 °C for alltid.
      MERK: Vurder å starte med dobbelt så mye RNA enn nødvendig for forsterkning. I det første forsøket bruker du halvparten av beløpet til å fortsette med følgende trinn. Dette er for å sikre at det fortsatt er materiale for å gjenta disse trinnene med et annet antall sykluser (se trinn 4.7.2), hvis forsterkningssyklusene viser seg å være utilstrekkelige eller overforenklet.
    3. Bruk mellom 25 ng og 1 μg totalt RNA i 10 μL RNAse-fritt vann, tilsett 10 μL oligo hybridisering master mix. Plasser prøver i den forhåndsprogrammerte termocycleren og start programmet.
    4. Når programmet når pausetrinnet ved 45 °C, legger du til 5 μL uttømmingsmalblanding til 20 μL hybridiseringsreaksjonen uten å fjerne den fra termocycleren. Bland godt ved å pipetter opp og ned flere ganger.
    5. Fortsett termocyclerprogrammet for å fortsette med uttømmingstrinnet (45 °C i 30 min).
      MERK: 1) Sett perlene for rRNA uttømming (f.eks. KAPA rene perler) ved romtemperatur (RT) under uttømmingstrinnet for neste del av protokollen. 2) Vurder å forberede DNase fordøyelsesmalblanding (for pkt. 4.2), siden reagensene er nødvendig rett etter rRNA uttømming opprydding.
    6. Utfør en 2,2x perlebasert KAPA Pure Beads opprydding: kombiner RNA-blandingen (25 μL) og KAPA Pure Beads (55 μL), ved å grundig gjenbruke perlene i RNA-blandingen ved å pipe opp og ned flere ganger.
    7. Inkuber ved RT i 5 min for å tillate RNA binding til perlene, og plasser røret(e) på et magnetstativ for å fange perlene til væsken er klar, og fjern forsiktig og kast 60 μL supernatant.
    8. Hold røret(e) på magneten, vask 2x med 200 μL på 80% etanol ved å inkubere perlene med etanol i ≥30 s og kast etanol. Prøv å fjerne alle gjenværende etanol uten å forstyrre perlene etter den andre vasken.
    9. Tørk perlene ved RT i 3–5 min eller til alt etanol har fordampet.
      MERK: Overtørking av perlene kan føre til redusert utbytte.
  2. DNase fordøyelse
    1. Forbered DNase fordøyelsesmalblanding (totalt = 22 μL, med 2,2 μL DNase buffer, 2 μL DNase og 17,8 μL RNase-fritt vann).
    2. Resuspend perlene i DNAse fordøyelse master mix (20 μL) ved å pipetter opp og ned flere ganger. Inkuber røret(e) ved RT i 3 min for å elute RNA av perlene.
    3. Plasser røret(e) på et magnetstativ for å fange perlene, til væsken er klar, og overfør forsiktig 20 μL supernatant til et rent rør.
    4. Inkuber røret(e) med supernatant ved 37 °C i 30 min.
      MERK: Vurder å forberede RNA-elution-, fragmenterings- og grunningsmalblandingene (for pkt. 4.3), siden reagensene er direkte nødvendig etter DNase fordøyelsesopprydding.
    5. Utfør en 2,2 x perlebasert opprydding ved å følge 4.1.6–4.1.9.
  3. RNA-elitasjon, fragmentering og grunning
    1. Forbered fragment,prime og elute buffer (1x) master mix med 11 μL fragment, prime og elute buffer (2x) og 11 μl rnase-fri vann.
    2. Gjenoppus perlene grundig med renset, DNase-behandlet RNA i 22 μL fragmentering, Prime og Elute Buffer (1x) ved å pipettere opp og ned flere ganger.
    3. Inkuber ved romtemperatur i 3 min for å elute RNA avperlene, og plasser deretter røret(e) på en magnet for å fange perlene til væsken er klar.
    4. Overfør forsiktig 20 μL supernatant til et rør(er). Kast røret(e) med perler.
      MERK: Dette er et trygt stoppested, da prøver kan oppbevares ved -20 °C i ≤24 timer.
    5. Plasser røret(e) i en termocycler og utfør fragmentering og grunning ved 94 °C i 6 min. Resulterer i ca 200-300 bp lange fragmenter.
      MERK: Inkuber i 8 min ved 94 °C i 100–200 bp fragmenter. Ved bruk av delvis degradert RNA, fragment mellom 1–6 min ved 85 °C, avhengig av alvorlighetsgraden av nedbrytning.
    6. Plasser røret(e) på isen og fortsett umiddelbart til første trådsyntese.
  4. Første trådsyntese
    1. Forbered første trådsyntese master mix (totalt = 12 μL, med 11 μL av første tråd syntese buffer og 1 μL kapa script).
    2. Sett opp PCR-reaksjonsprogrammet på en termocycler: 25 °C i 10 min; 42 °C i 15 min; 70 °C i 15 min; 4 °C for alltid.
    3. På is kombinerer du 20 μL fragmentert primet RNA med 10 μL første trådsyntese master mix. Hold røret(e) på isen, bland godt ved å forsiktig pipe reaksjonen opp og ned flere ganger.
    4. Plasser røret(e) i den forhåndsprogrammerte termocycleren og start programmet.
  5. Andre trådsyntese og A-tailing
    1. Forbered andre trådsyntese og A-tailing master mix på is (totalt = 33 μL, med 31 μL av andre tråd syntese buffer og 2 μL av andre tråd syntese & A-tailing enzym blanding).
    2. Sett opp PCR-reaksjonsprogrammet på en termocycler: 16 °C i 30 min; 62 °C i 10 min; 4 °C for alltid.
    3. Kombiner 30 μL første trådsynteseprodukt med 30 μL av andre trådsyntese og A-tailing master mix, og bland godt ved å pipettere opp og ned flere ganger på is.
    4. Plasser røret(e) i den forhåndsprogrammerte termocycleren og start programmet.
  6. Adapter ligation og post-ligation opprydding
    1. Fortynn lageradaptere (NEXTflex DNA-strekkoder, 25 μM) 3,57x i RNasefritt vann til 7 μM.
    2. Forbered adapter ligation master mix (totalt = 50 μL, med 40 μL ligation buffer og 10 μL DNA ligase).
    3. Kombiner 60 μL av andre trådsynteseprodukt, 45 μL adapter ligation master mix og 5 μL fortynnede adaptere. Bland godt ved å pipetter opp og ned flere ganger på is.
    4. Inkuber rørene ved 20 °C i 15 min og fortsett umiddelbart med den første oppryddingen etter ligation.
    5. Utfør en 0,63x perlebasert opprydding ved å kombinere adapter-ligated DNA (110 μL) og KAPA rene perler (70 μL), og deretter grundig gjenbruke perlene i DNA-blandingen ved å pipettere opp og ned flere ganger.
    6. Gjenta trinn 4.1.7–4.1.9.
    7. Fjern rørene fra magneten. Resuspend perlene grundig i 50 μL på 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) og inkuber perlene ved RT i 2 min.
    8. Plasser platen på magneten og vent til væsken er klar. Overfør 50 μL av det klare supernatantet til et nytt rør.
      MERK: Sikkert stoppested i mindre enn 24 timer ved 4 °C.
    9. Utfør en 0,7x perlebasert opprydding ved å kombinere 50 μL perler med renset adapter-ligated DNA med 35 μL PEG / NaCL-oppløsning. Bland godt ved å virvle.
    10. Utfør oppryddingstrinn 4.1.7–4.1.9. Resuspend perlene grundig i 20 μL på 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5), og inkuber perlene ved RT i 2 min.
    11. Plasser platen på magneten; vent til væsken er klar. Overfør 20 μL av det klare supernatantet til et nytt rør og fortsett til pkt. 4.7.
      MERK: Sikkert stoppested i mindre enn 1 uke ved 4 °C eller mindre enn 1 måned ved -20 °C.
  7. Bibliotekforsterkning og opprydding
    1. Klargjør bibliotekforsterkningsmalblanding (totalt = 33 μL, med 27,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix og 5,5 μL av 10x bibliotekforsterkning primer mix).
    2. Konfigurer PCR-reaksjonsprogrammet på en termocycler ved hjelp av følgende parametere. 98 °C for 45 s; N sykluser (se notatet nedenfor) av: 98 °C for 15 s; 60 °C for 30 s; 72 °C for 30 s; 72 °C i 1 min; og 4 °C for alltid.
      MERK: Syklusene for bibliotekforsterkningen avhenger av inndatamaterialet. Det kan omtrent anslås som sådan: starter med RNA = 25-100 ng, N = 11-15 sykluser; 100–250 ng, N = 9–12 sykluser; 250–500 ng, N = 7–10 sykluser.
    3. Utfør en 0,8x perlebasert opprydding ved å kombinere forsterket bibliotek DNA (50 μL) og KAPA rene perler (40 μL), og deretter grundig resuspend perlene i DNA-blandingen ved å pipettere opp og ned flere ganger.
    4. Utfør oppryddingstrinn 4.1.7–4.1.9. Resuspend perlene grundig i 50 μL på 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5), og inkuber perlene ved RT i 2 min.
    5. Overfør 50 μL av det klare supernatantet til et nytt rør og gå videre til den andre bibliotekforsterkningsoppryddingen.
    6. Utfør en 1x perlebasert opprydding ved å kombinere forsterket bibliotek DNA (50 μL) og KAPA rene perler (50 μL), og deretter grundig resuspend perlene i DNA-blandingen ved å pipettere opp og ned flere ganger.
    7. Utfør oppryddingstrinn 4.1.7–4.1.9. Resuspend perlene grundig i 22 μL på 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5), og inkuber perlene ved RT i 2 min.
    8. Overfør 20 μL av det klare supernatantet til et nytt rør, fortsett til Qbit- og bioanalyzermålinger.
  8. Konsentrasjons- og fragmenteringsstørrelse
    1. Mål DNA-konsentrasjoner av prøvene. Bruk av et svært følsomt lysstoffbasert sett (f.eks. Denovix Qbit, se Materialovertred), eller hvis konsentrasjonen ser ut til å være under 0,5 ng/μL, kvantifisere ved hjelp av en mer følsom qPCR-tilnærming (f.eks. Kappa kvantifisering, se Materialtabell).
    2. Bestem fragmentstørrelsen på biblioteket ved hjelp av høysensitiv elektroforese (f.eks. en bioanalyzer).
      MERK: Kvalitetskontroll fra qPCR kan eventuelt utføres før sekvensering (vedlegg) ved hjelp av et utvannet forberedt bibliotek i stedet for cDNA.
  9. Sekvensering
    1. Send biblioteket for sekvensering. For RNA-seq differensial genuttrykksanalyse er en sekvenseringsdybde på mellom 10–25 millioner per prøve generelt tilstrekkelig.

5. Forhåndsbehandling av data

  1. Kvalitetskontroll Fastq-filer
    1. Last ned og installer Trimgalore16 for å fjerne basispar av lav kvalitet og tomme leser i Fastq-filene.
      MERK: 1) De fleste programvare nevnt her fungerer bare i Linux. Hvis begrenset til en Windows-datamaskin, er det mulig å kjøre analyser på en Linux-server ved hjelp av programvaren MobaXterm eller Putty. Husk at for genomindeksering er det nødvendig med mye RAM (random-access memory) (ca. 64 GB). 2) Installere all nødvendig programvare i et conda miljø anbefales på det sterkeste. Dette vil tillate enkel programvareinstallasjon og pakkestyring. Hvis du vil ha mer informasjon om conda, kan du gå til .
    2. Opprett en katalog (mappe) for dataene, for eksempel mappen 'RNA_seq_KC_diff'. Angi dette som arbeidskatalog ved å skrive: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      MERK: Hvis du vil ha en oversikt over mappestrukturen, kan du se folder_structure.txt" i tilleggskodingsfilene.
    3. Opprett flere mapper i arbeidskatalogen med de spesifikke navnene: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'skript' og 'Tilordning'.
    4. Flytt fasta-filene til de sekvenserte dataene til fastq-mappen. Alternativt kan du generere myke koblinger ved hjelp av kommandoen: "ln –s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" til Fastq-filene for å spare diskplass.
    5. Kjør Trim massevis på Fastq-filene, se TrimGalore.txt for koden for å kopiere lim inn i bash. Endre mappenavn og innstillinger i kommandoen der det er nødvendig.
  2. Kartlegging
    1. Last ned et genom for å kartlegge lysene til for eksempel hg38 ensembl versjon 97 (umaskert versjon): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; og den tilsvarende genmerknadsfilen: hg 38 genmerknad ensembl utgivelse 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Overføre begge filene til CRCh38_fasta mappen.
      MERK: Alternativt kan du bruke en annen versjon av genomet, for eksempel UCSC-versjonen av hg38, hvis kartlegging til transkripsjons-IDer i stedet for gen-ID-er foretrekkes.
    2. Installere STAR 2.7.117.
    3. Generer et internt referansegenom ved hjelp av STAR 2.7.1 ved å generere genomskript (se Supplerende kodefiler). Endre mengden tråder til det behandleren har (--runThreadN X). Endre mappenavn og innstillinger i dette skriptet der det er nødvendig. Kjør den ved å kopiere / lime inn i bash.
    4. Installer samtools 1.918 for indeksering av bam-filer og gzip for å komprimere vrikkefiler.
    5. Juster Trim Galore-validert sekvensering av lyder til den menneskelige genomenheten hg38 (ensembl-utgivelse 97) ved hjelp av STAR 2.7.1 etterfulgt av indeksering ved hjelp av samtools og gzip. Dette bør utføres ved hjelp av skriptet map_fastq.txt (se Tilleggskodingsfiler). Endre mappenavnene og innstillingene i dette skriptet der det er nødvendig. Kjør den ved å kopiere / lime inn i bash.
      MERK: STAR-tilordning genererer flere utdatafiler, inkludert en bam-fil, en vrikkefil og lesetellingstabell med navnet *_ReadsPerGene.out.tab, som direkte kan brukes sammenkoblet av R for å bruke som inngang for Deseq2.
  3. Visualisering av genomleser
    1. Installer wigToBigWig fra UCSC genom nettleserverktøy for å generere bigwig filer med big2bw script19.
    2. Overfør filene "convertBigWigChroms.py" og "CRCH38_ensembl2UCSC.txt" fra de supplerende kodefilene til en mappe "skript" i arbeidskatalogen.
    3. Gjør den convertBigWigChroms.py kjørbar (ved hjelp av kommandoen: 'chmod + x skript / konvertereBigWigChroms.py' på en Linux-maskin).
    4. Generere bigWig filer fra Vrikke filer, ved hjelp av skriptet wig2bw.txt (se Supplerende koding filer). Kjør den ved å kopiere / lime inn i bash.
    5. Skriv inn BigWig-filene i UCSC genomnettleseren eller Integrative Genomics Viewer (IGV) for visualisering.

6. RNA-seq dataanalyse

  1. Legge inn eksempeldata i Deseq2
    1. Last ned og installer Rstudio (versjon 1.1.456) og R (versjon 3.6).
    2. Installer alle nødvendige R-pakker (se Tilleggskodefiler).
      MERK: For en detaljert R-markdown-fil som viser all programmeringskode og -utdata, se de vedlagte filene: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" og "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". En generell beskrivelse av alle trinnene er inkludert nedenfor.
    3. Generer en telletabell fra filene ReadsPerGene.out.tab.
    4. Skriv en eksempeldatafil, som inneholder alle filnavn, differensieringsdagen og andre relevante eksempeldata. Hvis du vil ha et eksempel eksempel på et eksempel, kan du se sample_data_example.csv" i tilleggskodingsfilene.
    5. Bruk telletabellen og eksempeldataene til å generere et Deseq220-objekt som inneholder både antalls- og eksempeldataene.
  2. Genuttrykk normalisering, prøveavstand og PCA
    1. Normaliser telletabellen i Deseq2-objektet ved hjelp av enten Deseq2 rld eller vst normalisering. Rld normalisering foretrekkes, men med mange prøver er vst normalisering mye raskere.
    2. Plot prøveavstand basert på normalisert lese fylke intensiteter ved hjelp av "dist" -funksjonen i R og deretter utføre "hclust" klynger basert på prøveavstand. Plott selve varmekartet ved hjelp av pheatmap-pakken.
    3. Generer en PCA-plott av de normaliserte lesetallintensitetene ved hjelp av plotPCA-funksjonen til Deseq2.
      MERK: PCA fungerer som et verktøy i utforskende dataanalyse og kan brukes til å visualisere avstand og relaterthet mellom ulike prøver.
  3. Differensial/svært variabel genuttrykksanalyse
    1. Beregn enten differensialgenene ved hjelp av Deseq2-resultatfunksjonen. Men når du vurderer endringer over flere tidspunkter der sammenligninger på to ganger ikke gjelder, bruk svært variable gener. I dette tilfellet trekker du ut de 500 mest variable genene ved bestilling på variansen mellom prøver fra forskjellige tidspunkter med rowVars-funksjonen.
      MERK: I vår analyse, for kontrollprøvene, ble de 500 mest variable genene (genene med høyest standardavvik av normalisert intensitet på tvers av differensieringsdager) brukt til videre analyse. Men for den syke vs kontrollanalysen differensialt uttryktgener mellom sykdom og sunne kontroller over tid ble beregnet av Deseq2 ved hjelp av en flere tester korrigert p-verdi på 1 x 10-4 som en cutoff. Et annet mulig filtreringstrinn er å utelukke differensialgener som endrer seg mindre enn en viss fold endring cutoff.
    2. Utfør kmeans klynger på differensial eller svært variabel gener for å gruppere dem av ulike uttrykksmønstre.
    3. Visualiser differensiale eller svært variable gener i et varmekart ved hjelp av pheatmap-pakken. Intensiteten som er plottet i varmekartet er Deseq2 normalisert intensitet med medianverdien trukket fra.
  4. Gene Ontology (GO) merknadsberikelsesanalyse
    1. Generer en liste over uttrykte bakgrunnsgener ved å ta alle gener med mer enn 10 tellinger i en enkelt prøve.
    2. Utfør GO-analyse ved hjelp av nettbaserte verktøy som GOrilla21. Bruk listene over differensial/svært variable gener i klynger som "genliste", og bakgrunnsgenene som bakgrunn for sammenligning.
      Merk: Mer avanserte R-brukere kan bruke pakken clusterProfiler22 til å automatisere Go-term berikelse analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normal keratinocyttdilatering og RNA-seq-analyse
I dette eksperimentet ble keratinocyttlinjer avledet fra fem personer brukt til differensiering og RNA-seq analyser. Figur 1 oppsummerer den eksperimentelle prosedyren for differensiering og RNA-seq analyseresultater. En oversikt over in vitro differensieringsprosedyrer for normale keratinocytter og cellemorfologiendringer under differensiering er illustrert i figur 1A. Prinsippkomponentanalyse (PCA) viste at keratinocytter som gjennomgikk differensiering hadde koblet sammen, men tydelige generelle genuttrykksprofiler (figur 1B). Svært variable gener ble gruppert av kmeaner for å visualisere genuttrykksdynamikk og mønstre under differensiering (figur 1C).

Hver klynge av gener var representert av keratinocytt differensiering kjennetegn gener (f.eks KRT5 for spredning, KRT1 og KRT10 for tidlig og mid-differensiering, og IVL / LOR / FLG for sen differensiering). Genontologi (GO) merknadsanalyse av svært variable genklynger (figur 1C) viste en klar forskjell i genfunksjonene til disse genklyngene (f.eks. keratinisering i midten av differensiering; og epidermal celledifferensiering, keratinocyttdifferensiering og peptid krysskobling i de sene stadiene; Figur 1D). Proteinuttrykk av flere differensieringsmarkører ble målt ved vestlig blotting (figur 1E).

P63 mutant keratinocytt differensiering og RNA-seq analyse:
I det andre eksperimentet ble cellemorfologi og genuttrykksforskjeller sammenlignet mellom keratinocytter fra friske kontroller og tre linjer avledet fra pasienter som bærer p63 mutasjoner (mutanter R204W, R279H og R304W). Figur 2A viser en oversikt over differensieringsprosedyrer og cellemorfologiendringer. Mutant keratinocytter forble flate på overflaten av parabolen og ble ikke overfylt eller overlapper vekst som kontroll keratinocytter på dag 7.

I PCA-analyse fulgte kontrollcellelinjene tydelig et differensieringsmønster, sammenlignet med figur 1B. Mønsteret av genuttrykk av muterte celler under differensiering forblir imidlertid i stor grad lik det av proliferating / udifferensierte celler. Blant de tre muterte linjene flyttet differensiering av R279-prøvene langs PC1 og PC2 til en viss grad, noe som indikerer at differensieringen var mindre svekket, sammenlignet med R204W og R304W.

I klyngeanalysen (figur 2C)ble gener nedregulert i kontrollceller (klynge 1) delvis nedregulert i R204W og R279W, men deres genuttrykk ble ikke drastisk endret i R304W. Disse genene spiller sannsynligvis roller i cellespredning, som vist ved GO-merknad (figur 2D). I klynge 2 (figur 2C)ble gener først indusert og deretter nedregulert i kontrollceller. Disse genene er sannsynligvis involvert i keratinocytt differensiering, som epidermal differensiering og keratinisering funksjoner ble svært beriket for denne klyngegener (figur 2D). Disse genene ble ikke indusert i R204W og R304W, mens i R279H-celler ble disse genene indusert, men ikke nedregulert så mye som kontrollcellene.

Gener i klynge 3 ble bare indusert ved slutten av differensieringen i kontrollceller (figur 2D). I samsvar med dette, disse genene kan ha en rolle i det ytre mest laget av epidermis, som de har vist seg å være lydhør overfor ytre stimuli og betennelse (Figur 2D). Uttrykksmønsteret til disse genene endret seg ikke mye i alle tre muterte cellelinjer. De synlige forskjellene i genuttrykksmønstre mellom kontroll og muterte celler viser at muterte celler ikke kan differensiere riktig i disse in vitro differensieringsmodellene.

Figure 1
Figur 1: Keratinocyte differensiering og analyse. (A) Oversikt over keratinocytt differensieringsprotokollen og cellemorfologien. Vektlinje = 100 μm. (B) Prinsippkomponentanalyse av differensieringskontroll keratinocytter. (C) Varmekart av de 500 mest variable genene under keratinocyttdilateriering. Gener er gruppert i tre klynger ved hjelp av kmean klynger. Representative differensieringsmarkørgener for hver genklynge er angitt ved siden. (D) GO-termberikelsesanalyse av overrepresenterte funksjoner for gener i de svært variable genklyngene, sammenlignet med en bakgrunn av alle uttrykte gener (tellinger på > 10). GOrilla ble brukt til berikelsestesten. (E) Vestlig flekk av keratinocytt differensiering markører under differensiering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning av kontroll og p63 muterte keratinocytter. (A) Oversikt over keratinocytt differensieringsprotokollen og cellemorfologien til kontroll og p63 muterte keratinocytter. Skala = 100 μm. (B) Prinsippkomponentanalyse av differensieringskontroll og pasient (R204W, R279H og R304W) keratinocytter. (C) Varmekart over differensialgener mellom kontroll og muterte keratinocytter. Gener er gruppert i tre klynger ved hjelp av kmean klynger. Representative differensieringsmarkørgener for hver genklynge er indikert. (D) GO-termberikelsesanalyse av overrepresenterte funksjoner for gener i de svært variable genklyngene, sammenlignet med en bakgrunn av alle uttrykte gener (tellinger på > 10). GOrilla ble brukt til berikelsestesten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

KGM-komponent Lager Middels Volum
KBM (andre artikler) 500 ml
Penn/Strep 100 000 enheter/ml 100 enheter/ml 5 ml
BPE ~13 mg/ml 0.4% 2 ml
Etanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosfoetanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL
Hydrocortisone 0,5 mg/ml 0,5 μg/ml 500 μL
Insulin 5 mg/ml 5 μg/ml 500 μL
EGF 10 μg/ml 10 ng/ml 500 μL

Tabell 1. KGM-pro medium kosttilskudd.

KGM-komponent Lager Middels Volum
KBM (andre artikler) 500 ml
Penn/Strep 100 000 enheter/ml 100 enheter/ml 5 ml
Etanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosfoetanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL

Tabell 2. KGM-diff medium kosttilskudd.

Supplerende kodefiler: Folder_structure.txt. Generate_genome.txt. Map_fastq.txt. RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; TrimGalore.txt; og Wig2bw.txt. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette arbeidet beskriver en metode for å indusere menneskelig keratinocytt differensiering og påfølgende karakterisering ved hjelp av RNA-seq analyser. I dagens litteratur bruker mange studier på human keratinocyttdilateriering to andre metoder, med høy kalsiumkonsentrasjon eller med serum som metoder for å indusere differensiering2,3,23. En tidligere rapport nøye sammenlignet disse tre forskjelligemetodene 3 og viste at disse metodene kan representere distinkt biologi av keratinocytt differensiering. I samme rapport viste forfatterne at differensierte celler indusert av serum har høyt proliferativt potensial og uttrykker gener som KRT16 og SKALP/ PI3 som uttrykkes i psoriasishuden, men ikke i normal epidermis, og at derfor kan serumindusert differensieringsmodell brukes til å studere psoriasis. I motsetning kan metoden for kontakthemming pluss eksklusjon av vekstfaktor indusere KRT1 og KRT10, som normalt uttrykkes i epidermis og ligner normal keratinocyttdilateriering. Høy kalsiuminduksjon gir opphav til en genuttrykksprofil som er mellom seruminduksjon og kontakthemming, som den minst spesifikke metoden. Analysene ved hjelp av RNA-seq analyser under differensiering bekreftet at metoden for kontakthemming pluss eksklusjon av vekstfaktor resulterer i differensierte keratinocytter med lignende genuttrykksprofiler som de som forventes for epidermal differensiering (f.eks. KRT5 i proliferating celler, KRT1 og KRT10 i tidlig differensiering induksjon, og LOR og FLG i sen differensiering; Figur 1C).

Disse funnene viser at denne differensieringsteknikken er en brukervennlig og pålitelig metode for å studere keratinocyttdilateriering. Videre viser dette arbeidet med keratinocytter avledet fra p63 muterte keratinocytter også at metoden kan brukes til å studere påvirket keratinocyttdilatering under syke tilstander. I denne in vitro differensiering tilnærming, KGM kjøpt fra Lonza brukes, som dette mediet gir konsistente resultater. I prinsippet er andre epidermale medier med lignende sammensetning som keratinocytt serumfritt medium (KSFM) fra Thermo Fisher Scientific også sannsynlig egnet, selv om dette må testes.

Det bør bemerkes at denne metoden har noen begrensninger. Som det er basert på kontakthemming, er samløpet av celletetthet nødvendig. I våre eksperimenter med p63 muterte keratinocytter har en høyere innledende såetthet vært nødvendig for å sikre at cellene når samløpet. I tillegg, når celler ikke vokser med samme hastighet, må differensiering noen ganger induseres på forskjellige dager. Disse hensynene bør tas i betraktning når du konfigurerer eksperimenter. I eksperimentelle innstillinger der celler må induseres samtidig, bør andre differensieringsmetoder vurderes, inkludert tilsetning av serum, høye konsentrasjoner av kalsium og hemming av epidermalvekstfaktorreseptorer 2,3. Likevel har alle in vitro differensieringsmetoder fordeler og ulemper, da de sannsynligvis representerer delvis differensieringsinduksjonssignaler som er tilstede under in vivo hudutvikling2.

En omfattende molekylær analyse som sammenligner disse ulike metodene vil være svært informativ og kan instruere valg av metode som er mest egnet for ulike studier på biologiske prosesser. I tillegg anbefales validering av endringer målt på transkripsjonsnivået, for eksempel via vestlige blotting eller proteomiske analyser. Videre bør in vitro-data brukes med forsiktighet, og konklusjoner fra disse modellene bør valideres in vivo, fortrinnsvis i menneskelig hudutvikling.

Grunnleggende prinsipper for RNA utvinning og RNA-seq bibliotek forberedelse har blitt godt beskrevettidligere 24,25,26,27,28. I denne protokollen er RNA-ekstraksjons- og RNA-seq-bibliotekets forberedelsesprosedyrer basert på arbeidsflyter for kommersielt tilgjengelige sett. I prinsippet bør ulike metoder for RNA-utvinning ikke ha stor innflytelse på RNA-seq-analyser hvis RNA-kvaliteten er god. I tilfeller der RNA-kvaliteten er dårlig (det vil si når RNA ekstraheres formalin-fast parafin-innebygd vev), kan RNA-seq fortsatt utføres; RNA-fragmenteringstrinnet bør imidlertid justeres. RNA-seq bibliotek forberedelse dekker fra ribosomal RNA (rRNA) fjerning til cDNA bibliotek konstruksjon for sekvensering. De viktigste prosedyrene kan utføres ved hjelp av ulike sett, eller ved hjelp av individuelle enzymer og hjemmelagde buffere29,30,31,32. Det bør bemerkes at hvis RNA-seq analyse utføres ved hjelp av forskjellige grunnleggende prinsipper (f.eks, enten ribosomal RNA uttømming eller polyA mRNA berikelse ved hybridisering til polyT oligos), kan utfallet av RNA-seq analyser variere. Videre benytter protokollen ribosomal RNA fjerning ved hybridisering av DNA oligos til mennesker, mus, og rotte rRNA. Når du arbeider med ulike arter, bør et alternativt oligo sett brukes.

Sekvensering av det genererte biblioteket kan utføres enten i begge ender av fragmentene (paret ende) eller i den ene enden av fragmentet (enkelt ende). Generelt, sammenkobling ende sekvensering forbedrer betydelig kartpability og gir mer informasjon om transkripsjon varianter. Men for en relativt enkel differensial genanalyse som beskrevet her, kan enkeltsekvensering også gi tilstrekkelig informasjon.

For det viktige trinnet i dataanalysen beskrives en relativt enkel metode for kvalitetskontroll av fastq-filene, etterfulgt av kartlegging av leser til genomet. Selv om den medfølgende bash-koden ikke har ideell skalerbarhet, har den fordelen av gjennomsiktighet. Valget av programvare, hvilke trinn den utfører, og versjon av genomet som brukes under forhåndsbehandling av data, er alle ikke-fraktriske trinn som skal være godt dokumentert, noe som er avgjørende for repeterbarheten.

For mer avanserte brukere kan en automatisert rørledning brukes til å utføre trinnene for fastQ-filkvalitetskontroll, adapterbeskjæring og kartlegging, for eksempel ARMOR snakemake arbeidsflyt33 eller 'RNA-seq' Snakemake arbeidsflyt fra van Heeringen lab34. Disse fullstendig automatiserte rørledningene er imidlertid mindre gjennomsiktige og vanskeligere å endre. Når du bruker disse verktøyene, er det viktig å forstå funksjonene i disse automatiserte rørledningene. Til slutt inkluderer protokollen RNA-seq dataanalyse med vekt på variabelt genuttrykk over tid. Variabelt genuttrykk foretrekkes fremfor differensialtesting på to parvis når man ser på prosesser med flere tidspunkter, for eksempel differensiering. Til slutt introduserer denne analyserørledningen relevante verktøy for bioinformatisk analyse av RNAseq-data. Den inneholder verktøy som kan grundig vurdere keratinocytt differensiering, både under normale og syke forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Netherlands Organisation for Scientific Research (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Åpen konkurranse/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud University fellesskap (H.Z.); og Kinesisk stipendråd stipend 201406330059 (J.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
  3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
  4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
  7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
  8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
  9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
  10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
  11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
  12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).
  13. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019).
  14. Doyle, K. aM. Protocols and applications guide. , Promega Corporation. Madison. (1996).
  15. Roche. Hyperprep Kit. , Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019).
  16. Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019).
  17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
  26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
  28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
  29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
  30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
  31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
  32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
  33. Soneson, C. ARMOR. , Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019).
  34. Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019).

Tags

Genetikk utgave 159 humane primære keratinocytter 2D nedsenkne kultur in vitro differensiering RNA-seq bioinformatikk analyse p63
Karakterisering av In Vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved RNA-Seq Analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues,… More

Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter