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Articolo metodologico
Il DNA ambientale (eDNA) viene tipicamente catturato da campioni d'acqua utilizzando la precipitazione, la filtrazione o la flocculazione dell'alcol. Qui viene presentato un protocollo alternativo che utilizza il cloruro di lantanio per consentire la raccolta di acidi nucleici disciolti e legati al particolato da campioni d'acqua contenenti cellule eucariotiche, cellule procariotiche e virus.
L'analisi del DNA ambientale (eDNA) è diventata un approccio ampiamente utilizzato per la risoluzione dei problemi nella gestione delle specie. L'obiettivo è il rilevamento di specie criptiche, comprese le specie invasive e (o) a rischio, tipicamente raggiunto testando l'acqua e i sedimenti per la presenza di firme caratteristiche del DNA. Sono necessarie procedure affidabili ed efficienti per la cattura dell'eDNA, in particolare quelle che possono essere eseguite facilmente sul campo da personale con formazione limitata e da cittadini scienziati. La cattura dell'eDNA mediante filtrazione a membrana è attualmente ampiamente utilizzata. Questo approccio presenta problemi intrinseci che includono la scelta del materiale e della porosità del filtro, l'incrostazione del filtro e il tempo necessario in loco per l'esecuzione del processo. La flocculazione offre un'alternativa che può essere facilmente implementata e applicata a regimi di campionamento che si sforzano di coprire ampi territori in un tempo limitato.
Prima della metà degli anni 2000, il termine "DNA ambientale" era generalmente usato per riferirsi al DNA ottenuto da microbi dell'acqua e del suolo, anche se un certo uso per il rilevamento di DNA umano e animale ai fini del monitoraggio della fonte fecale o del rilevamento di specie non autoctone era iniziato 1,2,3. Attualmente, il DNA ambientale è generalmente utilizzato per descrivere il DNA proveniente da cellule staccate da organismi eucarioti e l'analisi di questo DNA è diventata uno strumento di gestione ampiamente utilizzato. L'obiet....
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1. Decontaminazione delle apparecchiature e preparazione dei reagenti di flocculazione
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Otto campioni d'acqua da 500 mL (450 mL ciascuno) prelevati da un acquario che ospita due tartarughe dipinte orientali (Chrysemys picta picta) sono stati utilizzati per preparare l'eDNA utilizzando il protocollo descritto. Altri otto campioni d'acqua da 500 mL sono stati filtrati su filtri in fibra di vetro da 47 mm con porosità di 1,5 μm senza legante e l'eDNA è stato estratto utilizzando lo stesso metodo di estrazione utilizzato per il protocollo di flocculazione. Il DNA preparato con entrambi i metodi è stato.......
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Sebbene questa tecnica sia semplice, alcuni passaggi sono fondamentali per il successo. La raccolta e il trasferimento dei fiocchi devono essere effettuati completamente per non perdere il DNA. Il materiale residuo deve essere raccolto mediante risciacqui strategici. Il protocollo descritto utilizza un kit di estrazione del DNA commerciale per la lavorazione finale del materiale flocculato. Altri metodi di estrazione possono avere prestazioni simili o superiori, ma le modifiche di questa.......
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L'autore non ha nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato completato con il finanziamento dell'U.S. Geological Survey.
Qualsiasi uso di nomi commerciali, aziendali o di prodotti è solo a scopo descrittivo e non implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Disponibile da diverse fonti | ||
| 1 x tampone TE, pH 8,0 | Disponibile da diverse fonti | ||
| Provette da centrifuga coniche da 15 ml Bottiglie quadrate | in PET monouso | ||
| da 16 once | Riutilizzabili con pulizia e decontaminazione | ||
| Tappo in polipropilene 38/400 con sensibile alla pressione Fodera: | lasciare i cappucci attaccati liberamente fino al momento dell'uso. Chiudere bene per sigillare il rivestimento sensibile alla pressione. | ||
| Provette da centrifuga coniche da 50 mL Soluzione | monouso | ||
| acido citrico al 6% | Da utilizzare per rimuovere i depositi minerali dai flaconi dei campioni riutilizzabili. | ||
| Kit per microbi fecali/del suolo | Utilizzare la resina o la colonna | ||
| Cloruro di lantanio (III) eptaidrato | 100 mM Soluzione | ||
| Pompa peristaltica CC | Qualsiasi pompa peristaltica andrà bene, o può essere sifonata | ||
| Trasportatore di poliacrile | 10% poliacrilammide | ||
| Bicarbonato | di sodio1 M, filtro sterilizzato e conservato a temperatura |
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