يمكن استخدام الاقترانات التقليدية BODIPY للخلية الحية جزيء واحد المجهري ة توطين (SMLM) من خلال استغلال بهم تشكيل عابرة، والأحمر تحول الدولة الخافتات. نحن نقدم بروتوكول SMLM الأمثل لتتبع وحل الدهون المحايدة دون الخلوية والأحماض الدهنية في الثدييات الحية وخلايا الخميرة على مقياس طول nanoscopic.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التقليدية BODIPY Conjugates ليعيش الخلية فائقة القرار المجهر وتتبع جزيء واحد
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تقنيات المجهر توطين جزيء واحد (SMLM) التغلب على حد الحيود البصري من المجهر الفلوري التقليدية ويمكن حل الهياكل داخل الخلايا وديناميات الجزيئات الحيوية مع ~ 20 نانومتر الدقة. ومن الشروط الأساسية لـ SMLM الفلوروفوريات التي تنتقل من حالة مظلمة إلى حالة فلورية من أجل تجنب التداخل الزمني للنقاط التي تعمل على نشر النقاط في كل من آلاف إطارات الحصول على البيانات. BODIPYs هي الأصباغ الراسخة مع العديد من المتجانسات المستخدمة في المجهر التقليدي. ينتج عن التكوين العابر للديمنات الأرضية ذات الحالة الأرضية التي تحولت من BODIPY (DII)انبعاثات جزيء واحد مشرقة تمكن من إجراء المجهر توطين جزيء واحد (SMLM). هنا نقدم بروتوكول بسيط ولكن تنوعا لSMLM مع الاقتران اتبوبي التقليدية في الخميرة الحية وخلايا الثدييات. ويمكن استخدام هذا الإجراء للحصول على صور فائقة الدقة وتتبع حالات بودي ديالثاني واحدة لاستخراج المعلومات الزمنية spatio من الاقترانات BODIPY. نحن نطبق هذا الإجراء لحل قطرات الدهون (LDs) ، والأحماض الدهنية ، والليسوسومافي ة الخميرة الحية وخلايا الثدييات على مقياس طول النانسكوبي. وعلاوة على ذلك، ونحن نظهر قدرة التصوير متعددة الألوان مع الأصباغ BODIPY عند استخدامها جنبا إلى جنب مع تحقيقات الفلورسنت الأخرى. تظهر نتائجنا التمثيلية التوزيع المكاني التفاضلي وحركة الأحماض الدهنية BODIPY والدهون المحايدة في الخميرة في ظل ظروف التغذية والصيام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول الأمثل لSMLM مع مئات من المجمعات المتاحة تجاريا BODIPY وهو مورد مفيد لدراسة العمليات البيولوجية على مقياس النانو أبعد بكثير من تطبيقات هذا العمل.
المقدمة
ظهرت تقنيات المجهر المجهري ة ذات الجزيء الواحد (SMLM) مثل المجهر الضوئي لإعادة البناء العشوائي (STORM) والمجهر التوطين المنشط بالصور (PALM) كطرق لتوليد صور فائقة الدقة مع معلومات تتجاوز حد الحيود البصري لآبي1،2 ولتتبع ديناميكيات الجزيئات الحيوية المفردة3،4. أحد متطلبات المسابير المتوافقة مع SMLM هو القدرة على التحكم في عدد الفلوروبورورس النشط في أي وقت لتجنب التداخل المكاني لوظائف انتشار النقاط (PSF). في كل من الآلاف من إطارات الحصول على البيانات ، يتم تحديد موقع كل فلوروفوريس الفلورسنت مع ~ 20 نانومتر الدقة عن طريق تركيب وظيفة انتشار نقطة المقابلة. تق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: لاستنساخ الخميرة ووضع العلامات الذاتية يرجى الرجوع إلى المنشور الأخير10.
1. إعداد عينات خلايا الخميرة للتصوير
- إعداد ثقافة السائل بين عشية وضحاها من سلالة الخميرة w303. باستخدام عصا خشبية معقمة، بقعة كمية صغيرة من خلايا الخميرة من لوحة أجار التي تحتوي على استخراج الخميرة-peptone-dextrose في أنبوب ثقافة مع ~ 2 مل من dextrose الاصطناعية كاملة (SCD) المتوسطة. احتضان الأنبوب بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز في 270 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
- إجراء تخفيف 1:50 صباحي للخلايا في SCD. استمر في استزراع الخلايا المخففة لمدة 4 ساعة عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز 270 دورة في الدقيقة ، مما يسمح للخل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، نقدم إعداد عينة الأمثل ، وحيازة البيانات وتحليلها إجراءات لSMLM باستخدام الاقتران BODIPY على أساس البروتوكول أعلاه(الشكل 1A). لإثبات مثال على سير العمل للحصول على وتحليل البيانات SMLM، ونحن توظيف BODIPY (493/503) في الخميرة لحل LDs تحت حد الحيود البصري(الشكل 1B-F). أمثلة على طرق التصوير متعددة الألوان المختلفة من BODIPY بالتزامن مع تحقيقات أخرى مثل GFP ، يتم عرض mEos2 في الشكل 2. نحن التلاعب الحالة الأيضية في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول ، أظهرنا كيف يمكن استخدام الاقترانات التقليدية BODIPY للحصول على صور SMLM مع ترتيب تحسن الحجم في الاستبانة المكانية. ويستند هذا الأسلوب على استغلال الحالات التي تم الإبلاغ عنها سابقا، والأحمر تحول DII من الأصباغ بودي التقليدية، والتي تشكل بشكل عابر من خلال لقاءات ثنائية الجزيئية. يمكن أن تكون هذه الدول متحمسة على وجه التحديد واكتشفت مع الأطوال الموجية الحمراء المتغيرة ومتناثرة وقصيرة الأجل بما فيه الكفاية لSMLM. من خلال ضبط تركيز مونومرات BODIPY جنبا إلى جنب مع معلمات الليزر ، يمكن تحقيق كثاف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
وقد دعم البحث الوارد في هذا المنشور المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R21GM127965.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | أحماض دهنية خضراء تناظرية |
| BODIPY C12 أحمر | ThermoFisher | D3835 | الأحماض الدهنية الحمراء التناظرية |
| BODIPY (493/503) | ThermoFisher | D3922 | علامة دهون محايدة |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | الخلية على سطح الزجاج |
| مزيج متسرب كامل بدون قاعدة نيتروجين | البيولوجية | الأمريكية D9515 | ل SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | مصدر الكربون ل SCD |
| ثمانية آبار | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| ثمانية بئر ، Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525 / 50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595 / 50 | Chroma | مرشح ممر النطاق | |
| ET610 / 75 | مرشح Chroma | Bandpass | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | مصل Gibco | 26140079 | |
| FF652 | Semrock | Beam الخائن | |
| FF731 / 137 | Semrock | Bandpass | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | وسط |
| ثقافة الخلاياHal4000 | مختبر Zhuang ، برنامج الحصول على البيانات بجامعة | ||
| Ixon89Ultra DU-897U | كاميرا Andor | EMCCD للكشف عن الفوتون | |
| ليزر 405 ، 488 ، 561 ، 640 نانومتر | CW-OBIS | للإثارة | |
| Insight3 | Zhuang Lab ، جامعة | برنامج توطين جزيء واحد | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | الأحماض الأمينية المطلوبة |
| لزراعة الخلايا الحل تصوير الخلايا الحية | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy علامة الجسيم الليزومي القائم على Bodipy |
| خلايا الثدييات ATCC U2OS (ماناساس ، فيرجينيا) | الدكتور يوخن مولر (جامعة مينيسوتا) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | نيكون | الهدف | |
| البنسلين ستربتومايسين | جيبكو | 15140-122 | المضادات الحيوية |
| بيروفات الصوديوم | جيبكو | 11360-070 | مكمل لزراعة الخلايا |
| T562lpxr | مقسم شعاع | الكروما | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | تفكك الخلية الملتصقة |
| W303 MATa سلالة | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | سلالة الخميرة الأبوية |
| الخميرة النيتروجينية | Sigma-Aldrich | Y1250 | قاعدة نيتروجين بدون أحماض أمينية |
| zt405/488/561/640rdc | مرآة ثنائية اللون Chroma | Quadband |
المراجع
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
