Summary
يصف هذا العمل طريقتين لدراسة تطور الأعضاء، إعداد زينوزراعة محسنة على الغشاء chorioallantoic (CAM) من أجنة الطيور التي تسمح لالأوعية الدموية من الأعضاء الجنينية المستزرعة وorganoids ورواية ثابتة z الاتجاه طريقة ثقافة الجهاز مع الشروط التجريبية المعدلة التي تسمح للتصوير البؤري الفاصل الزمني عالي الدقة.
Abstract
الثقافات الكلى الجنينية organotypic، وخاصة الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستمدة من الكلى الأعضاء، هي أدوات ممتازة لمتابعة العمليات التنموية ونمذجة أمراض الكلى. ومع ذلك، فإن النماذج محدودة بسبب نقص الأوعية الدموية والأداء الوظيفي. لمعالجة هذا، تم تطوير بروتوكول محسن لطريقة xenografting الخلايا والأنسجة إلى الغشاء chorioallantoic (CAM) لجنين الطيور للحصول على الأوعية الدموية واستعادة تدفق الدم. يتم تراكب الطعوم مع الخزانات الصغيرة المصنوعة حسب الطلب التي تقوم بإصلاح العينات إلى CAM وتزويدها بالوسط الثقافي الذي يحمي الطعوم من التجفيف. تسمح طريقة الثقافة المحسنة لـ xenografts بالنمو لمدة تصل إلى 9 أيام. كما تصف المخطوطة كيفية توفير الظروف المثلى للتصوير البؤري على المدى الطويل للعضويات الكلوية والثقافات الأورغنية باستخدام طريقة Z-Direction الثابتة (FiZD) المنشورة سابقًا. تعمل هذه الطريقة بلطف على ضغط عضو جنيني أو عضو بين غطاء زجاجي وغشاء في كمية كبيرة من الوسط وتوفر ظروفًا ممتازة للتصوير لمدة تصل إلى 12 يومًا. معا، تسمح هذه الطرق الأوعية الدموية وتدفق الدم إلى الاعضاء الكلوية وثقافات الكلى organotypic مع تحسين التصوير البؤري. الطرق الموصوفة هنا مفيدة للغاية لدراسة الوظائف الأساسية والتطبيقية للكلى على سبيل الكفو. وتنطبق كلتا الطريقتين على أنواع مختلفة من الأنسجة والأنسجة.
Introduction
أصبحت الثقافة الأورجة للكلى الجنينية نموذجا هاما لدراسة الكلية منذ عقود1،2،3. تمثل الرينالودات نظامًا نموذجيًا متقدمًا لدراسة تطور الكلى الصحية والمريضة4. العيب الرئيسي لكلا الطريقتين، ومع ذلك، هو أن أيا من الأسلوبين خلاصة الوظيفة الرئيسية للكلية: ترشيح الدم. الكلى والأوعية الدموية تتطور في الحلقات الكلوية وثقافات الأورجان وبمماثلة إلى مرحلة مبكرة في التنمية الفيفو; ومع ذلك ، فإن الكبيبات التي تشكلت في المختبر لا تزال وعائية5. الأوعية الدموية من الكلى الجنينية على سبيل لا ينف والأعضاء الكلوية وقد أظهرت سابقا في تجارب زرع فقط تحت في ظروف الجسم الحي. على سبيل المثال، زرع الأعضاء الكلوية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت كبسولة كلية فأرة يسمح بتطوير الكلى في الجهازية إلى مرحلة وظيفية6.
النهج الوسيط بين الثقافات المختبرية البحتة وفي طرق زرع الجسم الحي هو زرع xenotransplant إلى CAM من أجنة الطيور. وقد ثبت الأوعية الدموية من primordia الكلى الماوس سليمة سابقا باستخدام هذا النظام7,8. ومع ذلك ، فقد تبين أيضا أن الأوعية الدموية الكلوية في الكلى المورين المزروعة xenotransplanted مشتق من الإندوثيوليوم المضيف ، وليس الكسب غير المشروع9. وقد قللت هذه الملاحظة بشكل كبير من إمكانات النماذج الكيميرية (الثدييات الطيورية) للكلى الجنينية لدراسة تطور الأوعية الدموية الكلوية، لأن الظروف التجريبية كانت غير متساهلة لبقاء الخلايا البطانية المشتقة من المانحين.
عرض في الجزء الأول من هذا البروتوكول هو طريقة محسنة لزراعة الكلى الجنينية الماوس على CAM من بيض الطيور، والجمع بين الظروف البيئية الدقيقة من الثقافة organotypic وxenotransplant. التحسن الرئيسي في الأساليب السابقة هو أنه بدلا من وضع الكلى الجنينية الماوس والأعضاء الكلوية مباشرة على CAM، يتم تراكب منطقة زرع مع الخزانات الصغيرة نفاذية مليئة المتوسطة الثقافة التي تزود الأنسجة المزروعة مع المواد الغذائية وحمايتها من التجفيف. ويزداد معدل نجاح التجارب زيادة كبيرة وتتحسن ظروف تطوير الأوعية الدموية المستمدة من المانحين. تطبيق هذه الطريقة على الثقافات xenotransplant يؤدي إلى تطوير الأوعية الدموية الكبيبية تتألف من الخلايا الذاتية الذاتية من الكلى المانحة.
التحليل التفصيلي للمورفوجينيسيس الخلوي هو تطبيق مهم آخر لنماذج زراعة الكلى. أساليب ذكرت سابقا من الحصول على صورة الفاصل الزمني من الكلى الثقافات كافية فقط لتحليل مورفولوجيا العام ونقش الكلى الجنينية، ولكن ليس لتتبع الخلايا الفردية10. في الآونة الأخيرة، وصفت رواية ثابتة Z-الاتجاه (FiZD) طريقة تهدف إلى عالية الدقة confocal 3D الوقت الفاصل تصوير organoids الكلوية والثقافات organotypic11. في هذه الطريقة ، يتم ضغط الأعضاء والأعضاء الجنينية بلطف بين غطاء زجاجي وغشاء نفاذي لإدراج ترانسويل في لوحة مصممة خصيصًا حتى يصل سمك العينة إلى 70 ميكرومتر ، مما يوفر الظروف البصرية المثلى للتصوير. في الجزء الثاني من الأساليب ، يتم وصف بروتوكول مفصل لتصنيع لوحة مصممة خصيصًا وإعداد تجارب FiZD للتصوير المنجري على المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتتفق رعاية الحيوان وإجراءاته مع التشريعات الوطنية الفنلندية المتعلقة باستخدام الحيوانات المختبرية، والاتفاقية الأوروبية لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة لأغراض تجريبية وغيرها من الأغراض العلمية (ETS 123)، والتوجيه 86/609/الجماعة الاقتصادية الأوروبية الصادر عن الاتحاد الأوروبي.
1. تصنيع الخزانات الصغيرة لزراعة الكلى الجنينية الماوس وorganoids الكلى على CAM الدجاج وإقامة تجارب xenotransplant
- استخدام الخلايا transwell الثقافة إدراج مصممة ل6 جيدا أو 12 لوحات جيدا.
ملاحظة: اعتماداً على تجربة معينة، يمكن استخدام الخزانات الصغيرة الكبيرة أو الصغيرة. فمن الأفضل استخدام الخزانات الصغيرة لxenografting ما يصل إلى ثماني الكلى الجنينية أو عندما سيتم وضع العديد من الخزانات الصغيرة على نفس جنين الدجاج (على سبيل المثال، تجربة وعينات التحكم على CAM الدجاج نفسه). - خفض الجانبين من إدراج باستخدام أداة دوارة متعددة مع شفرة منشار دائري أو منشار اليد لإنشاء حلقة بلاستيكية عالية 2 مم مع غشاء نفاذي تعلق عليه.
- تلميع حواف هذه الخزانات الصغيرة مع مشرط أو سكين حادة.
- قم بتعقيم الخزانات الصغيرة في الإيثانول بنسبة 70% لمدة ساعة واحدة على الأقل.
- اغسل الخزانات الصغيرة في الماء المقطر المزدوج الأوتوكلاف واتركه يجف في غطاء لامنار.
- شطف الخزانات الصغيرة في برنامج تلفزيوني والمتوسطة الثقافة (ارتفاع الجلوكوز DMEM/10% FBS/1% البنسلين-العقديات).
- ضع الخزان في طبق بيتري ، على رأس قطرة (600 ميكرولتر / 400 ميكرولتر) من وسط الثقافة مع مواجهة الغشاء.
- ترتيب تشريح الكلى الجنينية الجسم ية أو الكلى بالتساوي على الغشاء بمساعدة ماصة أو أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجية. تجنب ترك الكثير من السائل حول الكلى.
- دع العينات تعلق على الغشاء لمدة 2-24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
ملاحظة: يمكن ترتيب ما يصل إلى ثمانية كلى فأرة جنينية أو عضوية في الكلى على الغرز الصغير. يوصى بإدراج كبير إذا كان سيتم استخدام قطع أكبر من الأنسجة الجنينية لزراعة xenoأو خليط الهيدروجيل الخلوي على مساحة أكبر من CAM. - اتخاذ 8 أيام من العمر السابقين ovo المستزرعة الدجاج الجنينية أعدت وفقا لأساليب نشرت سابقا من حاضنة ثقافة الخلية12,13.
- نقل الخزانات الصغيرة إلى CAM بحيث الطعوم تواجه CAM، وتراكب الغشاء لهم. وضع الخزانات الصغيرة في محيط CAM، بحيث أنها لا تغطي جنين الدجاج.
ملاحظة: عند استخدام الخزانات الصغيرة الصغيرة المصنعة من إدراج ترانسويل ل12 لوحات بئر، يمكن وضع ما يصل إلى ثلاثة خزانات صغيرة على كاميرا واحدة. - أضف 500 ميكرولتر (6 إدراج جيد) أو 300 ميكرولتر (12 إدراج جيد) من الثقافة المتوسطة إلى الخزانات الصغيرة.
- زراعة العينات على CAM الدجاج لمدة أقصاها 9 أيام. استبدال وسط الثقافة في الخزانات الصغيرة يوميا.
ملاحظة: يمكن ملاحظة الأوعية الدموية للعينات في أقرب وقت 24-48 ساعة بعد زرعها.
2. تصنيع لوحات مصممة خصيصا واقامة الثقافات FiZD
- حفر ثقوب قطرها 20 ملم في الجزء السفلي من لوحة بئر 6.
ملاحظة: بالنسبة لتجارب FiZD، استخدم 6 لوحات بئر ذات عمق جيد 16 مم (المحدد في جدول المواد). - البولندية الحافات من الثقوب (وخاصة على الجانب العلوي) باستخدام حفر الكهربائية مع بت الحفر countersink، مشرط، أو سكين حادة.
- قم بتعقيم الأطباق في الإيثانول بنسبة 70% لمدة ساعة واحدة على الأقل.
- غسل لوحات في الماء المقطر المزدوج الأوتوكلاف والسماح لهم الجافة في ظروف معقمة.
- غسل بدقة 22 ملم × 22 ملم المغطاة الزجاجية مع 70٪ الإيثانول أو تنظيفها وفقا للبروتوكول المنشور من قبل Saarela وآخرون11.
- الغراء coverslips إلى الجانب العلوي من الثقوب في 6 لوحات البئر باستخدام الغراء الأنسجة غير سامة. تطبيق الغراء حول الحفرة ووضع بلطف coverslip لتغطية ذلك. دع الغراء يجف.
- فحص لوحات تحت ستيريوميكرور وإزالة الغراء المجفف الزائد من سطح coverslips إذا لزم الأمر.
ملاحظة: تأكد من عدم وجود الغراء فوق قسيمة الغطاء لضمان ضغط حتى من العينات. - خلط حبات البوليسترين (70 ميكرومتر حجم الجسيمات) مع حجم متساو من الهيدروجيل. حجم 50-100 ميكرولتر لكل بئر كاف.
ملاحظة: الحفاظ على خليط من حبات الهيدروجيل والبوليسترين على الجليد. - وضع إدراج ترانسويل تحت المجهر تشريح مع الغشاء حتى.
- ترتيب العينات (على سبيل المثال، الكلى الجنينية على سبيل المثال أو الكلى الكلوية) بالتساوي على الغشاء.
- إضافة خليط خرز الهيدروجيل / البوليسترين بجانب العينات بعناية لتجنب الأضرار التي لحقت الأنسجة الهشة.
- الوجه إدراج transwell بحيث الغشاء مع العينات المجمعة على ذلك هو مواجهة أسفل.
- ضع الغرز برفق في بئر من لوحة 6 جيدة المعدلة واضغط بلطف عليه حتى يتم ضغط العينات إلى مستوى الخرز.
ملاحظة: اتبع تقدم الضغط باستخدام المجهر. - الحفاظ على إدراج الضغط قليلا إلى البئر مع يد واحدة وإصلاحه إلى لوحة عن طريق ذوبان البلاستيك مع الحديد لحام في ثلاث نقاط على هامش إدراج.
- عندما يتم إصلاح إدراج إلى لوحة، إضافة 2 مل من الثقافة المتوسطة (DMEM/10% FBS/1% البنسلين-streptomycin) إلى البئر والاستمرار في تجميع الآبار المتبقية في لوحة بنفس الطريقة.
- نقل اللوحة النهائية إلى حاضنة على خشبة المسرح من المجهر المقلوب للتصوير الفاصل الزمني.
- إجراء تصوير الفاصل الزمني للعينات باستخدام الإعدادات التجريبية المناسبة.
ملاحظة: تغيير الثقافة المتوسطة في آبار لوحة أثناء تجارب الفاصل الزمني غير مطلوب ولكن يمكن القيام به بسهولة من خلال الثقوب على جانبي إدراج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مكن بروتوكول الثقافة CAM المقدمة هنا الأوعية الدموية عالية الكفاءة من الأعضاء الكلوية والكلى الجنينية نتيجة لزراعة xenotransplant على CAM الدجاج(الشكل 1، الفيلم 1). الخزانات الصغيرة التي تحتوي على الاستزراع المتوسطة زودت الأنسجة المانحة بالمواد المغذية وحمتها من التجفيف خلال الفترة الزمنية السابقة للأوعية الدموية المناسبة. ووفرت هذه الطريقة شروطامتساهلة لنمو الخلايا البطانية المشتقة من الجهات المانحة. لذلك ، تم تمثيل الأوعية الدموية الكلوية في الكلى المزروعة والأعضاء في الغالب ، وإن لم يكن حصريًا ، من قبل خلايا خاصة بالمتبرعين(الشكل 2B،C،F). تم الحصول على الأوعية الدموية الكبيبة الأكثر نضجا في الكلى والأعضاء الكلوية المزروعة إلى CAM مما كانت عليه في الثقافات الكلوية organotypic(الشكل 2D،E).
بروتوكول FiZD هو طريقة مصممة لتصوير الهفوات الزمنية على المدى الطويل للكلى الجنينية على سبيل الفيفو والأعضاء الكلوية باستخدام المجهر المحوري عالي الدقة. في بروتوكول الثقافة organotypic الكلاسيكية التي صممها تروويل14، يتم وضع عينة على مرشح مسامية ، مدعومة بشبكة معدنية ، وتبقى في واجهة الهواء السائل(الشكل 3A). هذه الطريقة ليست مثالية سواء لنوع من المجاهر تستقيم أو مقلوبة. تم تصميم الطريقة المعروضة هنا خصيصًا لتعمل بمجهر مقلوب للتصوير. تم شل حركة العينة بين غطاء زجاجي من الأسفل وغشاء مسامي من إدراج المتحولين (انظر أعلاه)(الشكل 3B). كانت المسافة المثلى بين الغشاء وغطاء الغطاء حوالي 70 ميكرون. واستخدمت حبات البوليسترين كفواصل لتعيين سمك العينة في هذا النطاق(الشكل 3B).
لا توجد لوحات جيدة 6 متاحة تجاريًا حيث يقع غطاء الزجاج على السطح العلوي من الجزء السفلي من البئر. لذلك ، تم تطوير بروتوكول لتصنيع لوحات مصممة خصيصًا تحتوي على هذه الميزة(الشكل 3B). ويبين الشكل 4 المورفولوجيا التمثيلية لثقافة الكلى الجنينية(الشكل 4A،D-F)والاعضاء الكلوية(الشكل 4B،C). الفيلم 2 يمثل نتائج عالية الدقة الوقت الفاصل تصوير الخلايا الانثيلية في الكلى الجنينية الماوس المستزرعة في إعداد FiZD. توضح اللوحة اليمنى في Movie 2 أنه يمكن ملاحظة كل من توزيع الخلايا الفردية وترحيلها باستخدام هذا الأسلوب.
الشكل 1: الكلى الجنينية مورين xenotransplanted إلى CAM جنين الدجاج. Xenotransplant من E11.5 الكلى الجنينية الماوس في 8 أيام من العمر جنين الدجاج أوفو السابقين; وزرعت الكلى الجنينية المورين لمدة 7 أيام على CAM. شريط مقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1: تدفق الدم في الكلى الجنينية المورين بعد xenotransplant إلى CAM جنين الدجاج. تم زرع الكلى الجنينية المورينE11.5 xenoed إلى CAM من جنين الدجاج البالغ من العمر 8 أيام ومثقف لمدة 7 أيام. يُظهر الفيلم تدفق دم الدجاج في xenograft في اليوم السابع. يرجى الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الشكل 2: زرع الكلى الجنينية مورين على CAM جنين الدجاج. تم زراعة الكلى الجنينية (م) من المورين كثقافة أمكانية (أي التحكم) أو زرعها إلى CAM دجاج جنيني عمره 8 أيام (ج) (أي التجربة). بعد 5 أيام من زراعة الكلى الجنينية ، تم إصلاح عينات التحكم والعينات التجريبية وملطخة بعلامة النُهُث النَّفَيّة CD31 (أحمر)(A-E)والنوى (Hoechst; الأزرق)(D, E). (C)Anastomoses بين الأوعية الدموية الدجاج والفأر (رؤوس الأسهم). (D,E) تظهر شريحة بؤرية واحدة من منتصف الكلية. (F)Xenotransplant من الكلى الجنينية المورين E11.5 إلى المعدلة وراثيا GFP الدجاج CAM لمدة 7 أيام، ملطخة لCD-31 (أحمر). أشرطة المقياس = A-B 100 ميكرومتر; جيم-هـ 20 ميكرومتر؛ F 50 μm. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: طريقة الثقافة الثابتة لـ Z-الاتجاه. (أ)طريقة الثقافة التقليدية حيث تنمو العينة على غشاء مسامية تدعمها شبكة وعقد explant في واجهة الهواء السائل. (ب)في الإعداد FiZD الجديد ، تم ضغط العينة بلطف بين غطاء الزجاج وغشاء مسامي ة عبر. سيطر حبات البوليستر على سماكة العينة المعدلة في اتجاه z. وقد عُدِّل هذا الرقم من صحيفة "سارلا وآخرون11". يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكلى الجنينية وتطور الأعضاء الكلوية في طريقة الاستزراع الجديدة في FiZD. تم زراعة الكلى الجنينية(A, D-F)والأعضاء الكلوية(B-C)باستخدام إعداد FiZD الجديد. (أ)صورة برايتفيلد من الكلى الجنينية الجنينية سليمة في اليوم 7 من ثقافة FiZD. (ب)صورة برايتفيلد من عضوية الكلى الماوس في اليوم 7 من ثقافة FiZD. (C)تم زراعة MtmG (الأحمر) الجهازية الكلى الماوس لمدة 4 أيام باستخدام الإعداد FiZD الجديد. لقطة من كومة الصور الفاصل الزمني يظهر التعبير GFP (الأخضر) المنشط Wnt4Creفي الكلى النامية. (D)تم زراعة الكلى الجنينية الماوس لمدة 7 أيام باستخدام الإعداد FiZD جديدة. وأظهرت Six2 (الأخضر) وTroma-1 (Krt8، الأحمر) تلطيخ السلائف الكليفرون وبراعم الإحليل (UB) التشعبات، على التوالي. (E)تم استزراع بدائيات الكلى الجنينية الماوس لمدة 12 يوما باستخدام الإعداد FiZD جديدة. كانت ملطخة مع Troma-1 (الأحمر) ونفرين (الأخضر)، وأظهرت التشعبات UB والخلايا podocytes، على التوالي. (و)نفس العينة كما هو الحال في(E)مع التكبير عالية الطاقة من Troma-1 + (الأحمر) UB ونفرين (الأخضر) + podocytes. وقد عُدِّل هذا الرقم من صحيفة "سارلا وآخرون11". أشرطة المقياس = A-D، F 100 ميكرومتر؛ E 1000 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 2: الخلايا الكلائية الكلية وصفت مع GFP تنمو في الإعداد FiZD الجديدة ويمكن ملاحظتها مع المجهر confocal عالية الدقة. الكلى الجنينية من E11.5 mTmG; تم تشريح الفئران Tie1Cre ونمت 6 أيام باستخدام الإعداد FiZD الجديد. الفيلم يظهر Tie1Cre- المستحثة التعبير GFP في الخلايا الانهوثيلية. تم التقاط كومة من 20 طبقة z باستخدام هدف 10x/0.45 ، مع الصور التي يتم الحصول عليها كل 15 دقيقة. في الفيلم، يتم دمج خمس طبقات Z GFP ومستوى تنسيق حقل مشرق. تظهر اللوحة على اليمين صورة مقربة لكلية نامية. يمكن رؤية الخلايا الانهوفية المهاجرة إلى المشقوق الوعائي من الكلى المرحلة على شكل S. في اللوحة على اليمين، يتم دمج GFP z-layer ومستوى تنسيق حقل مشرق. الخلايا تتحرك بسرعة هي الضامة على الأرجح15. كما تم التعبير عن إشارة GFP من قبل بعض خلايا الدم. حجم فوكسل 0.69 ميكرومتر × 0.69 ميكرومتر × 4.13 ميكرومتر. تم تعديل هذا الفيلم من Saarela وآخرون11. يرجى الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تقديم بروتوكولين مفصلين يصقلان طريقة الثقافة الكلوية الكلاسيكية، ويمكّنان من الأوعية الدموية، والتنمية الموسعة، والتصوير الأمثل 4D (أي الصورة والوقت ثلاثي الأبعاد) للكلى الجنينية الجنينية العضوية. يسلط هذا القسم الضوء على الخطوات الهامة في الأساليب ويناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
الفرق الكبير بين أساليب الثقافة CAM الأخرى وهذا تحسين أسلوب ثقافة CAM الدجاج هو استخدام minireservoirs مصنوعة خصيصا في xenografting من الكلى الجنينية والأعضاء الكلوية إلى CAM. الجزء السفلي من الغشاء إدراج ترانسهاويل المعدلة يضغط على العينات ضد CAM الدجاج ويبقيها في مكانها. تعمل جوانب الإدراج كخزان لوسط الثقافة الذي يحمي الكسب غير المشروع من التجفيف. Xenografting لex ovo المستزرعة الدجاج الجنينية CAM ينصح بشدة، كما هذه الطريقة يكشف مساحة أكبر من CAM حيث يمكن وضع minireservoir ويجعل من السهل أن تتبع بصريا عملية الأوعية الدموية12،13.
عيب من الدجاج CAM طريقة الثقافة هو أن الفترة الزمنية لإجراء xenotransplant يقتصر على 8-9 أيام عندما CAM من وظائف جنين الدجاج قبل أن يبدأ تدهور. لذلك يجب أن يتم زرع الطعوم التي تحتاج إلى وقت أطول لتطويرالأوعية الدموية عن طريق زرع الأعضاء إلى نسيج مختلف (على سبيل المثال، كبسولة الكلى الماوس)6. قد يكون زرع الأنسجة المتعددة المتسلسل ة حلاً لهذه المشكلة الطويلة في وقت الحضانة. يمكن تكييف هذه الطريقة لتصوير الأوعية الدموية وتطوير الترقيع ، ولكن أولاً يجب معالجة متطلبات تثبيت الخزان الصغير وCAM للتصوير على المدى الطويل. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول الكلى المحسن ة زرع الكه الدجاج CAM هو أن الأسلوب يوفر الظروف للخلايا الانبائية المستمدة من المانح لتزدهر.
يصف بروتوكول FiZD طريقة مصممة لتصوير الكلى الجنينية على المدى الطويل من الكلى الجنينية والأعضاء الكلوية باستخدام المجهر المحوري عالي الدقة. لإعداد من المهم أن أبعاد البئر وإدراج المباراة. عندما يتم لصقها على غطاء إلى الجزء السفلي من لوحة بئر 6 ويتم وضع إدراج على البئر، وينبغي أن غشاء إدراج لمس الزجاج. ثم، عندما يتم إعداد الثقافة، فإن الخرز فاصل تحديد موقف الغشاء وبالتالي سمك الجهاز أو الجهاز المستزرع. لهذا السبب، فمن الأهمية بمكان لإزالة الغراء الزائد والتحقق من أن أي مادة تقيد إدراج من لمس الزجاج الغطاء. من المهم أيضا استخدام الغراء الأنسجة غير سامة لإرفاق الزجاج الغطاء. يرجى ملاحظة أن الغراء لا نعلق بقوة جدا، لذلك فمن الأهمية بمكان للتعامل مع لوحات بعناية. يمكن إعادة استخدام اللوحات ، وإذا انفصل زجاج الغطاء أثناء خطوات الغسيل ، يمكن لصقها مرة أخرى.
تسمح طريقة التصوير FiZD بدراسة تكوين الكلية على مستوى الخلية الواحدة. جودة عالية من الصور عالية الدقة الفاصل الزمني يسمح بتطبيق تجزئة الخلايا الآلية لدراسة السلوك الخلوي في الاعضاء الكلوية وثقافات الكلى. يمكن دراسة العديد من العينات الموجودة في آبار مختلفة من لوحة بئر 6 في وقت واحد في ظروف ثقافية مختلفة. ويمكن تعديل هذه التقنية بسهولة لأحجام وأنواع مختلفة من الأنسجة وorganoids عن طريق تغيير حجم الخرز فاصل. وقد ثبت هذا مع ثقافات خلايا المبيض14. كتحسين آخر لهذه الطريقة ، والجمع بين الإعداد FiZD مع النهج الدقيقة المائعة التي نشرت مؤخرا16 قد تكون مفيدة للغاية لتحليل عالية الدقة المجهرية للمورفتكوين الخلوي في مراحل لاحقة من تطور الكلى.
ميزة واحدة من طريقة FiZD هو أن هناك الكثير من الثقافة المتوسطة المتاحة وليس من الضروري تغييره خلال أسبوع واحد من التصوير. ومع ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى تغيير الوسائط ، يمكن بسهولة تغيير الوسط من فتحة في جدار الإدراج. طريقة FiZD هي أيضا متفوقة على غيرها من أساليب ثقافة الجهاز في أنه يجعل العينة أقرب إلى الهدف المجهر. في غيرها من أساليب الثقافة المستخدمة على نطاق واسع هناك غشاء أو مرشح وقاع لوحة زجاجية بين العينة المصوّروالهدف والهدف، مما يحظر دقة التصوير عالي الدقة17. مع طريقة FiZD من الممكن الحصول على صور عالية الدقة من الأنسجة الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل ماليا ً أكاديمية سومن أكاتيميا (أكاديمية فنلندا) (206038، 121647، 250900، 260056؛ منحة مركز التميز 2012-2017 251314)، Munuaissäätiö - جمعية الكلى والكبد الفنلندية، سيغريد جوليوكسن ساتيو، فيكتورياستفيلسن، المؤسسة الثقافية السويدية في فنلندا، نوفو نورديسك، Syöpäjärjestöt (جمعية السرطان في فنلندا)، وبرنامج الإطار السابع للجماعة الأوروبية (FP7/2007-2013؛ منحة FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608)، وH2020 ماري Sklodowska-Curie إجراءات شبكة التدريب المبتكر "RENALTRACT" مشروع ID 642937. ويشكر المؤلفون بولا هيبوس ويوهانا كيكولاهتي - ليياس وهانيل هرمان على المساعدة التقنية.
تتم إعادة طباعة الأرقام 3 و 4 و الفيلم 2 بإذن من التطوير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
