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Biology

इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और प्लॉयडिक एनालिसिस के लिए फिक्स्ड हार्ट्स से कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/60938
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2,3
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 2Lillehei Heart Institute, Department of Medicine, University of Minnesota, 3Stem Cell Institute, University of Minnesota
* These authors contributed equally

Summary

इस काम का लक्ष्य वयस्क हृदय से कार्डियोमायोसाइट्स को पुन: उत्पन्न करने और डीएनए सामग्री और नाभिक को मापने के लिए एक विधि विकसित करना है।

Abstract

वयस्क स्तनधारी दिल कार्डियोमायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट सहित विभिन्न कोशिका प्रकारों से बना है। चूंकि हिस्टोलॉजिकल वर्गों पर कार्डियोमायोसाइट्स के नाभिक की मज़बूती से पहचान करना मुश्किल है, इसलिए कई समूह इम्यूनोदाता करने के लिए निर्धारण से पहले व्यवहार्य कार्डियोमायोसाइट्स को अलग-थलग करने पर भरोसा करते हैं। हालांकि, इन लाइव कार्डियोमायोसाइट आइसोलेशन तकनीकों को अधिकतम अनुकूलन के बावजूद नमूने से नमूने में अंतर्निहित उतार-चढ़ाव के साथ नमूनों की उपज, व्यवहार्यता और गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है। यहां, हम एक प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं, जिसमें हृदय के एंजाइमेटिक पाचन से पहले निर्धारण शामिल है, जो व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स के वीवो आकृति विज्ञान को संरक्षित करते हुए अधिकतम उपज की ओर जाता है। हमने व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स के लिए नाभिक प्रति नाभिक और डीएनए सामग्री की संख्या निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित विश्लेषण मंच विकसित किया है। छाती गुहा को उजागर करने के बाद, दिल को पीबीएस में 60 एमएमएम केसीएल के साथ परफ्यूजन द्वारा डायस्टोल में गिरफ्तार किया गया था। इसके बाद, दिल को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान में तय किया गया था, और फिर 60 मिलीग्राम/ पाचन के बाद, कोशिकाओं को त्रिचुरेशन द्वारा विलक्षण किया गया था, और कार्डियोमायोसाइट अंश को अंतर अपकेंद्रित्र के माध्यम से समृद्ध किया गया था। प्राप्त आबादी की शुद्धता का आकलन करने के लिए ट्रोपोनिन टी और α-ऐक्टिनिन के लिए अलग कार्डियोमायोसाइट्स दाग दिए गए थे। इसके अलावा, हमने DAPI धुंधला होने के बाद कार्डियोमायोसाइट न्यूक्लियेशन और प्लॉयडी स्थिति निर्धारित करने के लिए एक छवि विश्लेषण मंच विकसित किया। छवि आधारित प्लॉयड आकलन के कारण लगातार और प्रजनन योग्य परिणाम सामने आए। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के साथ, अधिकतम उपज प्राप्त करते समय इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और डीएनए सामग्री विश्लेषण की अनुमति देने के लिए व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स की देशी आकृति विज्ञान को संरक्षित करना संभव है।

Introduction

1 ,1,2दशकों से अधिकांश पश्चिमी देशों में हृदय रोग मृत्यु का प्रमुख कारण रहा है . हालांकि हृदय रोगों के उपचार में कई सुधारों से अस्तित्व में सुधार हुआ है, वर्तमान में कोई उपचार नहीं है जो खोए हुए कार्डियोमायोसाइट्स की जगह ले सकता है। इसलिए, कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन, प्रसार, एपोप्टोसिस और हाइपरट्रॉफी से संबंधित अध्ययन वैज्ञानिक समुदाय का एक प्रमुख केंद्र रहे हैं और जारी हैं। चूंकि वयस्क स्तनधारी दिल में एक बहुत ही सीमित पुनर्योजी क्षमता है, जिसमें प्रति वर्ष 1% से कम की अनुमानित कार्डियोमायोसाइट नवीकरण दर है, इसलिए कार्डियोमायोसाइट प्रोलिफेरेटिव घटनाओं3,,4की विश्वसनीय रूप से पहचान करना महत्वपूर्ण है। अधिकांश रणनीतियां जो प्रसारीय घटनाओं को मापती हैं, वे पिछले या वर्तमान प्रसार का आकलन करने के लिए शामिल डीएनए न्यूक्लियोटाइड एनालॉग के लिए धुंधला करने पर निर्भर करती हैं, या सक्रिय प्रसार के परमाणु मार्कर के लिए दाग5। कार्डियोमायोसाइट प्रोलिफेरेटिव घटनाओं की विश्वसनीय रूप से पहचान करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रोलिफेरेटिव कार्डियोमायोसाइट्स की कुल संख्या इतनी कम है3,6. उदाहरण के लिए, प्रति वर्ष अंतर्जात कार्डियोमायोसाइट्स की 1% नवीकरण दर के आधार पर, वयस्क माउस हार्ट7,,8में किसी भी समय 25 और 50 कार्डियोमायोसाइट्स के बीच प्रोलिफेरेटिव होने की उम्मीद कर सकते हैं। कार्डियोमायोसाइट नाभिक की पहचान में कोई भी अशुद्धियों झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, कार्डियोमायोसाइट नाभिक की विश्वसनीय रूप से पहचान करना महत्वपूर्ण है, जो हिस्टोलॉजिकल सेक्शन9से कठिन और अविश्वसनीय साबित हुआ है। कार्डियोमायोसाइट्स की पहचान ऊतक वर्गों की तुलना में एकल कोशिकाओं से बहुत अधिक सटीक है क्योंकि α-ऐक्टिनिन जैसे मार्कर का उपयोग करते समय भी कार्डियोमायोसाइट्स को अन्य सेल प्रकारों से अलग करना मुश्किल हो सकता है, हालांकि पीसीएम1 हिस्टोलॉजिकल सेक्शन10में कार्डियोमायोसाइट न्यूक्लियी का एक विश्वसनीय मार्कर हो सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल निर्धारण से पहले लाइव कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने पर भरोसा करते हैं, जो कार्डियोमायोसाइट्स के कम से कम 30% की मौत का कारण माना जाता है, और कार्डियोमायोसाइट्स11की विशिष्ट आबादी का अनजाने चयन हो सकता है। इसके अलावा, इन प्रोटोकॉल को प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करने के लिए अनुकूलित करना बेहद मुश्किल है। यहां तक कि अनुकूलित अलगाव तकनीक आम तौर पर अलग पैदावार12के साथ 65% से अधिक लाइव, रॉड के आकार के कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन कर सकती हैं।

इन मुद्दों को दूर करने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो शोधकर्ताओं को फिक्स्ड कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने की अनुमति देता है। चूंकि नमूने अलगाव से पहले तय किए जाते हैं, इसलिए उपज को अधिकतम किया जाता है, और वीवो आकृति विज्ञान में अच्छी तरह से संरक्षित किया जाता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के साथ कार्डियोमायोसाइट्स को नैदानिक नमूनों से अलग करना संभव है, जो आमतौर पर खरीद के तुरंत बाद तय होते हैं। इसके अलावा, नए जनित कार्डियोमायोसाइट्स की पहचान करने के लिए, व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स की नाभिक और प्लॉयडी स्थिति को मापना महत्वपूर्ण है, क्योंकि केवल डिप्लॉयड कार्डियोमायोसाइट्स को आमतौर पर नवगठित माना जाता है। फ्लो साइटोमेट्री बहुनीयता को पॉलीप्लॉयी से अलग नहीं कर सकता और यह अपेक्षाकृत समय और संसाधन-प्रधान प्रोटोकॉल है । छवियों के भीतर नाभिक की मैन्युअल रूपरेखा और माप बहुत कम थ्रूपुट है और मानव पूर्वाग्रह से ग्रस्त है। फिक्स्ड, अलग दापी-दाग कार्डियोमायोसाइट्स की छवियों का स्वचालित मात्राीकरण इन दोनों समस्याओं को हल करता है। नाभिक और प्लॉयडी वितरण के इमेजिंग आधारित निर्धारण को बुनियादी उपकरणों का उपयोग करके न्यूनतम समय और अभिकर् ता के साथ प्राप्त किया जा सकता है।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देश संस्थानों के अनुरूप किया गया और मिनेसोटा विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. समाधान और शल्य चिकित्सा उपकरणों की तैयारी

  1. अलगाव से पहले, 70% इथेनॉल समाधान का उपयोग करके सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें।
  2. 60 m M की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 500 एमएल फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) समाधान में केसीएल के 2.24 ग्राम जोड़ें। कमरे के तापमान पर केसीएल-पीबीएस समाधान स्टोर करें। माउस प्रति केसीएल-पीबीएस समाधान के 3 एमएल का उपयोग करें।
  3. 4% पीएफए की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पीबीएस के साथ 32% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान पतला करें। प्रति माउस पीबीएस में 4% पीएफए की 10 एमएल तैयार करें। पतला पीएफए समाधान एक ग्लास कंटेनर में 2-3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: तैयार 4% पीएफए समाधान को लंबे समय तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. पीबीएस के 60 मिलीग्राम कोलेजन, टाइप 2 प्रति 1 मिलियन जोड़कर प्रति माउस कोलेजन का 1 एमएल घोल तैयार करें।

2. परफ्यूजन और दिल का निर्धारण

  1. 1 एल/मिनट की ऑक्सीजन प्रवाह दर के साथ 2-5% आइसोफ्लुन का उपयोग करके जानवर को एनेस्थेटाइज करें। आंदोलन की कमी और सांस लेने की कम दर की पुष्टि करके संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
    नोट: हेपरिन इंजेक्शन (100-500 यू/किलो) से पहले इच्छामृत्यु रक्त के थक्के को रोकने के द्वारा सेल की गुणवत्ता और उपज में वृद्धि कर सकते हैं, जिससे फिक्सेटिव के साथ दिल के अधिक कुशल परफ्यूजन के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. अनुमोदित पद्धतियों के अनुसार पशु को इच्छामृत्यु दें।
    नोट: हम जानवरों की इच्छामृत्यु के लिए अमेरिकी पशु चिकित्सा संघ के दिशा निर्देशों का पालन किया, और इच्छामृत्यु के लिए स्थानीय IACUC अनुमोदन प्राप्त की ।
  3. इच्छामृत्यु वाले जानवर को रीढ़ की स्थिति में रखें, और विस्तारित अंगों को टेप करें।
  4. कुंद अंत कैंची का उपयोग कर दिल का पर्दाफाश करने के लिए छाती के माध्यम से काटें। उतरते महाधमनी और अवर कैवल नस काटें।
  5. 23 जी तितली सुई (नवजात शिशुओं के लिए 26 जी) के साथ सेट एक जलसेक से जुड़े एक जलसेक पंप का उपयोग करके 3 एमएल-पीबीएस समाधान के बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से 3 एमएल इंजेक्शन द्वारा दिल को प्रेरित करते हैं। सुनिश्चित करें कि पट के माध्यम से छेद न करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, समाधान इंजेक्ट करने के लिए सिरिंज से जुड़ी सुई का उपयोग करें।
  6. 1 मिली/मिनट की दर से पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके 10 मिनट के लिए 4% पीएफए समाधान के 10 एमएल इंजेक्शन द्वारा दिल को पर्फ्यूज करें।
  7. कैंची का उपयोग कर पूरे दिल को हटा दें। दिल को हटाने के बाद, चीर कर दिल के एक विशिष्ट क्षेत्र को अलग करना संभव है। दिल, या इसके एक खंड को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें 4% पीएफए समाधान का 1 मिलियन 1 मिलियन होता है। 1 घंटे के लिए 20-30 आरपीएम के बीच कमाल की गति के साथ कमरे के तापमान पर घुमाव पर दिल इनक्यूबेट ।

3. फिक्स्ड कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव

  1. पीबीएस सॉल्यूशन युक्त पेट्री डिश में दिल को रखें। वेंट्रिकल्स में शेष किसी भी पीएफए से छुटकारा पाने के लिए दिल को निचोड़ें, और पीबीएस में धोएं।
  2. तय दिल को कोलेजन समाधान (60 मिलीग्राम/एमएल) युक्त एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें। ट्यूब को रात भर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रॉकर (20-30 आरपीएम) पर रखें इनक्यूबेशन।
    नोट: इनक्यूबेशन समय को 1 सप्ताह तक बढ़ाएं और उपज में संभावित भिन्नता को कम करने के लिए हर दो दिनों में कोलेजनेस समाधान की भरपाई करें यदि दिल फाइब्रोटिक होने का अनुमान है, जिसे एक्सट्रासेलुलर कोलेजन को पचाने के लिए कोलेजनेज़ पाचन के लंबे समय की आवश्यकता हो सकती है।
  3. कोलेजन घोल और दिल को 35 एमएम पेट्री डिश में डालें। संदंश या कैंची का उपयोग करके दिल को 1 मिमी टुकड़ों में अलग करें।
  4. 2 मिनट के लिए अलग ऊतक को आगे बढ़ाने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें। यदि ऊतक कण अभी भी पकवान में रहते हैं, तो संकीर्ण उद्घाटन के साथ एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें और त्रिसंवता जारी रखें। जब तक ऊतक के बहुमत टूट गया है जारी रखें।
    नोट: अधिक ट्रिट्यूशन व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स को तोड़ने का कारण बनता है। एक माइक्रोस्कोप के नीचे नियमित रूप से जांच करके ट्राइट्यूरेट पर नहीं करना सुनिश्चित करें।
  5. 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब के उद्घाटन पर 200-600 माइक्रोन नायलॉन जाल रखें।
    नोट: हाइपरट्रोफिड कार्डियोमायोसाइट्स के लिए, 200 माइक्रोन के बजाय 400 माइक्रोन नायलॉन जाल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  6. पीसोसिएटेड कोशिकाओं वाले पेट्री डिश में पीबीएस के 5 एमएल जोड़ें और ऊतक कणों सहित नायलॉन जाल के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें। अतिरिक्त 4 एमएल पीबीएस पारित करके नायलॉन जाल धोएं।
  7. 1 मिनट के लिए 10-100 x g पर फ़िल्टर किए गए समाधान को सेंट्रलाइज करें।
    नोट: 100 x g अपकेंद्रित्र 100% शुद्ध कार्डियोमायोसाइट आबादी नहीं निकलेगा, और कुछ गैर-कार्डियोमायोसाइट कोशिकाओं को शामिल किए जाने की संभावना है।
  8. सुपरनैक्टेंट को तब तक छोड़ दें जब तक कि कोई गैर-कार्डियोमायोसाइट्स कार्डियक कोशिकाओं का भी दाग/मूल्यांकन नहीं करना चाहता । धुंधला होने से पहले 10 एमएल पीबीएस में गोली को फिर से रीसुस्ल करें।

4. धुंधला कार्डियोमायोसाइट्स

  1. 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और पीबीएस में 5 मिलियन मिलियन पेरमेबिलाइजेशन समाधान (जैसे, 0.5% ट्राइटन एक्स-100) जोड़ें। घुमाव पर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    नोट: चरणों के लिए 4.1, 4.2 और 4.4 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब का उपयोग करें क्योंकि 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों की तुलना में सेल पेलेट को परेशान किए बिना सुपरनिटेंट को हटाना आसान है।
  2. 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, अवरुद्ध बफर के 5 एमएल जोड़ें (उदाहरण के लिए, पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए]) और एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उचित कमजोर पड़ने के अनुपात के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (पीबीएस में) के 1 एमएल जोड़ें। समाधान को 1.5 मिलील माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और अनुकूलित स्थितियों (उदाहरण के लिए, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस) के तहत प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में कार्डियोमायोसाइट्स को इनक्यूबेट करें।
  4. कार्डियोमायोसाइट्स को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में प्राइमरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन के साथ ट्रांसफर करें और पीबीएस के 9 एमएल जोड़ें। एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कार्डियोमायोसाइट्स इनक्यूबेट।
  5. 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए और पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें। एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कार्डियोमायोसाइट्स इनक्यूबेट। इस स्टेप को एक बार और दोहराएं।
  6. 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और दापी युक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट, कार्डियोमायोसाइट्स धोने के लिए दो बार कदम ४.५ दोहराने के बाद ।
  7. कोशिकाओं को या तो कवरस्लिप या माइक्रोस्कोप-संगत प्लेटों पर रखें और इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: पांडुलिपि में शामिल छवियां 10x और 40x उद्देश्यों के साथ लिया गया । लेजर का उपयोग किया गया: DAPI के लिए 405 एनएम, अल्फा ऐक्टिनिन के लिए 561 एनएम और एडू के लिए 640 एनएम।

5. सेटअप इमेजिंग सॉफ्टवेयर

नोट: अनुपूरक फ़ाइल 1-सॉफ्टवेयरस्क्रीनशॉट्स.पीडीएफ का उपयोग करके इन चरणों के साथ पालन करें।

  1. इमेजजे का फिजी वितरण डाउनलोड करें।
  2. फिजी खोलें। हेल्प एंड जीटी पर क्लिक करें अपडेट... अद्यतन साइटों का प्रबंधन करें। निर्भरता प्लगइन्स एलिप्स स्प्लिट और मॉर्फोलिब्ज डाउनलोड करने के लिए "IJPB-प्लगइन्स" और "बायोमेडग्रुप" अपडेट साइटों की जांच करें।
  3. क्लोजपर क्लिक करें । फिजी को निर्भरता डाउनलोड करना शुरू कर देना चाहिए। समाप्त होने पर फिजी को पुनः आरंभ करें।
  4. आरएसट्यूडियो डाउनलोड करें और इसे खोलें।
  5. कॉपी इंस्टॉल (सी("ggplot2", "ऑटोथ्रेसहोल्डर", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "चमकदार"))आर कंसोल की कमांड लाइन में और दर्ज की गई कुंजी को दबाएं। c सभी आर निर्भरता (अनुपूरक फ़ाइल1 में स्क्रीनशॉट 1) स्थापित करने के लिए सभी संकेतों के जवाब में "वाई" टाइप करें।

6. छवि मात्राकरण

  1. फिजी के स्टेटस बार में फिजी और ड्रैग "AnalyzeNucleation.py" (पूरक कोड फ़ाइल के रूप में आपूर्ति) खींचें। इससे स्क्रिप्ट एडिटिंग विंडो खुलेगी। क्लिक करें इसे शुरू करने के लिए निचले बाएं कोने में भागो (पूरक फ़ाइल 1में स्क्रीनशॉट 2) ।
  2. एक संवाद बॉक्स पॉप अप(अनुपूरक फ़ाइल 1:स्क्रीनशॉट 3), आउटपुट डेटा निर्देशिका के स्थान के लिए पूछ रहा है । इस सॉफ्टवेयर द्वारा उपयोग किए जाने वाले सभी विश्लेषण डेटा, आंकड़े और अन्य डेटा इस फ़ोल्डर में संग्रहीत किए जाएंगे। एक और, बड़ा संवाद बॉक्स पॉप अप होगा, सभी छवि विश्लेषण सेटिंग्स(अनुपूरक फ़ाइल 1:स्क्रीनशॉट 4) प्रदर्शित करेगा।
    1. विश्लेषण की जाने वाली छवियों वाली निर्देशिका के स्थान का चयन करें।
    2. नियमित अभिव्यक्ति का उपयोग करके छवि फ़ाइलनाम प्रारूप दर्ज करें। छवि फाइलनाम प्रारूप दर्ज करें, जो यह दर्शाता है कि फ़ाइलनाम के कौन से हिस्से नियमित अभिव्यक्तियों का उपयोग करके ब्रेसिज़ के भीतर पंक्ति, कॉलम, चैनल और (वैकल्पिक) साइट के अनुरूप हैं। ब्रेसिज़ के भीतर रिक्त स्थान न रखें। ब्रेसिज़ में फाइलनाम प्रारूप के चर भागों को घेर लें {}। जिस तरह से फ़ाइलों को सहेजा जाता है वह इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, और यह कदम छवि फाइलनेम से प्रासंगिक जानकारी प्राप्त करेगा।
      नोट: उदाहरण के लिए, प्रारूप स्ट्रिंग
      आर "प्लेट 1-(? पी एंड लेफ्टिनेंट;पंक्ति>[A-Za-z]]+) (? पीएंडिनेंट;कॉलम>[0-9]]--(? पी एंड लेफ्टिनेंट;चैनल>[A-Za-z]]+)))tif"
      एक फाइलनाम का वर्णन करता है जो "प्लेट 1-" से शुरू होता है, जिसके बाद पंक्ति का संकेत देने वाले एक या अधिक वर्णमाला पत्र होते हैं, जिसके बाद कॉलम का संकेत देते हुए एक या अधिक अंक होते हैं, जिसके बाद "-" होता है, जिसके बाद चैनल को इंगित करने वाले एक या अधिक पत्र होते हैं, जिसके बाद "tif" होता है। कोण कोष्ठक के अंदर अक्षर "<>" चर नाम हैं और जब इसे एकत्र किया जाता है तो स्वचालित रूप से डेटा में कॉपी किया जाता है। चर नामों में से एक होना चाहिए ""
    3. उन चैनलों का नाम बता दें, जिनमें परमाणु दाग दिख रहा है और जहां कार्डियोमायोसाइट्स दिख रहे हैं। ये नाम बिल्कुल वैसे ही होने चाहिए जैसे वे नियमित अभिव्यक्ति फाइलनामों में "" चर से मेल खाते हैं ।
    4. इंगित करें कि कॉमा-अलग चर नामों का उपयोग करके छवियों को कैसे समूहित किया जाना चाहिए। किसी दिए गए समूह के भीतर सभी छवियों को एक बैच में खोला और विश्लेषण किया जाएगा। उदाहरण के लिए, यदि छवियों को प्रत्येक अच्छी तरह से सेट में विभाजित किया गया है, और पंक्ति और कॉलम के प्रत्येक अद्वितीय संयोजन के लिए एक अच्छी तरह से है, तो इस क्षेत्र में "पंक्ति, कॉलम" लिखें।
      नोट: ये समूहीय चर प्रारूप स्ट्रिंग में उपयोग किए जाने वाले चरों का सबसेट होना चाहिए। समूहीय चर के रूप में "चैनल" का उपयोग न करें, यह एक दूसरे से संबंधित चैनल छवियों को अलग करेगा।
    5. इंगित करें कि छवियों को एक अच्छी तरह से छवि में एक साथ सिले हैं या नहीं या प्रत्येक साइट के लिए अलग हैं। पूर्व मामले में, साइट को फाइलनाम प्रारूप स्ट्रिंग में इंगित नहीं किया जाना चाहिए।
    6. चुनें कि पृष्ठभूमि से नाभिक को अलग करने के लिए किस थ्रेसिंग विधि का उपयोग करें। फिजी के सभी मानक थ्रेसहोल्डिंग विधियां उपलब्ध हैं। यह निर्धारित करने के लिए विभिन्न थ्रेसिंग तरीकों का परीक्षण करें कि छवि सेट के लिए कौन सा सबसे अच्छा काम करता है। इस उदाहरण में ओत्सु विधि चुनें।
    7. प्रत्येक साइट छवि के लिए सीमा की पुनर्गणना की जानी चाहिए या समूह में हर छवि के लिए एक ही सीमा का उपयोग किया जाना चाहिए या नहीं, यह इंगित करें। संकेत मिलता है कि कार्डियोमायोसाइट छवियां ब्राइटफील्ड हैं या फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करें।
    8. कार्डियोमायोसाइट थ्रेसिंग विधि से संकेत मिलता है। यदि पिछले चरण में ब्राइटफील्ड चुना गया था, तो इस थ्रेसिंग विधि को किनारे-फ़िल्टर किए गए ब्राइटफील्ड छवियों पर लागू किया जाएगा। प्रत्येक साइट छवि के लिए सीमा की पुनर्गणना की जानी चाहिए या समूह में हर छवि के लिए एक ही सीमा का उपयोग किया जाना चाहिए या नहीं, यह इंगित करें।
    9. प्रत्येक अच्छी तरह से कवर करने वाली साइट छवियों की पंक्तियों की संख्या इंगित करें। प्रत्येक अच्छी तरह से कवर करने वाली साइट छवियों के स्तंभों की संख्या इंगित करें। पिक्सल में नाभिक के न्यूनतम क्षेत्र को इंगित करें। उदारता से कम न्यूनतम आकार का उपयोग करें, विश्लेषण चरण में एक उच्च और अधिक सटीक सीमा की गणना की जाएगी। कार्डियोमायोसाइट्स के न्यूनतम क्षेत्र को इंगित करें।
    10. वांछित सेटिंग्स चुनने के बाद ओकेपर क्लिक करें ।
  3. चित्रा 3 और चित्रा 4 में पाए जाने वाले चित्र स्क्रीन पर दिखाई देंगे, विश्लेषण पाइपलाइन के विभिन्न चरणों को दिखाते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए इन छवियों का निरीक्षण करें कि थ्रेसहोल्डिंग और विभाजन ठीक से हो रहा है।
  4. चयनित परिणाम फ़ोल्डर को अब विश्लेषण डेटा(पूरक फ़ाइल 1:स्क्रीनशॉट 5) से भरा जाना चाहिए। विश्लेषण डेटा के अलावा अन्य फ़ाइलों को इस फ़ोल्डर में सुरक्षित रूप से सहेजा जा सकता है जब तक कि उनके नाम "cm_", "nuclei_", या "nucleilink_" से शुरू नहीं होते हैं।

7. डेटा विश्लेषण

नोट: उत्पादन की जाने वाली सीएसवी फाइलों का मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। प्रत्येक विश्लेषण छवि सबसेट "नाभिक (मेटाडेटा) नाम सीएसवी फ़ाइलों का एक ट्रिपल उत्पादन करता है। "न्यूक्लिलिंक (मेटाडेटा)सीएसवी", और "कार्डियोमायोसाइट्स (मेटाडेटा), सीएसवी", जहां (मेटाडेटा) को "_(नाम) = (मूल्य) के नाम-मूल्य जोड़े के अनुक्रम के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है,", जहां (नाम) और (मूल्य) पहले दिए गए नियमित अभिव्यक्ति में मिलान किए गए तारों से प्राप्त अल्फान्यूमिक पात्रों के दृश्य हैं। (उदाहरण के लिए, यदि फाइलनामों में पंक्ति और कॉलम को इंगित किया गया था तो "_row = एफ" और "_column = 8" जैसे तार मौजूद होंगे)। प्रत्येक नाभिक और नाभिक लिंक फ़ाइल का अनाम वामपंथी कॉलम एक नाभिक आईडी नंबर है। न्यूक्लिलिंक फ़ाइल का "मिन" कॉलम कार्डियोमायोसाइट की आईडी है जिसमें कहा गया है कि नाभिक पूरी तरह से या 0 अन्यथा। नाभिक का "मैक्स" कॉलम सबसे अधिक संख्या वाले कार्डियोमायोसाइट की आईडी है जिसमें भाग में नाभिक, या 0 अन्यथा निहित है। कार्डियोमायोसाइट्स फाइल का "मीन" कॉलम कार्डियोमायोसाइट आईडी नंबर है।

  1. आरएसटीयूडियो में "विश्लेषणमुल्यूक्लियेटेड सर्वेयर.आर" खोलें (पूरक कोड फ़ाइल के रूप में प्रदान किया गया)।
  2. इस फ़ाइल के शीर्ष पर "फ़ोल्डरनाम" नाम का एक चर है। इसके बगल में एक फाइलपाथ है। यहां, अंतिम स्लैश(अनुपूरक फ़ाइल 1:स्क्रीनशॉट 6) के बिना, अंतिम चरण में चयनित आउटपुट डेटा फ़ोल्डर के लिए पथ टाइप करें।
  3. स्क्रिप्ट संपादन खिड़की के ऊपरी बाएं कोने में एक हरे रंग का तीर लेबल रन ऐपहोना चाहिए। इस तीर पर क्लिक करें। डेटा लोड करने और ऐप को पॉप अप करने में कुछ समय लग सकता है।
  4. प्रारंभ में, तीन गेटिंग रेखांकन दिखाई देंगे, एक न्यूनतम वैध परमाणु क्षेत्र सीमा को इंगित करने के लिए, एक न्यूनतम वैध परमाणु मतलब तीव्रता सीमा को इंगित करने के लिए, और एक कार्डियोमायोसाइट्स के लिए अधिकतम वैध न्यूनतम feret के व्यास को इंगित करने के लिए । इन थ्रेसहोल्ड(सप्लीमेंट्री फाइल 1:स्क्रीनशॉट 7) को सेट करने के लिए स्लाइडर्स का उपयोग करें।
    नोट: इन रेखांकनों में से प्रत्येक में, वैध नाभिक या कार्डियोमायोसाइट्स के अनुरूप एक बड़ा, व्यापक शिखर मौजूद होना चाहिए, मलबे या गलत खंडित कार्डियोमायोसाइट्स का प्रतिनिधित्व करने वाली व्यापक पूंछ से घिरा हुआ होना चाहिए। प्रत्येक चोटियों की एक पूंछ को काटने के लिए थ्रेसहोल्ड का उपयोग करें।
  5. नीचे स्क्रॉल करें। बटन पर क्लिक करें चयनित थ्रेसहोल्ड (पूरक फ़ाइल 1के नीचे: स्क्रीनशॉट 7) लागू करें।
  6. बटन प्लॉट तीव्रता वितरण परक्लिक करें । यह प्रत्येक समूह चर के लिए पूरे नमूने और अलग उपभूखंडों दोनों के परमाणु तीव्रता वितरण की साजिश प्रदान करेगा ।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि फिजी संवाद में नियमित अभिव्यक्ति में एंड लेफ्टिनेंट;कॉलम एंड जीटी; समूहीय चर दर्ज किए गए थे, तो पंक्ति द्वारा तीव्रता वितरण का संकेत देने वाले भूखंड और कॉलम द्वारा यहां दिखाई देंगे(अनुपूरक फाइल 1:स्क्रीनशॉट 8)। यदि नमूने के विभिन्न हिस्सों में रोशनी और धुंधला स्थितियां स्थिर थीं, तो इन भूखंडों को स्पष्ट रूप से दो तीव्रता वाली चोटियों, एक मंद, डिप्लॉयड नाभिक के लिए लम्बे और टेट्राप्लाइड नाभिक के लिए एक उज्जवल, छोटा दिखाना चाहिए।
  7. इंट्रासैंपल भिन्नता के परिणामस्वरूप इस पैटर्न को पूरे-नमूना भूखंड में दिखाई नहीं देगा और पंक्ति, कॉलम या अन्य समूहीय चर द्वारा डिप्लोइड और टेट्राप्लॉयड चोटियों के स्थान में महान विविधता होगी। बाद के मामले में, इस भिन्नता(अनुपूरक फ़ाइल 1:स्क्रीनशॉट 9) के लिए खाते में समूह द्वारा अलग से चेकबॉक्स सामान्य की जांच करें।
  8. बटन की गणना Ploidy पर क्लिक करें(अनुपूरक फ़ाइल 1:स्क्रीनशॉट 9) । बटन प्लॉट अनुमानित प्लॉयडी वितरणपर क्लिक करें । रेखांकन सही करने के लिए खाली खिड़कियों में दिखाई देगा। सामान्यीकृत पूरे नमूना ग्राफ में, दो-पीक पैटर्न दिखाई देना चाहिए यदि यह पहले नहीं था।
  9. स्लाइडर्स(पूरक फ़ाइल 1:स्क्रीनशॉट 9) का उपयोग करके डिप्लोइड और टेट्राप्लॉयड दोनों चोटियों को एक दूसरे और आउटलर्स से अलग करने के लिए थ्रेसहोल्ड का चयन करें। नीचे स्क्रॉल करें। बटन की गणना Ploidy और नाभिक पर क्लिक करें(अनुपूरक फ़ाइल 1:स्क्रीनशॉट 10) ।
  10. बटन प्लॉट पर क्लिक करें और परिणाम फ़ोल्डर में सहेजें। चयनित परिणामों में सहेजा गया प्लॉट फ़ोल्डर भी इस इंटरैक्टिव विंडो(पूरक फ़ाइल 1:स्क्रीनशॉट 10) में दिखाई देगा।

Representative Results

कार्डियोमायोसाइट्स ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार अलग-थलग थे। इस विधि का उपयोग करके, हम आम तौर पर समान रूप से अकेले कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करते हैं जो गैर-कार्डियोमायोसाइट कोशिकाओं(चित्रा 1ए)को दूषित किए बिना अपेक्षाकृत शुद्ध होते हैं। कार्डियोमायोसाइट्स को उनकी विशेषता आकार और birefringence के कारण उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत आसानी से पहचाना जाता है। इस तकनीक को लागू करने के लिए आसान है और तुलनीय कार्डियोमायोसाइट पैदावार और गुणवत्ता(चित्रा 1बी)के साथ विभिन्न अलगाव से लगातार परिणाम प्रदान करता है। अलग कार्डियोमायोसाइट्स आगे के उपयोग से पहले कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

उपरोक्त प्रोटोकॉल के अनुसार अलग-थलग किए गए कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे कार्डियोमायोसाइट आकार, कार्डियोमायोसाइट प्लॉइडी और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री को मापने के लिए। एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, हम बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल के अनुसार अलग कार्डियोमायोसाइट्स को विशिष्ट प्रोटीन के स्थानीयकरण का पता लगाने या कार्डियोमायोसाइट डीएनए प्रतिकृति का पता लगाने के लिए क्लिक रसायन विज्ञान के लिए एंटीबॉडी और फ्लोरोक्रोम-कंजूगेटेड एजाइड्स का उपयोग करके दाग लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने α-ऐक्टिनिन को पहचानने वाले एंटीबॉडी के साथ कार्डियोमायोसाइट्स को सरकोमर्स(चित्रा 2ए)के विशिष्ट जेड-लाइन धुंधला पैटर्न को दिखाने के लिए दाग दिया। एक अलग प्रयोग में, हमने फिक्स्ड कार्डियोमायोसाइट्स को अलग-थलग करने से पहले चूहों को थायरिडीन एनालॉग 5-एथिनाइल-2'-डिऑक्सीयूरिडीन (एडयू) प्रशासित किया। कार्डियोमायोसाइट अलगाव के बाद, हमने मानक प्रोटोकॉल13का उपयोग करके शामिल एडु के लिए दाग लगाया, और कार्डियोमायोसाइट्स का पता लगाने में सक्षम थे जो या तो मोनोन्यूक्लिड, बाइन्यूक्लिटेड और त्रिन्यूक्लिकेटेड कार्डियोमायोसाइट्स(चित्रा 2बी)में एस चरण से गुजरे थे।

अलगाव विधि की उपयोगिता को और विस्तारित करने के लिए, हमने एक पाइपलाइन विकसित की है जो एकीकृत डीएनए धुंधला के आधार पर कार्डियोमायोसाइट प्लॉइडी के मात्राकरण की अनुमति देती है। कोशिकाओं या नाभिक की प्लॉयडी स्थिति को मापने में सक्षम होने के लिए, हमें नाभिक और कार्डियोमायोसाइट्स को खंडित करने की आवश्यकता थी। चित्र 3 उस रणनीति का प्रतिनिधित्व दिखाता है जो हम व्यक्तिगत नाभिक की पहचान करने के लिए उपयोग करते थे। सबसे पहले, मूल छवि डीएनए दाग छवि(चित्रा 3ए)तीव्रता(चित्रा 3बी)के आधार पर दहलीज है । यहां, हम डीएनए के लिए दाग के लिए DAPI इस्तेमाल किया है, लेकिन किसी भी अंय परमाणु डाई है कि डीएनए सामग्री के साथ एक रैखिक संबंध से पता चलता है काम करेगा । कार्यक्रम फिजी की तीव्रता थ्रेसिंग विधियों में से किसी को चुना जा सकता है, लेकिन इस उदाहरण में ओत्सु की विधि का उपयोग किया गया था। परमाणु मास्क जो छवि के किनारे को छू रहे हैं या निर्दिष्ट न्यूनतम पिक्सेल क्षेत्र सीमा से छोटे हैं, उन्हें बाहर रखा गया है। फिर, एलिप्सेस परमाणु मास्क के लिए फिट हैं, व्यक्तिगत नाभिक को खंडित करते हैं। चित्रा 3सी मूल छवि पर मढ़ा इन अंडाकारों से पता चलता है। इसके बाद, मास्क में छेद भरे जाते हैं, और छवि के पिक्सेल को तब उन क्षेत्रों में विभाजित किया जाता है जिनके आधार पर वे सबसे अधिक समीपस्थ(चित्र 3डी)हैं। इन क्षेत्रों की सीमाओं का उपयोग परमाणु समूहों के माध्यम से लाइनें खींचने के लिए किया जाता है, परमाणु विभाजन प्रक्रिया(चित्रा 3ई)को खत्म करता है।

अगले चरण में कार्डियोमायोसाइट्स का पता लगाना शामिल है। कार्डियोमायोसाइट छवियों के लिए जो फ्लोरोसेंटली दाग कोशिकाओं(चित्रा 4ए)के आधार पर प्राप्त किए जाते हैं, यह प्रक्रिया नाभिक के लिए बहुत समान है। छवि को चयनित थ्रेसहोल्ड विधि द्वारा गणना की गई तीव्रता मूल्य के आधार पर थ्रेसहोल्ड किया जाता है, इस मामले में त्रिकोण विधि। पहचाने गए कार्डियोमायोसाइट मास्क जो छवि की सीमा को छू रहे हैं या एक निश्चित आकार से नीचे हैं, उन्हें बाहर रखा गया है और ठीक से खंडित कार्डियोमायोसाइट्स(चित्रा 4बी)प्रदान करने के लिए मास्क में छेद भरे जाते हैं। क्योंकि कार्डियोमायोसाइट्स में नाभिक की तुलना में अधिक अनियमित आकार होता है, इसलिए कार्डियोमायोसाइट क्लस्टर को सेगमेंट करने का कोई प्रयास नहीं किया जाता है। इसके बजाय, विश्लेषण चरण के दौरान इन समूहों को उनके उच्च न्यूनतम फेरेट के व्यास के आधार पर बाहर रखा गया है। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों से विभाजन थोड़ा अलग ढंग से आय । सबसे पहले, मूल उज्ज्वल क्षेत्र छवि(चित्रा 4सी)को सोबेल एज फिल्टर के साथ संसाधित किया जाता है। यह फ़िल्टर छवि के भीतर प्रत्येक पिक्सेल के ढाल के पूर्ण मूल्य की गणना करता है। तेजी से परिवर्तन वाले क्षेत्रों में पिक्सेल को छवि के चिकनी क्षेत्रों में उच्च मूल्य और पिक्सेल प्राप्त होते हैं। इस किनारे फ़िल्टर की गई छवि को त्रिकोण विधि का उपयोग करके तीव्रता से किनारा किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप नकाबपोश कार्डियोमायोसाइट्स(चित्रा 4डी)होते हैं। इन अत्यधिक अनियमित मास्क को तब चिकना किया जाता है और 2 पिक्सल के त्रिज्या के साथ एक सर्कल का उपयोग करके रूपात्मक समापन के माध्यम से एक साथ जोड़ा जाता है, जो छवि में सभी सफेद क्षेत्रों में भरता है जहां सर्कल काले क्षेत्र(चित्रा 4ई)को ओवरलैपिंग के बिना फिट नहीं कर सकता है। अंत में, मास्क में छेद भरे जाते हैं, सीमा को छूने वाले क्षेत्रों को बाहर रखा जाता है, और छोटे कणों को हटा दिया जाता है, कार्डियोमायोसाइट सेगमेंटेशन प्रक्रिया(चित्रा 4एफ) को खत्म किया जाताहै।

उल्लिखित विभाजन रणनीति का उपयोग करके, हम तब व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स की नाभिक स्थिति निर्धारित कर सकते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हमने शुरुआती प्रसवोत्तर समय-बिंदुओं पर आउटब्रेड सीडी-1 चूहों के दिलों से अलग कार्डियोमायोसाइट्स की नाभिक स्थिति निर्धारित की। नवजात चूहों के दिल (जीवन के पहले दिन) से पता चला है कि उस बिंदु पर कार्डियोमायोसाइट्स के बहुमत मोनोन्यूक्लिटेड(चित्रा 5:नवजात) हैं । मोनोन्यूक्लिड कार्डियोमायोसाइट्स की यह उच्च आवृत्ति किशोर चूहों (2-सप्ताह पुराने) में बहुत कम है, जहां मोनोन्यूक्लिड कार्डियोमायोसाइट्स कुल कार्डियोमायोसाइट आबादी का लगभग 25% बनाते हैं(चित्रा 5:किशोर)। अंत में, हम कार्डियोमायोसाइट्स के भीतर व्यक्तिगत नाभिक की प्लॉयडी स्थिति को माप सकते हैं, और यह निर्धारित कर सकते हैं कि वे डिप्लॉय या टेट्राप्लाइड हैं या नहीं। इन परिणामों से किशोर चूहों(चित्र 6)में टेट्राप्लाइड नाभिक की उच्च आवृत्ति दिखाई देता है ।

Figure 1
चित्रा 1: निर्धारण के बाद कार्डियोमायोसाइट अलगाव की दक्षता। (ए)नाभिक दिखाने के लिए डीएपीआई के साथ दाग अलग कार्डियोमायोसाइट्स की प्रतिनिधि छवि । (DAPI (नीला), ब्राइटफील्ड (ग्रे)) (ख)3 महीने की उम्र में अलग-अलग चूहों से अलग कार्डियोमायोसाइट्स की यील्ड। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: अलग कार्डियोमायोसाइट्स की इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। (A)α-ऐक्टिनिन (α-ऐक्टिनिन (लाल) और DAPI (ब्लू)) के लिए दाग कार्डियोमायोसाइट्स की प्रतिनिधि छवि । (ख)कार्डियोमायोसाइट्स शामिल एडू (लाल) और DAPI (नीला) के लिए दाग । प्रतिनिधि कार्डियोमायोसाइट्स जो मोनोन्यूक्लिटेड (बाएं), द्विन्यूलेटेड (मध्य) और त्रिन्यूलेटेड (दाएं) और एडु पॉजिटिव दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: परमाणु विभाजन के लिए रणनीति । (A)ओरिजनल DAPI चैनल इमेज। (ख)थ्रेसहोल्ड इमेज (इस उदाहरण में, ओत्सु की विधि का उपयोग किया गया था)। (ग)मास्क जो मूल DAPI दाग छवि पर मढ़ा दहलीज छवियों से पहचाने गए थे । (घ)परमाणु मास्क पर आधारित वोरोनोई टेसेलेशन । (ई)अंतिम खंडित नाभिक, विभाजन समूहों के साथ प्रकाश डाला । स्केल बार = 100 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कार्डियोमायोसाइट सेगमेंटेशन के लिए रणनीति। (A)ओरिजनल फ्लोरोसेंट ट्रोपोनिन मैंने कार्डियोमायोसाइट इमेज को दाग दिया । (ख)त्रिकोण-दहलीज छवि, छेद भरने के बाद और छोटी वस्तुओं और सीमा को छूने वालों को छोड़कर । (C)मूल उज्ज्वल क्षेत्र कार्डियोमायोसाइट छवि(D)एज-फ़िल्टर और त्रिकोण-थ्रेसहोल्ड कार्डियोमायोसाइट इमेज(ई)एज-फ़िल्टर की गई छवि दो पिक्सल(एफ)छेद भरने के बाद और छोटी वस्तुओं को छोड़कर और सीमा को छूने वालों को छोड़कर एक ही छवि के त्रिज्या के साथ रूपात्मक बंद होने के बाद । स्केल बार = 100 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: नाभिक की संख्या के आधार पर कार्डियोमायोसाइट्स का वर्गीकरण। नवजात दिलों (1 दिन पुराने) किशोर दिलों (14 दिन पुराने) की तुलना में अधिक मोनोन्यूक्लिड कार्डियोमायोसाइट्स होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: नाभिक प्रति कार्डियोमायोसाइट डीएनए सामग्री का वितरण। नवजातों (बाएं) में, मोनोन्यूक्लिड सीएम नाभिक का 13.5% टेट्राप्लॉइड होता है और 11.9% द्विन्यूक्लिड सीएम नाभिक टेट्राप्लॉइड होते हैं। किशोरों (दाएं) में, मोनोन्यूक्लिड सीएम न्यूक्लियी के 33.9% टेट्राप्लाइड हैं और 31.2% द्विन्यूक्लिड सीएम नाभिक टेट्राप्लाइड हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल 1: सॉफ्टवेयर स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें) ।

अनुपूरक फाइल 2: AnalyzeNucleation.py। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें) ।

अनुपूरक फाइल 3: विश्लेषणमुलिष्ट सेवाकार्वर.आर. कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें) ।

Discussion

चूंकि कार्डियोमायोसाइट्स को संस्कृति में नहीं रखा जा सकता है, इसलिए प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना महत्वपूर्ण है ताकि वे अपनी वास्तुकला और कार्य11का अध्ययन कर सकें। इसलिए, हृदय क्षेत्र में कार्डियोमायोसाइट आइसोलेशन तकनीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। यदि लक्ष्य कार्डियोमायोसाइट्स के कार्यात्मक पहलुओं को निर्धारित करना है, तो व्यवहार्य कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना महत्वपूर्ण है। इन लाइव कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग अलग कार्डियोमायोसाइट्स पर इम्यूनोदाता करने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, लाइव कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने की तकनीक को अनुकूलित करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और यहां तक कि सबसे अच्छी तकनीक आमतौर पर केवल 60-65% लाइव रॉड के आकार के कार्डियोमायोसाइट्स की उपज होती है, और शेष कार्डियोमायोसाइट्स सभी को मार रहे हैं और मर रहे हैं या मृत11,,12हैं। यहां, हमने एक तकनीक विकसित की है जो शोधकर्ताओं को पहले दिल को ठीक करने की अनुमति देगी, और फिर कार्डियोमायोसाइट्स को कुशलता से अलग कर देगी। यह नया प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में रॉड के आकार के कार्डियोमायोसाइट्स की बहुत अधिक पैदावार के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हमने नाभिक और प्लॉयडी के आधार पर कार्डियोमायोसाइट्स को स्वचालित रूप से वर्गीकृत करने के लिए एक इमेजिंग विश्लेषण मंच विकसित किया। इन नए तरीकों के साथ, समूह विभिन्न प्रोटीन के लिए कार्डियोमायोसाइट्स को दाग सकते हैं, और हृदय की पुनर्योजी क्षमता के लिए किराए के रूप में कार्डियोमायोसाइट प्लॉयडी और नाभिक की स्थिति का अध्ययन कर सकते हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सीधा है, और बिना किसी उन्नत उपकरण के किया जा सकता है। कोलेजनेज़ की मात्रा और पाचन के लिए इनक्यूबेशन समय कोलेजनेज़ लॉट के आधार पर भिन्न हो सकता है, और कंपनी इसे प्रदान करती है। हमने कोलेजन प्रकार 2 का उपयोग किया, क्योंकि इसका उपयोग लाइव कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करने के लिए दिल को पचाने के लिए सबसे व्यापक रूप से किया जाता है। हमारी टिप्पणियों के आधार पर, हमने निर्धारित किया है कि इनक्यूबेशन रातोंरात 60 मिलीग्राम/ हमारे पास कभी भी अतिचुनाव का मुद्दा नहीं रहा है क्योंकि इंट्रासेलुलर प्रोटीन तय किए जाते हैं और बाह्राश कोलेजन के रूप में सुलभ नहीं होते हैं। हालांकि, अगर दिल ठीक से पचा नहीं है, और अधिक जोरदार त्रिभुज की जरूरत हो सकती है, जो कतरनी तनाव के कारण सेल विखंडन का कारण बनता है । इस प्रकार, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि त्रिकोण पर जाने से पहले दिल ठीक से पचा जाए। पाचन की डिग्री का आकलन करने के लिए संदंश के साथ निचोड़कर दिल की कठोरता का परीक्षण किया जा सकता है। कोलेजनेज़ के साथ इनक्यूबेशन के बाद, दिल कम कठोर और अलग आंसू करने के लिए आसान होना चाहिए। अन्य प्रकार के कोलेजनेस का भी उपयोग किया जा सकता है। पिछली रिपोर्ट में कोलेजनेस बी और डी14के संयोजन का इस्तेमाल किया गया था ।

इसके अलावा, हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग हृदय15में कार्डियोमायोसाइट्स की कुल संख्या का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यदि लक्ष्य दिल से सभी कार्डियोमायोसाइट्स को प्राप्त करना और निर्धारित करना है, तो कोलेजन समाधान (जैसे, 3-7 दिन) में समय की विस्तारित अवधि के लिए दिलों को पैदा करना महत्वपूर्ण है, जहां कोलेजनेस समाधान को दिन में एक बार मंगाया जाना चाहिए। यह कार्डियोमायोसाइट उपज पर ट्रिट्यूशन की डिग्री के प्रभाव को नष्ट करके अलगाव दक्षता में विसंगतियों को कम करेगा।

प्लॉयडी को मापने के लिए डीएनए सामग्री का उपयोग नया नहीं है, और दशकों से प्रवाह साइटोमेट्री में इसका उपयोग किया जाता रहा है। हाल ही में, यह दिखाया गया था कि माइक्रोस्कोपी इसी तरह नाभिक16प्रति डीएनए सामग्री का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, हमने इस रणनीति को नवगठित कार्डियोमायोसाइट्स के लिए किराए के रूप में कार्डियोमायोसाइट नाभिक की प्लॉयडी को मापने के लिए लागू किया। कार्डियक रीजनरेशन के क्षेत्र में हठधर्मिता यह है कि केवल मोनोन्यूक्लिड, डिप्लॉयड कार्डियोमायोसाइट्स ही साइटोकिनेसिस से गुजर सकते हैं और नए कार्डियोमायोसाइट्स को जन्म दे सकते हैं। चूंकि वीवो में नए कार्डियोमायोसाइट गठन को मापना बहुत चुनौतीपूर्ण है, इसलिए डीएनए न्यूक्लियोटाइड एनालॉग के प्रशासन के बाद पीछा किए गए कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना और मोनोन्यूक्लिड के स्तर का निर्धारण करना, डिप्लॉयड कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग हृदय की क्षमता के सन्निकटन के रूप में किया गया है ताकि नए कार्डियोमायोसाइट्स17उत्पन्न हो सकें। यहां, हम इमेजजे के लिए एक मैक्रो प्रदान करते हैं जो कार्डियोमायोसाइट प्लॉयडी के आसान मात्राकरण की अनुमति देता है। जी 1 शिखर के स्थान का सटीक अनुमान प्राप्त करने के लिए कम से कम, 500 नाभिक को मापा जाना चाहिए। यदि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती जाती है कि चित्रित प्लेट के हर कुएं में धुंधला और इमेजिंग की स्थिति सुसंगत हो, तो पूरे नमूने में केवल 500 नाभिक को चित्रित करने की आवश्यकता है, अन्यथा, प्रति छवि समूह18, 19 में,19500 नाभिक होने की आवश्यकता है। दो-आयामी छवियों का उपयोग करते समय, वास्तविक कार्डियोमायोसाइट नाभिक से अनुवर्ती कोशिकाओं से नाभिक को अलग करने में कठिनाई होती है। इस तरह की अनुयायी कोशिकाओं के परिणामस्वरूप बहुनीय कोशिकाओं की मात्रा का अधिक अनुमान लगाया जा सकता है और टेट्राप्लाइड कार्डियोमायोसाइट नाभिक आबादी के माप की सटीकता में कमी आ सकती है। इस समस्या को हल करने के लिए एक संभावित रणनीति कार्डियोमायोसाइट न्यूक्लियर मार्कर पीसीएम16,20का उपयोग करना होगा । हालांकि, हमें ठीक से तय कोशिकाओं या ऊतकों पर विश्वसनीय PCM1 धुंधला प्राप्त करने में कठिनाइयों का पड़ा है।

एक और संभावित सीमा यह है कि कुछ परमाणु दाग छवियों में महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि साइटोप्लाज्मिक धुंधला हो सकता है, जो व्यापक प्रीप्रोसेसिंग के बिना फिजी के तरीकों में निर्मित का उपयोग करके उचित थ्रेसहोल्डिंग को रोकता है। इसके अलावा, प्लॉयडी अनुमानों में इस पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस का अनियमित योगदान उनकी सटीकता को कम करता है। इसके अलावा, यदि कोशिकाओं को पर्याप्त समय के लिए डीएनए-धुंधला समाधान में नहीं छोड़ा जाता है, तो फ्लोरोसेंट डाई नाभिक के भीतर संतृप्ति के लिए बाध्य नहीं होगा और परमाणु एकीकृत तीव्रता और डीएनए सामग्री के बीच एक रैखिक संबंध की धारणा अब सटीक नहीं होगी।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सॉफ्टवेयर कार्डियोमायोसाइट क्लस्टर को सेगमेंट नहीं कर सकता है और इसके बजाय उन्हें विश्लेषण से हटा देता है। इसलिए, अपेक्षाकृत कम घनत्व (जैसे, 1000 कोशिकाओं/सेमी2)पर कार्डियोमायोसाइट्स को बीज करना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सॉफ्टवेयर दो कार्डियोमायोसाइट्स के बीच अंतर नहीं कर सकता है जो अंत से अंत तक लाइन में खड़ा है और लंबे समय तक, एकवचन कार्डियोमायोसाइट्स। इस प्रकार के समूह गलती से बहुनीय अनुमानों को बढ़ा सकते हैं ।

यद्यपि वर्णित विधि व्यवहार्य कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करने की अनुमति नहीं देती है और इस प्रकार गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं को मापने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है, यदि लक्ष्य इम्यूनोस्टेपिंग करना है, तो हमारा मानना है कि वर्णित विधि कार्डियोमायोसाइट्स की अधिक पैदावार और आकृति विज्ञान और प्रोटीन स्थानीयकरण के मामले में बेहतर गुणवत्ता के साथ मौजूदा प्रोटोकॉल से बेहतर है। अंत में, वर्णित विधि का उपयोग कार्डियोमायोसाइट्स को नैदानिक नमूनों से अलग करने के लिए किया जा सकता है14,21. हमारा मानना है कि वर्णित पद्धति विभिन्न शोधकर्ताओं को उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करने और नए कार्डियोमायोसाइट गठन के लिए किराए के रूप में नाभिक और प्लॉयडी को मापने में मदद कर सकती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

जेएचवीबी को एनआईएच, पुनर्योजी चिकित्सा मिनेसोटा और हार्टवेल फाउंडेशन से एक व्यक्तिगत बायोमेडिकल रिसर्च अवार्ड से अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 wells plate for imaging Corning 3340 We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging
Alpha actinin Novus Biologicals NBP1-32462 This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres
Blunt scissors Fine Scissor Tools 14072-10 We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart
C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
CD-1 mice Charles river 22 Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
Collagenase 2 Worthington LS004177 For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma-Aldrich 203165-10G For edu staining
Cy5 Picolyl Azide Click Chemistry Tools 1177-25 Azide used for edu staining
Cytation3 BioTek - Used for automated imaging for DNA analysis
DAPI Life Technologies D3571 DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water.
donkey anti-mouse IgG-Alexa568 Life Technologies A10037 Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes
Forceps ROBOZ RS-5137 We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144212 To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5
ImageJ imagej.net/Fiji/Downloads - Used for analyzing images
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich 255564-100G For edu staining
Needle for infusion TERUMO SV*23BLK We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection
Nikon A1R HD25 Nikon - Used to take confocal images of alpha actinin staining
Nylon mesh 200 micron Elko filtering 03-200/54 Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied)
Nylon mesh 400 micron Elko filtering 06-400/38 Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes
Phosphate Buffered Saline (1X) Corning 21-040-CV This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it
Potassium chloride, Granular Mallinckrodt 6858 Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature
R r-project.org - Used for data analysis of the measurements obtained from images
Tris Base Fisher Scientific BP152-5 Used to buffer EdU staining reaction

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जीव विज्ञान अंक 164 दिल कार्डियोमायोसाइट अलगाव प्लॉयड एनालिसिस इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री स्वचालित छवि विश्लेषण
इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और प्लॉयडिक एनालिसिस के लिए फिक्स्ड हार्ट्स से कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव
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Yücel, D., Solinsky, J., van… More

Yücel, D., Solinsky, J., van Berlo, J. H. Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (164), e60938, doi:10.3791/60938 (2020).

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