Axonal Transport van Organellen in Motor Neuron Culturen met behulp van Microfluidic Chambers System

Summary

Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van motorneuronen. In dit protocol bieden we een gedetailleerde methode voor het bijhouden van het axonale transport van zure compartimenten en mitochondriën in motorneuron axonen met behulp van microfluïdische kamers.

Abstract

Motorneuronen (MNs) zijn sterk gepolariseerde cellen met zeer lange axonen. Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van MN, bij te dragen aan neuronale groei, ontwikkeling en overleving. We beschrijven een gedetailleerde methode voor het gebruik van microfluïdische kamers (MPC's) voor het bijhouden van axonal transport van fluorescerend gelabelde organellen in MN axons. Deze methode is snel, relatief goedkoop, en zorgt voor de monitoring van intracellulaire signalen in ruimte en tijd. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor: 1) Fabricage van polydimethylsiloxane (PDMS) MFP's; 2) Plating van ventrale ruggenmergexplanten en MN gescheiden cultuur in MPC's; 3) Etikettering van mitochondriën en zure compartimenten, gevolgd door live confocale verbeelding; 4) Handmatige en semi-geautomatiseerde axonale transportanalyse. Ten slotte tonen we een verschil aan in het transport van mitochondriën en zure compartimenten van HB9::GFP ventrale ruggenmerg explant axonen als een bewijs van de geldigheid van het systeem. Al met al biedt dit protocol een efficiënt hulpmiddel voor het bestuderen van het axonale transport van verschillende axonale componenten, evenals een vereenvoudigde handleiding voor MFC-gebruik om ruimtelijke experimentele mogelijkheden te helpen ontdekken.

Introduction

MNs zijn sterk gepolariseerde cellen met lange axonen, die tot een meter lang zijn bij volwassen mensen. Dit fenomeen vormt een cruciale uitdaging voor het onderhoud van MN-connectiviteit en -functie. Bijgevolg zijn MN's afhankelijk van een goed transport van informatie, organellen en materialen langs de axonen van hun cellichaam naar de synaps en terug. Verschillende cellulaire componenten, zoals eiwitten, RNA en organellen worden regelmatig door de axonen geshuttled. Mitochondriën zijn belangrijke organellen die routinematig worden vervoerd in MNs. Mitochondriën zijn essentieel voor de juiste activiteit en functie van MN's, verantwoordelijk voor ATP-voorziening, cal....

Protocol

De verzorging en behandeling van dieren in dit protocol werd uitgevoerd onder toezicht en goedkeuring van het Universiteitscomité voor dierethiek van Tel Aviv.

1. Voorbereiding van het MFC

1. PDMS gieten in primaire mallen (Figuur 1)
   1. Koop of maak primaire mallen (wafers) volgens een gedetailleerd protocol⁹.
   2. Gebruik lucht onder druk om elk type vuil van het waferplatform te verwijderen voordat u overgaat tot de coatingstap. Het oppervlak van de wafers moet er glad en helder uitzien.
   3. Vul een container met 50 mL vloeibare stikstof. Bereid een 10 mL spuit....

Results

Volgens het beschreven protocol werden de embryonale HB9::GFP-ruggenmergexplanten gekweekt in MFC (figuur 4A). Explants werden gekweekt voor 7 dagen, toen axonen volledig gekruist in de distale compartiment. Mitotracker Deep Red en Lysotracker Rode kleurstoffen werden toegevoegd aan de distale en proximale compartimenten om de mitochondriën en zure compartimenten(figuur 4C)te labelen. Axonen in d.......

Discussion

In dit protocol beschrijven we een systeem om axonaltransport van mitochondriën en zure compartimenten in motorneuronen te volgen. Dit vereenvoudigde in vitro platform maakt nauwkeurige controle, monitoring en manipulatie van subcellulaire neuronale compartimenten mogelijk, waardoor experimentele analyse van lokale functies van motorneuron mogelijk is. Dit protocol kan nuttig zijn voor het bestuderen van MN-ziekten zoals ALS, om zich te concentreren op het begrijpen van het onderliggende mechanisme van axonale transportd.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm Fluodish – glass bottom dish	World Precision Instruments WPI	FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish	World Precision Instruments WPI	FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera	Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)	Sigma-Aldrich	C1768	stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X)	Thermo Fisher	17504044
BDNF	Alomone Labs	B-250	Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm	World Precision Instruments WPI	504530	For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm	World Precision Instruments WPI	504533	For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm	World Precision Instruments WPI	504534	For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1	Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	#A3311-100G	5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane	Sigma-Aldrich	#386529-100ML
CNTF	Alomone Labs	C-240	Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN-25	stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA	For epoxy mold preperation
DPBS 10X	Thermo Fisher	#14200-067	dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm	F.S.T	1125520
Epoxy Hardener	Trias Chem S.R.L	IPE 743	For epoxy mold preperation
Epoxy Resin	Trias Chem S.R.L	RP 026UV	For epoxy mold preperation
FIJI software	ImageJ
GDNF	Alomone Labs	G-240	Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X	Thermo Fisher	#35050-038
HB9:GFP mice strain	Jackson Laboratories	005029
HBSS 10X	Thermo Fisher	#14185-045	Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software	Andor
Iris scissors, curved, 10 cm	AS Medizintechnik	11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm	AS Medizintechnik	11-440-09
Laminin	Sigma-Aldrich	#L-2020
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Fisher	11415064
LysoTracker Red	Thermo Fisher	L7528
Mitotracker Deep-Red FM	Thermo Fisher	M22426
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope	Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution	Biological Industries	03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)	Sigma-Aldrich	#P8638	Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW Corning Corporation	#3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	T1426	stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade	F.S.T	15000-00
Yokogawa CSU X-1	Yokogawa